JP2634193B2 - ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現 - Google Patents
ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉをコードす
る配列から構成される新規な組換えDNA配列、これらのD
NA配列を含有するクローニングおよび発現ベクター、こ
れらの発現ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに
新規な組換えDNA配列、ベクターおよび形質転換体を用
いてヒトプロアポリポタンパク質を製造する方法に関す
る。
る配列から構成される新規な組換えDNA配列、これらのD
NA配列を含有するクローニングおよび発現ベクター、こ
れらの発現ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに
新規な組換えDNA配列、ベクターおよび形質転換体を用
いてヒトプロアポリポタンパク質を製造する方法に関す
る。
発明の背景 ヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）は
高密度リポタンパク質（HDL）およびリンパカイロミク
ロンの主要タンパク質構成成分である。肝臓および小腸
がアポタンパク質合成の一次部位である。これらの臓器
ではアポＡ−Ｉはプレカーサータンパク質（プレプロア
ポＡ−Ｉ）として合成される。このペプチドの共翻訳切
断が細胞内で起こり、プロアポＡ−Ｉが血漿およびリン
パ中に分泌される。
高密度リポタンパク質（HDL）およびリンパカイロミク
ロンの主要タンパク質構成成分である。肝臓および小腸
がアポタンパク質合成の一次部位である。これらの臓器
ではアポＡ−Ｉはプレカーサータンパク質（プレプロア
ポＡ−Ｉ）として合成される。このペプチドの共翻訳切
断が細胞内で起こり、プロアポＡ−Ｉが血漿およびリン
パ中に分泌される。
プロアポＡ−ＩはアポＡ−Ｉのアミノ末端に付着した
さらに６個のアミノ酸（Arg−His−Phe−Trp−Gln−Gl
n）を有する。血管空隙に達するとプロアポＡ−Ｉは特
異的なタンパク質分解酵素（アポＡ−Ｉプロペプチダー
ゼ）によつてin vivoで切断され、成熟アポＡ−Ｉを生
成する。
さらに６個のアミノ酸（Arg−His−Phe−Trp−Gln−Gl
n）を有する。血管空隙に達するとプロアポＡ−Ｉは特
異的なタンパク質分解酵素（アポＡ−Ｉプロペプチダー
ゼ）によつてin vivoで切断され、成熟アポＡ−Ｉを生
成する。
成熟アポＡ−Ｉは単一のグリコシル化されていないポ
リペプチドであり、243個のアミノ酸残基からなる配列
が知られている（H.B.Brewerほか:Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,80:623−630,1978）。これは血漿酵素レシチ
ン、コレステロールアシルトランスフエラーゼの補因子
として働き、血漿中における大部分のコレステロールエ
ステルの生成に関係している。アポリポタンパク質構成
または生合成の欠陥は血漿リピド輸送系の異常を生じ、
冠動脈疾患の発症を招く。血漿中のアポＡ−ＩおよびHD
Lレベルの低下は、心臓発作（心筋梗塞）および他の動
脈硬化性血管疾患の強力な危険因子であることが明らか
にされている。すなわち、アポＡ−Ｉをコードする遺伝
子の突然変異は、HDLレベルの低下および冠動脈疾患の
早発を伴う。アポＡ−ＩおよびHDLは末梢組織（動脈）
から肝臓へ、体外への排泄のためのコレステロール輸送
（いわゆる逆コレステロール輸送）を分担している主要
な血漿成分である。動脈へのコレステロールの蓄積は、
動脈硬化の特質であり最も重要な過程であるから、アポ
Ａ−Ｉの供給による逆コレステロール輸送の刺激は動脈
硬化過程を遅延または逆転させ、したがつて心臓発作の
発現率を低下させることができる。
リペプチドであり、243個のアミノ酸残基からなる配列
が知られている（H.B.Brewerほか:Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,80:623−630,1978）。これは血漿酵素レシチ
ン、コレステロールアシルトランスフエラーゼの補因子
として働き、血漿中における大部分のコレステロールエ
ステルの生成に関係している。アポリポタンパク質構成
または生合成の欠陥は血漿リピド輸送系の異常を生じ、
冠動脈疾患の発症を招く。血漿中のアポＡ−ＩおよびHD
Lレベルの低下は、心臓発作（心筋梗塞）および他の動
脈硬化性血管疾患の強力な危険因子であることが明らか
にされている。すなわち、アポＡ−Ｉをコードする遺伝
子の突然変異は、HDLレベルの低下および冠動脈疾患の
早発を伴う。アポＡ−ＩおよびHDLは末梢組織（動脈）
から肝臓へ、体外への排泄のためのコレステロール輸送
（いわゆる逆コレステロール輸送）を分担している主要
な血漿成分である。動脈へのコレステロールの蓄積は、
動脈硬化の特質であり最も重要な過程であるから、アポ
Ａ−Ｉの供給による逆コレステロール輸送の刺激は動脈
硬化過程を遅延または逆転させ、したがつて心臓発作の
発現率を低下させることができる。
プロアポＡ−ＩのアポＡ−Ｉへの成熟は、血液中にお
ける滞留時間12時間未満内に定量的に細胞外で起こる。
プロアポＡ−Ｉは、唯一ではないとしても、成熟アポＡ
−Ｉへの主要なプレカーサーであるので、たとえば先天
性または後天性欠損によつてHDLレベルが低下したとき
は常に、置換療法に使用することが可能である。アポＡ
−Ｉの一般的な治療的有用性のために、研究者達によつ
てアポＡ−Ｉを大量に生産する方法が探求されてきたの
である。古くは、血漿からのアポＡ−Ｉの精製が行われ
ていた。また、プレプロアポＡ−Ｉをコードする相補的
DNAをよく知られた遺伝子操作技術によつて取得できる
ことがいくつかの文献に示されている（P.Cheung ＆ L.
Chan:Nucleic Acide Res.11:3703−3715,1983:J.J.Seil
hamerほか:DAN,３:309−317,1984および日本特許出願第
96998/86号）。R.Lorenzettiら（FEBS Lett.194:343−3
46,1986）はE.coli中、β−ガラクトシダーゼとの切断
不能の融合タンパク質としてアポＡ−Ｉを発現できるこ
とを明らかにしている。しかしながら、成熟アポＡ−Ｉ
を非融合タンパク質として発現させる試みは成功してい
ない。
ける滞留時間12時間未満内に定量的に細胞外で起こる。
プロアポＡ−Ｉは、唯一ではないとしても、成熟アポＡ
−Ｉへの主要なプレカーサーであるので、たとえば先天
性または後天性欠損によつてHDLレベルが低下したとき
は常に、置換療法に使用することが可能である。アポＡ
−Ｉの一般的な治療的有用性のために、研究者達によつ
てアポＡ−Ｉを大量に生産する方法が探求されてきたの
である。古くは、血漿からのアポＡ−Ｉの精製が行われ
ていた。また、プレプロアポＡ−Ｉをコードする相補的
DNAをよく知られた遺伝子操作技術によつて取得できる
ことがいくつかの文献に示されている（P.Cheung ＆ L.
Chan:Nucleic Acide Res.11:3703−3715,1983:J.J.Seil
hamerほか:DAN,３:309−317,1984および日本特許出願第
96998/86号）。R.Lorenzettiら（FEBS Lett.194:343−3
46,1986）はE.coli中、β−ガラクトシダーゼとの切断
不能の融合タンパク質としてアポＡ−Ｉを発現できるこ
とを明らかにしている。しかしながら、成熟アポＡ−Ｉ
を非融合タンパク質として発現させる試みは成功してい
ない。
上述の日本特許特許出願第96998/86号には、アポＡ−
Ｉ構造遺伝子をtacプロモーターの制御下に含有するプ
ロスミドPHAIE−Ｉで形質転換したE.coli中におけるヒ
トアポリポタンパク質Ａ−Ｉ様タンパク質の発現が記載
されている。しかしながら、構造遺伝子は完全ではな
く、ATG翻訳開始コドンに続くアミノ酸＋４〜＋243のコ
ドンから構成されている。その結果、得られた発現生成
物はＮ末端メチオニンを含有し（ATGコドンに相当す
る）、治療に使用した場合に副次的作用を生じる可能性
が考えられる。J.B.Malloryら（J.Biol.Chem.262:4241
〜4247,1987;PCT国際特許出願WO86/04920およびWO87/02
062）には、チヤイニーズハムスター卵巣細胞中におけ
る（動物細胞培養）ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの発
現が開示されている。用いる構築体は全ヒトプレプロア
ポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子を含有しているが、分泌
されるアポＡ−Ｉタンパク質のわずか５〜10％がプロア
ポＡ−Ｉであり、残部は成熟アポＡ−Ｉタンパク質であ
ることから、チヤイニーズハムスター卵巣細胞はプロア
ポ型を処理して成熟アポ型にするものと思われる。この
系の産生能は比較的低く、0.55×106個の細胞が24時間
中にわずか25〜30μg/mlのアポＡ−Ｉを分泌するにすぎ
ない。PCT国際特許出願WO87/02062には、一部の実施例
で、他の宿主たとえばE.coli（細胞宿主）およびS.cere
visiae（酵母）におけるヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
の発現が記載されている。しかしながら、使用された構
築体はプロアポ型に関する遺伝情報を含んでおらず、得
られたタンパク質はヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
ではない。
Ｉ構造遺伝子をtacプロモーターの制御下に含有するプ
ロスミドPHAIE−Ｉで形質転換したE.coli中におけるヒ
トアポリポタンパク質Ａ−Ｉ様タンパク質の発現が記載
されている。しかしながら、構造遺伝子は完全ではな
く、ATG翻訳開始コドンに続くアミノ酸＋４〜＋243のコ
ドンから構成されている。その結果、得られた発現生成
物はＮ末端メチオニンを含有し（ATGコドンに相当す
る）、治療に使用した場合に副次的作用を生じる可能性
が考えられる。J.B.Malloryら（J.Biol.Chem.262:4241
〜4247,1987;PCT国際特許出願WO86/04920およびWO87/02
062）には、チヤイニーズハムスター卵巣細胞中におけ
る（動物細胞培養）ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの発
現が開示されている。用いる構築体は全ヒトプレプロア
ポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子を含有しているが、分泌
されるアポＡ−Ｉタンパク質のわずか５〜10％がプロア
ポＡ−Ｉであり、残部は成熟アポＡ−Ｉタンパク質であ
ることから、チヤイニーズハムスター卵巣細胞はプロア
ポ型を処理して成熟アポ型にするものと思われる。この
系の産生能は比較的低く、0.55×106個の細胞が24時間
中にわずか25〜30μg/mlのアポＡ−Ｉを分泌するにすぎ
ない。PCT国際特許出願WO87/02062には、一部の実施例
で、他の宿主たとえばE.coli（細胞宿主）およびS.cere
visiae（酵母）におけるヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
の発現が記載されている。しかしながら、使用された構
築体はプロアポ型に関する遺伝情報を含んでおらず、得
られたタンパク質はヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
ではない。
発明の要約 本発明は、組換えDNA技術によつてヒトプロアポリポ
タンパク質Ａ−Ｉ、すなわち特異的タンパク分解アポＡ
−Ｉプロペプチダーゼ酵素によつて切断されやすい成熟
プロアポＡ−Ｉタンパク質を製造する手段および方法を
意図するものである。本明細書において用いられる「成
熟」の語は、ヒトプロアポＡ−Ｉ自体を意味するが、同
時に、その発現ベクター構造中におけるATG翻訳開始コ
ドンのために存在する最初のアミノ酸としてメチオニン
が先行する相当するタンパク質をも包含する。本発明
は、ヒトプロアポＡ−ＩをコードするDNA配列からなる
クローニングおよび発現ベクターの構築に関する。この
ベクターは増幅が可能で、したがつて成熟ヒトプロアポ
Ａ−Ｉタンパク質、ならびにそのMet−，融合、シグナ
ルＮ末端抱合体の発現が可能である。同様に、本発明
は、このようなベクターを含有することによつて遺伝子
が変化し、ヒトプロアポＡ−Ｉポリペプチドを産生でき
る生存細胞培養物または微生物に関する。さらに、本発
明は、天然環境または原料中に存在するまたはそれから
単離される状態とは異なる物理的状態におけるヒトプロ
アポＡ−Ｉを提供する。本発明における製造方法によれ
ば、ヒトプロアポＡ−Ｉは通常の内因性タンパク質およ
び他の天然物質を含まない。本発明は、ヒトプロアポＡ
−Ｉの組換えDNAによる製造のすべての態様を意図する
ものであつて、これは本明細書に記載された特定の細部
によつて限定されるものではなく、本発明の範囲に包含
される。
タンパク質Ａ−Ｉ、すなわち特異的タンパク分解アポＡ
−Ｉプロペプチダーゼ酵素によつて切断されやすい成熟
プロアポＡ−Ｉタンパク質を製造する手段および方法を
意図するものである。本明細書において用いられる「成
熟」の語は、ヒトプロアポＡ−Ｉ自体を意味するが、同
時に、その発現ベクター構造中におけるATG翻訳開始コ
ドンのために存在する最初のアミノ酸としてメチオニン
が先行する相当するタンパク質をも包含する。本発明
は、ヒトプロアポＡ−ＩをコードするDNA配列からなる
クローニングおよび発現ベクターの構築に関する。この
ベクターは増幅が可能で、したがつて成熟ヒトプロアポ
Ａ−Ｉタンパク質、ならびにそのMet−，融合、シグナ
ルＮ末端抱合体の発現が可能である。同様に、本発明
は、このようなベクターを含有することによつて遺伝子
が変化し、ヒトプロアポＡ−Ｉポリペプチドを産生でき
る生存細胞培養物または微生物に関する。さらに、本発
明は、天然環境または原料中に存在するまたはそれから
単離される状態とは異なる物理的状態におけるヒトプロ
アポＡ−Ｉを提供する。本発明における製造方法によれ
ば、ヒトプロアポＡ−Ｉは通常の内因性タンパク質およ
び他の天然物質を含まない。本発明は、ヒトプロアポＡ
−Ｉの組換えDNAによる製造のすべての態様を意図する
ものであつて、これは本明細書に記載された特定の細部
によつて限定されるものではなく、本発明の範囲に包含
される。
本発明の基本的態様の一つは成熟ヒトプロアポＡ−Ｉ
から構成されるまたはそれを含有し、したがつてアポＡ
−Ｉプロペプチダーゼのタンパク分解作用によつて成熟
ヒトマポＡ−Ｉにin vitroおよびin vivoで変換できる
タンパク質の製造である。治療の目的には、ヒトプロア
ポＡ−Ｉ生成物をそのまま使用することもできるし、ま
たメチオニン残基の存在が医薬的に許容されるものであ
ればMet−プロアポＡ−Ｉも使用できる。これらの生成
物は血流中において、天然のプロペプチダーゼにより自
然に効率的に変換されて成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成でき
るからである。所望により、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物
は、Ｎ−末端メチオニンを処理できる、すなわちアミノ
末端メチオニンを欠く型のヒトプロアポＡ−Ｉ生成物を
産生できる選ばれた微生物または培養細胞中で製造する
こともできる。また、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物は、そ
れがアミノ末端メチオニン残基をもつかもたないかとは
関係なくin vitroで切断して、治療目的に使用できる成
熟ヒトアポＡ−Ｉを得ることも可能である。これは融合
およびシグナルＮ末端抱合体についてもいえる。切断す
ればＮ末端メチオニンを欠く標準ヒトアポＡ−Ｉが生成
する。
から構成されるまたはそれを含有し、したがつてアポＡ
−Ｉプロペプチダーゼのタンパク分解作用によつて成熟
ヒトマポＡ−Ｉにin vitroおよびin vivoで変換できる
タンパク質の製造である。治療の目的には、ヒトプロア
ポＡ−Ｉ生成物をそのまま使用することもできるし、ま
たメチオニン残基の存在が医薬的に許容されるものであ
ればMet−プロアポＡ−Ｉも使用できる。これらの生成
物は血流中において、天然のプロペプチダーゼにより自
然に効率的に変換されて成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成でき
るからである。所望により、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物
は、Ｎ−末端メチオニンを処理できる、すなわちアミノ
末端メチオニンを欠く型のヒトプロアポＡ−Ｉ生成物を
産生できる選ばれた微生物または培養細胞中で製造する
こともできる。また、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物は、そ
れがアミノ末端メチオニン残基をもつかもたないかとは
関係なくin vitroで切断して、治療目的に使用できる成
熟ヒトアポＡ−Ｉを得ることも可能である。これは融合
およびシグナルＮ末端抱合体についてもいえる。切断す
ればＮ末端メチオニンを欠く標準ヒトアポＡ−Ｉが生成
する。
本発明の第二の重要な態様は、ヒトプロアポＡ−Ｉ分
子の少なくとも一部についての修飾された暗号配列の使
用である。この修飾された暗号配列はヘアピン形成を低
減あるいは防止することにより翻訳効率を改善する。Lo
renzettiら（FEBS Lett.194:343〜346）が非融合成熟ア
ポＡ−Ｉタンパク質の発現を検知できなかつたのは、多
分、そのDNA構築体がヘアピン構造をかなり形成しやす
く、その結果、発現の効率が著しく悪かつたことによる
と考えられる。本発明者らは、ヒトプロアポＡ−Ｉのア
ミノ酸−６〜＋14の暗号配列中の数個のコドンを適当に
修飾することによつて、驚くべきことに効率的な発現が
保証されることを発現し、本発明を完成した。本明細書
において用いられる「適当な修飾」の語は一部の天然コ
ドンを別のコドンすなわち遺伝子コードに従い同一のア
ミノ酸を表すコドンに置換すること、さらにその修飾が
同時にヘアピン生成の低減または防止さえももたらすこ
とを意味する。DNA配列の修飾がプロペプチダーゼ切断
部位の性質に影響を与えず、プロペプチダーゼによつて
認識されるアミノ酸配列が構造中に保持されていること
がこの場合重要である。
子の少なくとも一部についての修飾された暗号配列の使
用である。この修飾された暗号配列はヘアピン形成を低
減あるいは防止することにより翻訳効率を改善する。Lo
renzettiら（FEBS Lett.194:343〜346）が非融合成熟ア
ポＡ−Ｉタンパク質の発現を検知できなかつたのは、多
分、そのDNA構築体がヘアピン構造をかなり形成しやす
く、その結果、発現の効率が著しく悪かつたことによる
と考えられる。本発明者らは、ヒトプロアポＡ−Ｉのア
ミノ酸−６〜＋14の暗号配列中の数個のコドンを適当に
修飾することによつて、驚くべきことに効率的な発現が
保証されることを発現し、本発明を完成した。本明細書
において用いられる「適当な修飾」の語は一部の天然コ
ドンを別のコドンすなわち遺伝子コードに従い同一のア
ミノ酸を表すコドンに置換すること、さらにその修飾が
同時にヘアピン生成の低減または防止さえももたらすこ
とを意味する。DNA配列の修飾がプロペプチダーゼ切断
部位の性質に影響を与えず、プロペプチダーゼによつて
認識されるアミノ酸配列が構造中に保持されていること
がこの場合重要である。
タンパク質レベルにおいては、本発明は、遺伝子を変
化させた細胞の培養物または微生物の生成物であるヒト
プロアポＡ−Ｉに関する。このヒトプロアポＡ−Ｉは成
熟プロアポＡ−Ｉの形でも、メチオニン残基が前につい
ている成熟プロアポＡ−Ｉの形でも、融合タンパク質た
とえば融合β−ガラクトシダーゼ−プロアポＡ−Ｉタン
パク質の形でも、またプレプロアポＡ−Ｉ生成物の形で
あつてもよい。生成物は通常の内因性タンパク質または
この関係タンパク質の天然原料（血漿）に共通する他の
天然物質を実質的に含まないものである。この製造に使
用される細胞培養物または微生物は特定の細胞系および
生物に限定されるものではなく、原核生物および真核生
物細胞の両者が、動物およびヒト細胞系を含めて利用で
きる。全く例示のみの目的で、本明細書においては、E.
coliバクテリア（原核生物細胞の代表として）および酵
母Saccharomyces cerevisiaeならびにバクロウイルス感
染昆虫細胞（真核生物細胞の代表として）における発現
を例示する。
化させた細胞の培養物または微生物の生成物であるヒト
プロアポＡ−Ｉに関する。このヒトプロアポＡ−Ｉは成
熟プロアポＡ−Ｉの形でも、メチオニン残基が前につい
ている成熟プロアポＡ−Ｉの形でも、融合タンパク質た
とえば融合β−ガラクトシダーゼ−プロアポＡ−Ｉタン
パク質の形でも、またプレプロアポＡ−Ｉ生成物の形で
あつてもよい。生成物は通常の内因性タンパク質または
この関係タンパク質の天然原料（血漿）に共通する他の
天然物質を実質的に含まないものである。この製造に使
用される細胞培養物または微生物は特定の細胞系および
生物に限定されるものではなく、原核生物および真核生
物細胞の両者が、動物およびヒト細胞系を含めて利用で
きる。全く例示のみの目的で、本明細書においては、E.
coliバクテリア（原核生物細胞の代表として）および酵
母Saccharomyces cerevisiaeならびにバクロウイルス感
染昆虫細胞（真核生物細胞の代表として）における発現
を例示する。
タンパク質レベルでは、本発明はまた、上記ヒトプロ
アポＡ−ＩのＡ−Ｉプロペプチダーゼ処理により得られ
るヒトアポＡ−Ｉに関する。このヒトアポＡ−Ｉは成熟
ヒトアポＡ−Ｉの標準型と同一で、アミノ末端メチオニ
ン残基を欠くものである。
アポＡ−ＩのＡ−Ｉプロペプチダーゼ処理により得られ
るヒトアポＡ−Ｉに関する。このヒトアポＡ−Ｉは成熟
ヒトアポＡ−Ｉの標準型と同一で、アミノ末端メチオニ
ン残基を欠くものである。
使用のレベルにおいては、本発明は上記ヒトプロアポ
Ａ−Ｉおよび／または上記ヒトアポＡ−Ｉ、およびさら
に少なくとも１種の医薬的に許容される担体、溶媒、希
釈剤または賦形剤を投与経路および医薬組成物の処方に
関する通信の配慮によつて適当に選択して含有する医薬
組成物に関する。
Ａ−Ｉおよび／または上記ヒトアポＡ−Ｉ、およびさら
に少なくとも１種の医薬的に許容される担体、溶媒、希
釈剤または賦形剤を投与経路および医薬組成物の処方に
関する通信の配慮によつて適当に選択して含有する医薬
組成物に関する。
DNAレベルにおいては、本発明は、ヒトプロアポＡ−
Ｉをコードする配列において、天然暗号配列の一部が同
じアミノ酸をコードするがヘアピンの形成を低減または
防止するように異なるヌクレオチド配列で置換された組
換えDNA配列に関する。とくに好ましい態様において
は、プロアポＡ−Ｉのアミノ酸−６から＋14までをコー
ドする天然配列が、次の配列（一本鎖のみを示す） ５′−ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTG
GGATAGAGTTAAGGACTTG−３′ で置換されている。この配列は、添加されたATG翻訳開
始コドンならびにアミノ酸残基−6,−1,＋1,＋3,＋4,＋
5,＋6,＋7,＋10,＋11および＋14の修飾コドンからな
る。
Ｉをコードする配列において、天然暗号配列の一部が同
じアミノ酸をコードするがヘアピンの形成を低減または
防止するように異なるヌクレオチド配列で置換された組
換えDNA配列に関する。とくに好ましい態様において
は、プロアポＡ−Ｉのアミノ酸−６から＋14までをコー
ドする天然配列が、次の配列（一本鎖のみを示す） ５′−ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTG
GGATAGAGTTAAGGACTTG−３′ で置換されている。この配列は、添加されたATG翻訳開
始コドンならびにアミノ酸残基−6,−1,＋1,＋3,＋4,＋
5,＋6,＋7,＋10,＋11および＋14の修飾コドンからな
る。
DNAレベルにおいては、本発明はまた、ヒトプロアポ
Ａ−Ｉをコードする上述の組換えDNAからなる複製可能
なクローニングまたベクターおよび発現ベクターに関す
る。本発明はとくに、以下にその構造を記述する組換え
プラスミドpULB9291,pULB9292,pULB9296,pULB9299,pNIV
1612およびpNIV1613に関する。はじめに挙げたプラスミ
ドpULB9291およびpULB9292は、修飾プロアポＡ−Ｉ構造
遺伝子と、その前部にATGコドンを含有し、フアージラ
ムダPLプロモーターの制御下にある。これらのプラスミ
ドは、E.coliに適当な発現ベクターであり、プロペプチ
ダーゼで切断されて標準成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成でき
るヒトプロアポＡ−Ｉの合成を意図するものである。プ
ラスミドpULB9296はE.coli中に導入した場合、β−ガラ
クトシダーゼとヒトプロアポＡ−Ｉからなる融合タンパ
ク質を、E.coli lacプロモーター領域の制御下に発現す
るものである。融合生成物はなおプロペプチダーゼ切断
部位を含有するので、切断されて標準成熟ヒトアポＡ−
Ｉを生成することが可能である。
Ａ−Ｉをコードする上述の組換えDNAからなる複製可能
なクローニングまたベクターおよび発現ベクターに関す
る。本発明はとくに、以下にその構造を記述する組換え
プラスミドpULB9291,pULB9292,pULB9296,pULB9299,pNIV
1612およびpNIV1613に関する。はじめに挙げたプラスミ
ドpULB9291およびpULB9292は、修飾プロアポＡ−Ｉ構造
遺伝子と、その前部にATGコドンを含有し、フアージラ
ムダPLプロモーターの制御下にある。これらのプラスミ
ドは、E.coliに適当な発現ベクターであり、プロペプチ
ダーゼで切断されて標準成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成でき
るヒトプロアポＡ−Ｉの合成を意図するものである。プ
ラスミドpULB9296はE.coli中に導入した場合、β−ガラ
クトシダーゼとヒトプロアポＡ−Ｉからなる融合タンパ
ク質を、E.coli lacプロモーター領域の制御下に発現す
るものである。融合生成物はなおプロペプチダーゼ切断
部位を含有するので、切断されて標準成熟ヒトアポＡ−
Ｉを生成することが可能である。
プラスミドpULB9299酵母種における発現ベクターとし
て適当で、酵母での効率的な発現を実現するためにARG3
プロモーターと転写ターミネーター領域からなる。この
場合も、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物はプロペプチダーゼ
で切断され、標準成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成することが
できる。プラスミドpULB1612はE.coli ompAタンパク質
シグナルペプチドのDNA配列に融合したプロポアＡ−Ｉ
構造遺伝子を含有し、lpp（リポタンパク質）プロモー
ターおよびlacプロモーター−オペレーターの制御下に
ある。構造は、プロアポＡ−Ｉ配列の前にompAシグナル
ペプチドをコードする配列があつて、ATG翻訳開始コド
ンは含まれていない。このプラスミドはE.coliに適当な
分泌ベクターであつて、Ｎ末端メチオニンをもたず、ペ
リプラズムに分泌されるヒトプロアポＡ−Ｉの合成を意
図するものである。プラスミドpNIV1613はヒトプロアポ
Ａ−I cDNA配列をバクロウイルス中に導入するための輸
送ベクターである。これはバクロウイルスのポリヘドリ
ンプロモーターとプロアポＡ−Ｉ構造遺伝子からなり、
ATG翻訳開始コドンを含有する。野生型バクロウイルス
（Autographa California,核多角体病ウイルス、AcNP
V）とともに、プラスミドpNIVは昆虫細胞中でのプロア
ポＡ−Ｉの合成を意図するものである。これは昆虫細胞
中での翻訳後修飾によりメチオニンを除去できる。
て適当で、酵母での効率的な発現を実現するためにARG3
プロモーターと転写ターミネーター領域からなる。この
場合も、ヒトプロアポＡ−Ｉ生成物はプロペプチダーゼ
で切断され、標準成熟ヒトアポＡ−Ｉを生成することが
できる。プラスミドpULB1612はE.coli ompAタンパク質
シグナルペプチドのDNA配列に融合したプロポアＡ−Ｉ
構造遺伝子を含有し、lpp（リポタンパク質）プロモー
ターおよびlacプロモーター−オペレーターの制御下に
ある。構造は、プロアポＡ−Ｉ配列の前にompAシグナル
ペプチドをコードする配列があつて、ATG翻訳開始コド
ンは含まれていない。このプラスミドはE.coliに適当な
分泌ベクターであつて、Ｎ末端メチオニンをもたず、ペ
リプラズムに分泌されるヒトプロアポＡ−Ｉの合成を意
図するものである。プラスミドpNIV1613はヒトプロアポ
Ａ−I cDNA配列をバクロウイルス中に導入するための輸
送ベクターである。これはバクロウイルスのポリヘドリ
ンプロモーターとプロアポＡ−Ｉ構造遺伝子からなり、
ATG翻訳開始コドンを含有する。野生型バクロウイルス
（Autographa California,核多角体病ウイルス、AcNP
V）とともに、プラスミドpNIVは昆虫細胞中でのプロア
ポＡ−Ｉの合成を意図するものである。これは昆虫細胞
中での翻訳後修飾によりメチオニンを除去できる。
最後に本発明は、上述のクローニングベクターまたは
発現ベクターで形質転換された培養細胞および微生物、
とくにヒトプロアポＡ−Ｉを産生できる形質転換培養細
胞および微生物に関する。本明細書において用いられる
「形質転換された」の語は、遺伝子が変化したという広
い意味を有するものであり、バクテリア形質転換のせま
い概念に限定されるものではない。使用するベクターの
種類およびそのために選択された宿主に応じて、求める
遺伝子変化を得るのに適した任意の遺伝子操作技術が使
用できる。たとえば、トランスフエクシヨン、トランス
ダクシヨン等が包含される。本発明によつて製造された
培養細胞および微生物はヒトプロアポリタンパク質Ａ−
Ｉの工業的規模における発酵生産に使用することができ
る。
発現ベクターで形質転換された培養細胞および微生物、
とくにヒトプロアポＡ−Ｉを産生できる形質転換培養細
胞および微生物に関する。本明細書において用いられる
「形質転換された」の語は、遺伝子が変化したという広
い意味を有するものであり、バクテリア形質転換のせま
い概念に限定されるものではない。使用するベクターの
種類およびそのために選択された宿主に応じて、求める
遺伝子変化を得るのに適した任意の遺伝子操作技術が使
用できる。たとえば、トランスフエクシヨン、トランス
ダクシヨン等が包含される。本発明によつて製造された
培養細胞および微生物はヒトプロアポリタンパク質Ａ−
Ｉの工業的規模における発酵生産に使用することができ
る。
好ましい態様の説明 本明細書に記載された発明は、とくに、微生物E.coli
K12株MM294（endoA thi−，hsd R,sup E）を使用して
実施された。この株はAmerican Type Culture Collecti
onに寄託されていて（ATCC33625号）、自由に入手でき
る。しかしながら、各種の他の微生物株が有用である。
公知のE.coli株たとえばE.coil B,E.coli x1776（ATCC3
1537号、1979年７月３日寄託、制限なし）、E.coli AR5
8an N99（ATCC33956号）のC III-,CI857,bio-,デルタＨ
機能欠損ラムダ誘導体（PL−Pharmaciaから市販されて
いる:J.E.Mottほか:proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:88〜9
2,1985;G.Devareら:Cell,36:43〜49,1984）、E.coli JM
101（ATCC33876号）（J.Messingら:Nucleic Acids Res.
９:309〜321,1981）またはE.coli JA221（lpp-,hdsM+,t
rp E5,leu B6,lacY,rec AI/F′,lac Iq,lac+,pro+）
（J.Ghrayebほか:EMBO J.,３:2437〜2442,1984）、また
そのほか公認された微生物寄託機関たとえばAmerican T
ype Culture Collection（ATCC）に寄託され、入手可能
なな場合が多い他の微生物株（ATCCカタログ参照）が使
用できる。これらの他の微生物としては、たとえばBaci
llus subtilisのようなBacilliおよび他の腸内細菌たと
えばSalmonella TyphimuriumおよびSeriatia marcesans
があり、異種遺伝子配列を複製し、発現できるプラスミ
ドが用いられる。
K12株MM294（endoA thi−，hsd R,sup E）を使用して
実施された。この株はAmerican Type Culture Collecti
onに寄託されていて（ATCC33625号）、自由に入手でき
る。しかしながら、各種の他の微生物株が有用である。
公知のE.coli株たとえばE.coil B,E.coli x1776（ATCC3
1537号、1979年７月３日寄託、制限なし）、E.coli AR5
8an N99（ATCC33956号）のC III-,CI857,bio-,デルタＨ
機能欠損ラムダ誘導体（PL−Pharmaciaから市販されて
いる:J.E.Mottほか:proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:88〜9
2,1985;G.Devareら:Cell,36:43〜49,1984）、E.coli JM
101（ATCC33876号）（J.Messingら:Nucleic Acids Res.
９:309〜321,1981）またはE.coli JA221（lpp-,hdsM+,t
rp E5,leu B6,lacY,rec AI/F′,lac Iq,lac+,pro+）
（J.Ghrayebほか:EMBO J.,３:2437〜2442,1984）、また
そのほか公認された微生物寄託機関たとえばAmerican T
ype Culture Collection（ATCC）に寄託され、入手可能
なな場合が多い他の微生物株（ATCCカタログ参照）が使
用できる。これらの他の微生物としては、たとえばBaci
llus subtilisのようなBacilliおよび他の腸内細菌たと
えばSalmonella TyphimuriumおよびSeriatia marcesans
があり、異種遺伝子配列を複製し、発現できるプラスミ
ドが用いられる。
バクテリアたとえばE.Coli用の発現プラスミドはいず
れも、ベクターとしてpBR322（ATCCに寄託番号37017号
として寄託されている）を用いて誘導され、共通のまた
は合成により作成した制限部位を利用して、機能的プロ
モーターとともに操作可能な読み取り枠で異種遺伝子な
らびに翻訳開始および停止コドンを適当に挿入して作成
される。ベクターには１種または２種以上の表現型選択
特性遺伝子および複製オリジンを、宿主内での増幅を保
証するために、含有させることもできる。この場合も、
異種挿入体をたとえばlacシステム遺伝子から誘導でき
る融合プレ配合ともに発現するように配置することも可
能である。
れも、ベクターとしてpBR322（ATCCに寄託番号37017号
として寄託されている）を用いて誘導され、共通のまた
は合成により作成した制限部位を利用して、機能的プロ
モーターとともに操作可能な読み取り枠で異種遺伝子な
らびに翻訳開始および停止コドンを適当に挿入して作成
される。ベクターには１種または２種以上の表現型選択
特性遺伝子および複製オリジンを、宿主内での増幅を保
証するために、含有させることもできる。この場合も、
異種挿入体をたとえばlacシステム遺伝子から誘導でき
る融合プレ配合ともに発現するように配置することも可
能である。
バクロウイルス発現ベクターたとえばpacRP6またはpA
cYM1（Y.Matsuuraほか:J.Gen.Virol.68:1233〜1250,198
7）と野生型バクロウイルス（Autographa californica
核多角体病ウイルス,AcNPV）が現在では広く用いられて
いる。これらは文献に詳細に記載されていて、Texas Ag
ricultural Experiment Stationから入手することがで
きる。
cYM1（Y.Matsuuraほか:J.Gen.Virol.68:1233〜1250,198
7）と野生型バクロウイルス（Autographa californica
核多角体病ウイルス,AcNPV）が現在では広く用いられて
いる。これらは文献に詳細に記載されていて、Texas Ag
ricultural Experiment Stationから入手することがで
きる。
本発明によればまた、適合性あるいは発現ベクターの
宿主として各種の昆虫細胞、たとえばSpodoptera frugi
perda細胞、Sf9（M.D.Summer ＆ G.E.Smith.A Manual o
f Methods for Baculovirus Vectors and Insect cell
culture Procedures,Texas University,College Statio
n（1987）:ATCC CRL1711）を使用することもできる。
宿主として各種の昆虫細胞、たとえばSpodoptera frugi
perda細胞、Sf9（M.D.Summer ＆ G.E.Smith.A Manual o
f Methods for Baculovirus Vectors and Insect cell
culture Procedures,Texas University,College Statio
n（1987）:ATCC CRL1711）を使用することもできる。
本発明によればまた、適合性ある発現ベクターの宿主
として、各種の酵素株、たとえばE.coliおよび酵母の両
者とくにSaccharomyces cerevisiae中で選択および複製
が可能なプラスミドYPp7（D.T.stinchcombほか:Nature,
282:39〜43,1979）も使用できる。有用な酵母株として
はAmerican Type Culture Collectionに制限なしで寄託
されている（ATCC44076号）RH218株（G.Miozzariほか:
J.Bacteriol.134:48〜59,1978）、leu2−3,leu2−112,p
ep4−３遺伝子型（M.Hoylaertsほか:FEBS Lett.204:83
〜87,1986）を有する10S44C株（T.Cabezonほか:Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,81:6594〜6598,1984）、およびIc1697
d株（argJ.leu2−１）アルギニンブラドトロフ（ATCC20
631号）を挙げることができる。
として、各種の酵素株、たとえばE.coliおよび酵母の両
者とくにSaccharomyces cerevisiae中で選択および複製
が可能なプラスミドYPp7（D.T.stinchcombほか:Nature,
282:39〜43,1979）も使用できる。有用な酵母株として
はAmerican Type Culture Collectionに制限なしで寄託
されている（ATCC44076号）RH218株（G.Miozzariほか:
J.Bacteriol.134:48〜59,1978）、leu2−3,leu2−112,p
ep4−３遺伝子型（M.Hoylaertsほか:FEBS Lett.204:83
〜87,1986）を有する10S44C株（T.Cabezonほか:Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,81:6594〜6598,1984）、およびIc1697
d株（argJ.leu2−１）アルギニンブラドトロフ（ATCC20
631号）を挙げることができる。
図面の簡単な記述 第1A図および第1B図はヒトプレプロアポＡ−Ｉのヌク
レオチドおよびアミノ酸配列を示す。ヒトプレプロアポ
Ａ−I mRNAのヌクレオチド配列は、cDNAク５ローンpULB
1609のDNA配列解析によつて決定した。シグナルペプチ
ド、プロペプチドおよび成熟アポＡ−Ｉポリペプチドの
予測されるアミノ酸を示し、アポＡ−Ｉタンパク質の最
初のアミノ酸残基から番号を付した。クローンの単離の
ために用いた合成DNAプローブに相当する領域には下線
を付す。
レオチドおよびアミノ酸配列を示す。ヒトプレプロアポ
Ａ−I mRNAのヌクレオチド配列は、cDNAク５ローンpULB
1609のDNA配列解析によつて決定した。シグナルペプチ
ド、プロペプチドおよび成熟アポＡ−Ｉポリペプチドの
予測されるアミノ酸を示し、アポＡ−Ｉタンパク質の最
初のアミノ酸残基から番号を付した。クローンの単離の
ために用いた合成DNAプローブに相当する領域には下線
を付す。
アミノ酸残基の一文字略号は、A,アラニン;C,システ
イン;D、アスパラギン酸;E,グルタミン酸;F,フエニルア
ラニン;G,グリシン;H,ヒスチジン;I,イソロイシン;K,リ
ジン;L,ロイシン;M,メチオニン;N,アスパラギン;P,プロ
リン;Q,グルタミン;R,アルギニン;S,セリン;T,スレオニ
ン;V,バリン;W,トリプトフアン；およびY,チロシンであ
る。
イン;D、アスパラギン酸;E,グルタミン酸;F,フエニルア
ラニン;G,グリシン;H,ヒスチジン;I,イソロイシン;K,リ
ジン;L,ロイシン;M,メチオニン;N,アスパラギン;P,プロ
リン;Q,グルタミン;R,アルギニン;S,セリン;T,スレオニ
ン;V,バリン;W,トリプトフアン；およびY,チロシンであ
る。
第２図は、プロペプチドの６個のアミノ酸および成熟
アポＡ−Ｉポリペプチドの最初の14個のアミノ酸をコー
ドするDNAフラグメントと開始ATGコドンの構築のための
オリゴヌクレオチドアダプターの合成図である。矢印は
65/61bp Nco I−Bal Iフラグメントを合成するために用
いたオリゴヌクレオチドを示している。
アポＡ−Ｉポリペプチドの最初の14個のアミノ酸をコー
ドするDNAフラグメントと開始ATGコドンの構築のための
オリゴヌクレオチドアダプターの合成図である。矢印は
65/61bp Nco I−Bal Iフラグメントを合成するために用
いたオリゴヌクレオチドを示している。
第３図は、PLラムダ調節領域とプロアポＡ−Ｉヌクレ
オチド配列を有するpULB9291の構築を示している。
オチド配列を有するpULB9291の構築を示している。
第４図は、E.coli lacプロモーターと融合β−カラク
トシダーゼ−プロアポＡ−Ｉヌクレオチド配列を有する
pULB9296の構築を示している。
トシダーゼ−プロアポＡ−Ｉヌクレオチド配列を有する
pULB9296の構築を示している。
第５図は、酵母ARG3調節領域とプロアポＡ−Ｉヌクレ
オチド配列を有するpULB9299の構築を示す。
オチド配列を有するpULB9299の構築を示す。
第6A図、第6B図、第6C図は、lacおよびlpp調節領域、
ompAシグナルペプチドをコードする配列およびプロアポ
Ａ−Ｉヌクレオチド配列を有するpNIV1612の構築を示
す。
ompAシグナルペプチドをコードする配列およびプロアポ
Ａ−Ｉヌクレオチド配列を有するpNIV1612の構築を示
す。
第７図は、ポリヘドリン遺伝子調節領域およびプロア
ポＡ−Ｉヌクレオチド配列を含有するpNIV1613の構築を
示す。
ポＡ−Ｉヌクレオチド配列を含有するpNIV1613の構築を
示す。
発明の詳細な記述 RNAプレパレーシヨン：ヒト肝臓総RNAはグアニジニウ
ムクロライド法によつて製造した（R.A.Cox,Methods En
zymol.XII,part B,120〜129,1968）。この総RNAプレパ
レーシヨンをついでオリゴ（dT）セルロースカラムに通
して総ポリA+RNAを得た（T.Maniatisほか:Molecular Cl
oning,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Ha
rbor,New York,1982）。ヒト肝臓10gからポリA+RNA200
μｇが得られた。
ムクロライド法によつて製造した（R.A.Cox,Methods En
zymol.XII,part B,120〜129,1968）。この総RNAプレパ
レーシヨンをついでオリゴ（dT）セルロースカラムに通
して総ポリA+RNAを得た（T.Maniatisほか:Molecular Cl
oning,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Ha
rbor,New York,1982）。ヒト肝臓10gからポリA+RNA200
μｇが得られた。
相補的DNA（cDNA）のin vitroでの合成 総ポリA+RNA0.1〜0.5μｇを含有する逆転写反応液を
オリゴ（dT）12〜18（約１μg,入手先:Boethringer）で
プライミングした。ついで一本鎖cDNAを同じ逆転写酵素
で二本鎖分子（cDNAds）に変換した。このcDNAdsプレパ
レーシヨン通常は１μｇをS1ヌクレアーゼで処理してブ
ラント末端を作成した。操作は本技術分野においてよく
知られているとおりで、詳細はT.Maniatisら（前出）に
記載されている。次にcDNAdsをL.Villa・Komaroffら（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3727〜3731,1978）によつて
記載された方法でオリゴ（dC）テールを付した。通常cD
NAds100ngを酵素、末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼで処理する。一般に、cDNAds分子の３′末
端に15塩基の延長が行われる。
オリゴ（dT）12〜18（約１μg,入手先:Boethringer）で
プライミングした。ついで一本鎖cDNAを同じ逆転写酵素
で二本鎖分子（cDNAds）に変換した。このcDNAdsプレパ
レーシヨン通常は１μｇをS1ヌクレアーゼで処理してブ
ラント末端を作成した。操作は本技術分野においてよく
知られているとおりで、詳細はT.Maniatisら（前出）に
記載されている。次にcDNAdsをL.Villa・Komaroffら（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3727〜3731,1978）によつて
記載された方法でオリゴ（dC）テールを付した。通常cD
NAds100ngを酵素、末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼで処理する。一般に、cDNAds分子の３′末
端に15塩基の延長が行われる。
テールを付したcDNAdsのプラスミドベクターpBR322への
クローニング pBR322プラスミドDNAを酸素Pst Iによつて線状とし、
R.M.Lawnら（Nucleic Acids Res.９:6103〜6114,1981）
によつて記載されたようにしてオリゴ（dG）テールを付
した。オリゴ（dC）テールを付したcDNAdsをオリゴ（d
G）テールを付したpBR322DNAと等モル比で混合した。通
常、混合物50μｇをアニーリングして、プラスミドを再
び環化した。条件は本技術分野においてよく知られてい
るとおりで、R.M.Lawnら（前出）によつて詳述されてい
る。次にアニーリング混合物を用い、R.M.Lawnら（前
出）によつて記載されたようにしてコンピーテントE.co
li細胞、MM294株を形質転換した。テトラサイクリン上
で生育させることにより数百の形質転換体が得られた。
この抗生物質に対する抵抗性はpBR322プラスミドによつ
て付与されたものである。形質転換体はアンピシリンに
対する感受性によつてアツセイした。このベクターへの
異種DNAの挿入はアンピシリン遺伝子を不活性化するの
で、感受性のものはキメラプラスミドを含有する。
クローニング pBR322プラスミドDNAを酸素Pst Iによつて線状とし、
R.M.Lawnら（Nucleic Acids Res.９:6103〜6114,1981）
によつて記載されたようにしてオリゴ（dG）テールを付
した。オリゴ（dC）テールを付したcDNAdsをオリゴ（d
G）テールを付したpBR322DNAと等モル比で混合した。通
常、混合物50μｇをアニーリングして、プラスミドを再
び環化した。条件は本技術分野においてよく知られてい
るとおりで、R.M.Lawnら（前出）によつて詳述されてい
る。次にアニーリング混合物を用い、R.M.Lawnら（前
出）によつて記載されたようにしてコンピーテントE.co
li細胞、MM294株を形質転換した。テトラサイクリン上
で生育させることにより数百の形質転換体が得られた。
この抗生物質に対する抵抗性はpBR322プラスミドによつ
て付与されたものである。形質転換体はアンピシリンに
対する感受性によつてアツセイした。このベクターへの
異種DNAの挿入はアンピシリン遺伝子を不活性化するの
で、感受性のものはキメラプラスミドを含有する。
cDNAライブラリーのスクリーニング E.coli形質転換体を、アポＡ−Ｉ遺伝子のフラグメン
トに相当する合成オリゴヌクレオチドの32P5′末端標識
体でスクリーニングした。ヒトアポＡ−Ｉのヌクレオチ
ド配列は公知である（P.Cheugのほか：前出およびJ.J.S
eilhamerほか：前出参照）。したがつて、遺伝子の５′
末端に相当する22塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ
をN.D.Sinhaら（Nucleic Acds.Res.12:4539〜4557,198
4）の方法によつて化学的に合成するのが便利である。
選択された配列は、５′−GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG−
３′である。合成オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイ
ゼーシヨン実験に使う前に、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐ−L Biochemicals）および〔γ−22P〕ATPを用い
てその５′末端をホスホリル化した。標識およびハイブ
リダイゼーシヨンの条件は本技術分野においてよく知ら
れているとおりで、T.Maniatisら（前出）およびA.Boll
enら（DNA,２:255〜264,1983）によつて詳細に記載され
ている。
トに相当する合成オリゴヌクレオチドの32P5′末端標識
体でスクリーニングした。ヒトアポＡ−Ｉのヌクレオチ
ド配列は公知である（P.Cheugのほか：前出およびJ.J.S
eilhamerほか：前出参照）。したがつて、遺伝子の５′
末端に相当する22塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ
をN.D.Sinhaら（Nucleic Acds.Res.12:4539〜4557,198
4）の方法によつて化学的に合成するのが便利である。
選択された配列は、５′−GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG−
３′である。合成オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイ
ゼーシヨン実験に使う前に、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐ−L Biochemicals）および〔γ−22P〕ATPを用い
てその５′末端をホスホリル化した。標識およびハイブ
リダイゼーシヨンの条件は本技術分野においてよく知ら
れているとおりで、T.Maniatisら（前出）およびA.Boll
enら（DNA,２:255〜264,1983）によつて詳細に記載され
ている。
発現プラスミドの構築 DNAの製造、DNAフラグメントの単離の操作、ならびに
制限酵素解析およびフラグメントのリゲーシヨンの条件
は本技術分野においてよく知られているとおりで、R.M.
Lawnほか（前出）およびT.Cabezonら（前出）によつて
詳細に記載されている。これらが本発明の場合にも適用
できる。発現ベクターのプロモーターと遺伝子の５′末
端を接続するフラグメントの合成は以下に述べる。
制限酵素解析およびフラグメントのリゲーシヨンの条件
は本技術分野においてよく知られているとおりで、R.M.
Lawnほか（前出）およびT.Cabezonら（前出）によつて
詳細に記載されている。これらが本発明の場合にも適用
できる。発現ベクターのプロモーターと遺伝子の５′末
端を接続するフラグメントの合成は以下に述べる。
Nco I−Bal Iフラグメントの合成 65/60bp Nco I−Bal Iフラグメントの合成に使用され
る35−mer,30−mer,18merおよび43−merオリゴヌクレオ
チドの設計の基本になる原理は第２図に詳細に示す。30
−merおよび18−mer合成フラグメントの５′末端をT4ポ
リヌクれオチドキナーゼ（Ｐ−L Biochemicals）を用い
てホスホリル化した。非ホスホリル化35−merおよび43
−merを含めて各１μｇのオリゴヌクレオチドを一緒
に、300mM酢酸ナトリウム（pH7.0）中、95℃に３分間加
熱しついで４℃まで徐々に冷却して、アニーリングし
た。アニーリング反応液はそのまま、発現プラスミド構
築のためのクローニング操作に使用した。
る35−mer,30−mer,18merおよび43−merオリゴヌクレオ
チドの設計の基本になる原理は第２図に詳細に示す。30
−merおよび18−mer合成フラグメントの５′末端をT4ポ
リヌクれオチドキナーゼ（Ｐ−L Biochemicals）を用い
てホスホリル化した。非ホスホリル化35−merおよび43
−merを含めて各１μｇのオリゴヌクレオチドを一緒
に、300mM酢酸ナトリウム（pH7.0）中、95℃に３分間加
熱しついで４℃まで徐々に冷却して、アニーリングし
た。アニーリング反応液はそのまま、発現プラスミド構
築のためのクローニング操作に使用した。
DNA配列決定 DNA配列解析は、A.M.Maxam ＆ W.Gilbert（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,74:560〜564,1977）およびF.Sangerら
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463〜5467,1977）の方
法によつて実施した。
l.Acad.Sci.USA,74:560〜564,1977）およびF.Sangerら
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463〜5467,1977）の方
法によつて実施した。
タンパク質分析 ヒトプロアポＡ−Ｉ発現プラスミドpULB9291,pULB929
2,pULB9296およびpULB9299（それぞれE.coli株AR58,JM1
01または酵母株10S44cを形質転換）を有する株の発酵中
様々な段階で10D630単位を含有する細胞ペレツトを採取
した。各サンプルを、２％ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、6M尿素、10％グリセロールおよび５％２−メルカ
プトエタノールを含有する50mM Tris−HCl緩衝液pH6.8
に再懸濁し、３分間煮沸した。サンプルU.K.Laemmli（N
ature,227:680〜685,1970）のポリアクリルアミドゲル
中電気泳動に付した。全タンパク質をクーマシーブリリ
アントブルー染色によつて発色させ、合成されたヒトプ
ロアポＡ−Ｉはウエスタンブロツト解析（A.Bollenほ
か：前出）によつて同定した。
2,pULB9296およびpULB9299（それぞれE.coli株AR58,JM1
01または酵母株10S44cを形質転換）を有する株の発酵中
様々な段階で10D630単位を含有する細胞ペレツトを採取
した。各サンプルを、２％ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、6M尿素、10％グリセロールおよび５％２−メルカ
プトエタノールを含有する50mM Tris−HCl緩衝液pH6.8
に再懸濁し、３分間煮沸した。サンプルU.K.Laemmli（N
ature,227:680〜685,1970）のポリアクリルアミドゲル
中電気泳動に付した。全タンパク質をクーマシーブリリ
アントブルー染色によつて発色させ、合成されたヒトプ
ロアポＡ−Ｉはウエスタンブロツト解析（A.Bollenほ
か：前出）によつて同定した。
ヒトプロアポＡ−Ｉのバクテリア、酵母およびバクロウ
イルス感染昆虫細胞中での発現のための組換えベクター
の構築 1. ヒトプレプロアポＡ−Ｉのための初期cDNAクロー
ン:pULB1609（第１図） ヒト肝ポリA+RNAに相当するcDNAdsのbBR322Pst I部位
へのクローニングから誘導された数百の形質転換体を上
述の22−merアポＡ−Ｉ合成プローブでスクリーニング
した。クローンのひとつがアツセイにおいて強力なハイ
ブリダイゼーシヨンシグナルを与えた。pULB1609と命名
したこのクローンを回収し、組換えプラスミド中に存在
するDNA挿入体の特性をDNA配列解析で調べた。その長さ
は878塩基対（bp）で、プレプロアポＡ−Ｉポリペプチ
ドの全長をコードしていることが明らかにされた。第１
図に示ように、クローン化cDNAフラグメントは、５′お
よび３′非暗号領域（それぞれ19bpおよび55bp）、プレ
カーサーペプチドをコードする54bpの配列（aa−24〜aa
−７）、プロペプチドをコードする18bpの配列（aa−６
〜aa−１）および成熟アポAIをコードする−732bpの配
列（aa1〜aa243）ならびに翻訳停止コドンを有する。DN
A配列から帰納されるタンパク質配列は、タンパク質か
ら得られたアミノ酸配列およびプレプロアポＡ−Ｉの独
立に単離されたcDNAクローンからの配列と完全に一致し
た（W.C.Barkerほか:Comp.Biochem.Physiol.57B309〜31
5,1977;日本特許出願96998/86号;P.Cheung ＆ L.Chan:
前出、およびJ.J.Seilhamerほか：前出） 2. ヒトプロアポＡ−I cDNA配列を含むバクテリア発現
ベクターの構築（第２、３図） ヒトプロアポＡ−Ｉを産生するプラスミド、pULB9291
は、調節可能なPLラムダプロモーターの後にクローンpU
LB1609から誘導されたセグメントを配置することにより
構築された。この発現プラスミドの構築には、Nco I切
断部位、ATG翻訳開始コドンおよびヒトプロアポＡ−Ｉ
構造遺伝子のアミノ末端におけるアミノ酸をコードする
ヌクレオチド配列、最初の唯一の制限部位Bal Iまでか
らなるDNAフラグメントの合成が必要である（第２
図）。このアダプターは化学的操作によつて合成された
（N.D.Sinhaほか：前出）。４個の合成オリゴヌクレオ
チドが合成された。アニーリングすると、それらはATG
翻訳開始コドンに相当するメチオニン、プロペプチドに
相当する６個のアミノ酸および成熟ヒトアポＡ−Ｉの最
初の14個のアミノ酸をコードする（第２図）。合成アダ
プターは遺伝子の５′末端における二次構造を最小にす
るように設計された。このためにアミノ酸残基−6,−1,
1,3,4,5,6,7,10,11および14をコードするように選ばれ
たコドンはpULB1609cDNAクローン中に認められる天然の
コドンと一致しない。
イルス感染昆虫細胞中での発現のための組換えベクター
の構築 1. ヒトプレプロアポＡ−Ｉのための初期cDNAクロー
ン:pULB1609（第１図） ヒト肝ポリA+RNAに相当するcDNAdsのbBR322Pst I部位
へのクローニングから誘導された数百の形質転換体を上
述の22−merアポＡ−Ｉ合成プローブでスクリーニング
した。クローンのひとつがアツセイにおいて強力なハイ
ブリダイゼーシヨンシグナルを与えた。pULB1609と命名
したこのクローンを回収し、組換えプラスミド中に存在
するDNA挿入体の特性をDNA配列解析で調べた。その長さ
は878塩基対（bp）で、プレプロアポＡ−Ｉポリペプチ
ドの全長をコードしていることが明らかにされた。第１
図に示ように、クローン化cDNAフラグメントは、５′お
よび３′非暗号領域（それぞれ19bpおよび55bp）、プレ
カーサーペプチドをコードする54bpの配列（aa−24〜aa
−７）、プロペプチドをコードする18bpの配列（aa−６
〜aa−１）および成熟アポAIをコードする−732bpの配
列（aa1〜aa243）ならびに翻訳停止コドンを有する。DN
A配列から帰納されるタンパク質配列は、タンパク質か
ら得られたアミノ酸配列およびプレプロアポＡ−Ｉの独
立に単離されたcDNAクローンからの配列と完全に一致し
た（W.C.Barkerほか:Comp.Biochem.Physiol.57B309〜31
5,1977;日本特許出願96998/86号;P.Cheung ＆ L.Chan:
前出、およびJ.J.Seilhamerほか：前出） 2. ヒトプロアポＡ−I cDNA配列を含むバクテリア発現
ベクターの構築（第２、３図） ヒトプロアポＡ−Ｉを産生するプラスミド、pULB9291
は、調節可能なPLラムダプロモーターの後にクローンpU
LB1609から誘導されたセグメントを配置することにより
構築された。この発現プラスミドの構築には、Nco I切
断部位、ATG翻訳開始コドンおよびヒトプロアポＡ−Ｉ
構造遺伝子のアミノ末端におけるアミノ酸をコードする
ヌクレオチド配列、最初の唯一の制限部位Bal Iまでか
らなるDNAフラグメントの合成が必要である（第２
図）。このアダプターは化学的操作によつて合成された
（N.D.Sinhaほか：前出）。４個の合成オリゴヌクレオ
チドが合成された。アニーリングすると、それらはATG
翻訳開始コドンに相当するメチオニン、プロペプチドに
相当する６個のアミノ酸および成熟ヒトアポＡ−Ｉの最
初の14個のアミノ酸をコードする（第２図）。合成アダ
プターは遺伝子の５′末端における二次構造を最小にす
るように設計された。このためにアミノ酸残基−6,−1,
1,3,4,5,6,7,10,11および14をコードするように選ばれ
たコドンはpULB1609cDNAクローン中に認められる天然の
コドンと一致しない。
上述の合成アダプターはpULB1609から誘導された744p
b DNAフラグメントを発現プラスミドpULB1221中のPLラ
ムダプロモーターに接続するために使用された。
b DNAフラグメントを発現プラスミドpULB1221中のPLラ
ムダプロモーターに接続するために使用された。
発現ベクターpULB1221の構築はヨーロツパ特許出願第
186,643号に記載されている。それはプラスミドpCQ V2
に出発する３つの主要工程からなるものである。プラス
ミドpCQ V2ははC.Queenにより、J.Mol.Appl.Genet.２:1
〜10,1983に記載されていて、自由に入手できる。この
特定のベクターの選択は必須ではない。プロモーターと
その下流に適当なNco I部位を有する任意の他のベクタ
ーが使用できる。上述のアニーリングされた合成フラグ
メント約0.1μｇを、T4DNAリガーゼを用いて、pULB1609
から誘導される744bp Bal I−Pst Iフラグメント約１μ
ｇおよびNco IとBal Iで切断したベクターpULB1221約１
μｇにリゲーシヨンした。リゲーシヨンに先立ち、744p
b Bal I−Pst IフラグメントをT4DNAポリメラーゼで処
理して３′突出末端を平滑化した。この操作は本技術分
野においてよく知られているとおりで、T.Maniatisら
（前出）により詳細に記載されている。
186,643号に記載されている。それはプラスミドpCQ V2
に出発する３つの主要工程からなるものである。プラス
ミドpCQ V2ははC.Queenにより、J.Mol.Appl.Genet.２:1
〜10,1983に記載されていて、自由に入手できる。この
特定のベクターの選択は必須ではない。プロモーターと
その下流に適当なNco I部位を有する任意の他のベクタ
ーが使用できる。上述のアニーリングされた合成フラグ
メント約0.1μｇを、T4DNAリガーゼを用いて、pULB1609
から誘導される744bp Bal I−Pst Iフラグメント約１μ
ｇおよびNco IとBal Iで切断したベクターpULB1221約１
μｇにリゲーシヨンした。リゲーシヨンに先立ち、744p
b Bal I−Pst IフラグメントをT4DNAポリメラーゼで処
理して３′突出末端を平滑化した。この操作は本技術分
野においてよく知られているとおりで、T.Maniatisら
（前出）により詳細に記載されている。
E.coli AR58コーピーテント細胞中で増幅した再構築
プラスミドの性質は、制限部位解析および合成部分と接
合部位のDNA配列解析によつて調べた。１個の再構築プ
ラスミドpULB9291がすべての基準を満足し、フラグメン
トを正しい順序、方向に含有することを示した。これを
発現の研究に使用することとした。
プラスミドの性質は、制限部位解析および合成部分と接
合部位のDNA配列解析によつて調べた。１個の再構築プ
ラスミドpULB9291がすべての基準を満足し、フラグメン
トを正しい順序、方向に含有することを示した。これを
発現の研究に使用することとした。
3. β−カラクトシダーゼおよびヒトプロアポＡ−Ｉに
相当する融合配列を含有するバクテリア発現ベクターの
構築:pULB9296（第４図） この構築においては、ヒトプロアポＡ−Ｉをコードす
るDNA配列をβ−ガラクトシダーゼのDNA配列の下流に正
しい読み取り枠で融合した。β−カラクトシダーゼの遺
伝子は、自由に入手できるE.coil発現プラスミドpUR288
（U.Ruther ＆ B.Muller−Hill:EMBO J.２:1791〜1794,
1983）上に存在する。このプラスミドは、効率的に誘導
されるlacプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ配列中
への適当な制限部位を含有する。適当な組換えプラスミ
ドは第４図に示すようにして構築された。まずpUR288プ
ラスミドDNAを順次、Bam H I切断、T4DNAポリメラーゼ
処理、Sal Iによる再度の切断に付した。第二に805bp D
NAフラグメントをpULB9291から、順次、Kpn I消化、T4D
NAポリメラーゼ処理ついでSal I消化を行つて誘導し
た。２個のフラグメント等モル比のT4 DNAリガーゼを用
いてたがいにリゲーシヨンし、生成したプラスミドを用
いて、E.coliコンピーテント細胞、広く自由に入手でき
る株、JM101株（ATCC33876号）の形質転換に使用した。
形質転換体は、ヒトプロアポＡ−Ｉ配列のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子に対する正しい方向生、および２個の配
列の接続点における再構築BamH I部位の存在についての
制限解析によつてチエツクした。これにより、ヒロプロ
アポＡ−Ｉ配列はβ−ガクトシダーゼDNA配列に対し下
流に、正しい読み取り枠で融合していることが示され
た。形質転換体の一つ、pULB9296はすべての基準を満足
し、発現実験に使用された。
相当する融合配列を含有するバクテリア発現ベクターの
構築:pULB9296（第４図） この構築においては、ヒトプロアポＡ−Ｉをコードす
るDNA配列をβ−ガラクトシダーゼのDNA配列の下流に正
しい読み取り枠で融合した。β−カラクトシダーゼの遺
伝子は、自由に入手できるE.coil発現プラスミドpUR288
（U.Ruther ＆ B.Muller−Hill:EMBO J.２:1791〜1794,
1983）上に存在する。このプラスミドは、効率的に誘導
されるlacプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ配列中
への適当な制限部位を含有する。適当な組換えプラスミ
ドは第４図に示すようにして構築された。まずpUR288プ
ラスミドDNAを順次、Bam H I切断、T4DNAポリメラーゼ
処理、Sal Iによる再度の切断に付した。第二に805bp D
NAフラグメントをpULB9291から、順次、Kpn I消化、T4D
NAポリメラーゼ処理ついでSal I消化を行つて誘導し
た。２個のフラグメント等モル比のT4 DNAリガーゼを用
いてたがいにリゲーシヨンし、生成したプラスミドを用
いて、E.coliコンピーテント細胞、広く自由に入手でき
る株、JM101株（ATCC33876号）の形質転換に使用した。
形質転換体は、ヒトプロアポＡ−Ｉ配列のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子に対する正しい方向生、および２個の配
列の接続点における再構築BamH I部位の存在についての
制限解析によつてチエツクした。これにより、ヒロプロ
アポＡ−Ｉ配列はβ−ガクトシダーゼDNA配列に対し下
流に、正しい読み取り枠で融合していることが示され
た。形質転換体の一つ、pULB9296はすべての基準を満足
し、発現実験に使用された。
4. ヒトプロアポＡ−I cDNA配列を有する酵母発現プラ
スミドの構築:pULB9299（第５図） この構築には、ヒトプロアポＡ−ＩをコードするcDNA
配列が、酵母発現プラスミドのものプロモーターおよび
ターミネータシグナルの間にクローン化された。実験に
は酵母発現ベクターpRIT10774を選んだ。発現プラスミ
ドpRIT10774の構築はヨーロツパ特許出願第151,102号に
記載されている。それはひとつには、ブタペスト条約に
よつてATCCに寄託番号第39133号として寄託されている
プラスミドpRIT10749に出発して、また他方ではATCCか
ら寄託番号37115号で入手できるJ.R.Broachら（Gene,
８:121〜133,1979）の報告したE.colis−S cerevisiae
シヤトルベクターYEp13に出発して構築された。ベクタ
ーpRIT10774は、E.coliおよび酵母の両者内で複製可能
で、それ自身のATG翻訳開始コドンを有する異種DNAの挿
入に便利な唯一のBamH I制限部位によつて分離されたオ
ルニチンカルバモイルトランスフエラーゼ（ARG3）プロ
モーターおよび転写ターミネーターを含有する。さらに
このベクターは、酵母２μ配列、酵母内選択のための代
謝マーカーおよびE.coli内におけるシヤトリングのAmpA
選択マーカーを含有する。これは酵母中でのヒトプロア
ポＡ−Ｉの発現に使用できるのみでなく、調節シグナル
をもつ任意の他の酵母ベクターが使用でき、量的に類似
の結果が得られる。第５図に示した構築は以下のように
進められる。pRIT10774プラスミドDNAを酵素BamH Iで線
状とし、T4DNAポリメラーゼで処理した。一方、810bpDN
Aフラグメントは、pULB9291から酵素Asp718およびSal I
による消化についでT4DNAポリメラーゼ処理によつて誘
導した。このフラグメントはヒトプロアポＡ−Ｉをコー
ドし、ATG翻訳開始コドンを包含する。上述のようにし
て得られた２個のフラグメント等モル比をT4DNAリガー
ゼを用いてリゲーシヨンさせ、この混合物を用いてE.co
li MM294コンピーテント細胞を形質転換した。形質転換
体は、プロアポＡ−IDNA配列のARG3プロモーター配列に
対する正しい方向性を確認するため制限解析によつてチ
エツクした。形質転換体のひとつが組換えプラスミドpU
LB9299を有し、この条件を満足した。プラスミドpULB92
99をE.coli中で増幅させ、酵母Saccharomyces cerevisi
ae10S44C株（pep4−3,leu2−3,leu2−112）；（T.Cabez
onほか：前出）のスフエロプラストの形質転換に用い
た。株IC1679d（ATCC20631号）の使用でも量的に類似の
結果が得られる。酵母形質転換体は次にヒトプロアポＡ
−Ｉの発現について調べた。
スミドの構築:pULB9299（第５図） この構築には、ヒトプロアポＡ−ＩをコードするcDNA
配列が、酵母発現プラスミドのものプロモーターおよび
ターミネータシグナルの間にクローン化された。実験に
は酵母発現ベクターpRIT10774を選んだ。発現プラスミ
ドpRIT10774の構築はヨーロツパ特許出願第151,102号に
記載されている。それはひとつには、ブタペスト条約に
よつてATCCに寄託番号第39133号として寄託されている
プラスミドpRIT10749に出発して、また他方ではATCCか
ら寄託番号37115号で入手できるJ.R.Broachら（Gene,
８:121〜133,1979）の報告したE.colis−S cerevisiae
シヤトルベクターYEp13に出発して構築された。ベクタ
ーpRIT10774は、E.coliおよび酵母の両者内で複製可能
で、それ自身のATG翻訳開始コドンを有する異種DNAの挿
入に便利な唯一のBamH I制限部位によつて分離されたオ
ルニチンカルバモイルトランスフエラーゼ（ARG3）プロ
モーターおよび転写ターミネーターを含有する。さらに
このベクターは、酵母２μ配列、酵母内選択のための代
謝マーカーおよびE.coli内におけるシヤトリングのAmpA
選択マーカーを含有する。これは酵母中でのヒトプロア
ポＡ−Ｉの発現に使用できるのみでなく、調節シグナル
をもつ任意の他の酵母ベクターが使用でき、量的に類似
の結果が得られる。第５図に示した構築は以下のように
進められる。pRIT10774プラスミドDNAを酵素BamH Iで線
状とし、T4DNAポリメラーゼで処理した。一方、810bpDN
Aフラグメントは、pULB9291から酵素Asp718およびSal I
による消化についでT4DNAポリメラーゼ処理によつて誘
導した。このフラグメントはヒトプロアポＡ−Ｉをコー
ドし、ATG翻訳開始コドンを包含する。上述のようにし
て得られた２個のフラグメント等モル比をT4DNAリガー
ゼを用いてリゲーシヨンさせ、この混合物を用いてE.co
li MM294コンピーテント細胞を形質転換した。形質転換
体は、プロアポＡ−IDNA配列のARG3プロモーター配列に
対する正しい方向性を確認するため制限解析によつてチ
エツクした。形質転換体のひとつが組換えプラスミドpU
LB9299を有し、この条件を満足した。プラスミドpULB92
99をE.coli中で増幅させ、酵母Saccharomyces cerevisi
ae10S44C株（pep4−3,leu2−3,leu2−112）；（T.Cabez
onほか：前出）のスフエロプラストの形質転換に用い
た。株IC1679d（ATCC20631号）の使用でも量的に類似の
結果が得られる。酵母形質転換体は次にヒトプロアポＡ
−Ｉの発現について調べた。
5. ヒトプロアポＡ−I cDNA配列を含有するバクテリア
分泌ベクターの構築:pNIV1612（第6A図、第6B図および
第6C図） この構築には、ヒトプロアＡ−ＩをコードするDNA配
列を、E.coli Ompaタンパク質シグナルペプチドのDNA配
列に、その下流に正しい読み取り枠で融合した。この実
験には分泌ベクターPIN−III−ompA−２を選択した（J.
Ghrayebほか:EMBO J.３:2437〜2442,1984）。このベク
ターおよびその宿主株JA221は、Stony Brookのニユーヨ
ーク州立大学、生化学教室から請求により入手できる。
分泌ベクターの構築:pNIV1612（第6A図、第6B図および
第6C図） この構築には、ヒトプロアＡ−ＩをコードするDNA配
列を、E.coli Ompaタンパク質シグナルペプチドのDNA配
列に、その下流に正しい読み取り枠で融合した。この実
験には分泌ベクターPIN−III−ompA−２を選択した（J.
Ghrayebほか:EMBO J.３:2437〜2442,1984）。このベク
ターおよびその宿主株JA221は、Stony Brookのニユーヨ
ーク州立大学、生化学教室から請求により入手できる。
分泌ベクターは強力なlpp（リポタンパク質）プロモ
ーター、lacプロモーター−オペレーターフラグメン
ト、lacレプレツサーのLac I配列および適当な制限部位
を、cmpAシグナルペプチドをコードする配列の直後に含
有する。適当な組換えプラスミドは、第6A図、第6B図お
よび第6C図に示すようにして構築された。最初に、分泌
ベクターpIN−III−ompA−２をEcoR Iで線状とし、T4DN
Aポリメラーゼで処理した。第二に805bp DNAフラグメン
トは、pULB9291を順次、制限酵素Kpn IおよびSal Iによ
る消化、ついでT4DNAポリメラーゼ処理に付して誘導し
た。このフラグメントはヒトプロアポＡ−Ｉをコード
し、ATG翻訳開始コドンを含有する。上述のようにして
得られた２種のフラグメントを等モル比でT4DNAリガー
ゼを用いてリゲーシヨンし、この混合物を用いて、トリ
プトフアン（20mg/）、ロイシン（20mg/）、乳糖
（2g/）およびアンピシリン（50mg/）を含有するM9
メジウム（J.H.Miller:Experiments in Molecular Gene
tics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor,New York,1972,p.143）中で、E.coli JA221コンピ
ーテント細胞を形質転換した。
ーター、lacプロモーター−オペレーターフラグメン
ト、lacレプレツサーのLac I配列および適当な制限部位
を、cmpAシグナルペプチドをコードする配列の直後に含
有する。適当な組換えプラスミドは、第6A図、第6B図お
よび第6C図に示すようにして構築された。最初に、分泌
ベクターpIN−III−ompA−２をEcoR Iで線状とし、T4DN
Aポリメラーゼで処理した。第二に805bp DNAフラグメン
トは、pULB9291を順次、制限酵素Kpn IおよびSal Iによ
る消化、ついでT4DNAポリメラーゼ処理に付して誘導し
た。このフラグメントはヒトプロアポＡ−Ｉをコード
し、ATG翻訳開始コドンを含有する。上述のようにして
得られた２種のフラグメントを等モル比でT4DNAリガー
ゼを用いてリゲーシヨンし、この混合物を用いて、トリ
プトフアン（20mg/）、ロイシン（20mg/）、乳糖
（2g/）およびアンピシリン（50mg/）を含有するM9
メジウム（J.H.Miller:Experiments in Molecular Gene
tics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor,New York,1972,p.143）中で、E.coli JA221コンピ
ーテント細胞を形質転換した。
形質転換体はそのアンピシリン抵抗性によつて選択
し、18−mer合成オリゴヌクレオチド（同じものをアダ
プターの合成に用いた。第２図参照）でスクリーニング
した。選択された形質転換体は制限解析でチエツクし、
プロアポＡ−Ｉ DNA配列が、分泌ベクターのもつシグ
ナルペプチド配列に対して正しい方向性を示すことを確
認するため、低減解析によつてチエツクした（再構築さ
れたEcoR I部位が２個の配列の接合部にある）。形質転
換体のひとつが組換えプラスミドを有し、この条件を満
足した。構築後リンカーによる余分の配列は以下のヌク
レオチド配列に下線を付した。
し、18−mer合成オリゴヌクレオチド（同じものをアダ
プターの合成に用いた。第２図参照）でスクリーニング
した。選択された形質転換体は制限解析でチエツクし、
プロアポＡ−Ｉ DNA配列が、分泌ベクターのもつシグ
ナルペプチド配列に対して正しい方向性を示すことを確
認するため、低減解析によつてチエツクした（再構築さ
れたEcoR I部位が２個の配列の接合部にある）。形質転
換体のひとつが組換えプラスミドを有し、この条件を満
足した。構築後リンカーによる余分の配列は以下のヌク
レオチド配列に下線を付した。
この配列はオリゴヌクルオチドによる特定部位の突然
変異誘発によつて除去した。この目的には、12個の余分
の塩基を欠く24−merオリゴヌクレオチド を合成し12塩基リンカー配列の除去に使用した。
変異誘発によつて除去した。この目的には、12個の余分
の塩基を欠く24−merオリゴヌクレオチド を合成し12塩基リンカー配列の除去に使用した。
突然変異誘発にはAmershamシステムを使用する。この
システムはF.Ecksteinらの方法（Nucleic Acids Res.1
3:8765〜8785,1985）に基づくものである。この方法で
はプラークの高収率および95％までの最高の効率が得ら
れる。まず、突然変異を誘発すべきDNAの領域をM13ベク
ター中にクローニングする。このためには、プロアポＡ
−Ｉを有する組換えプラスミドPIN−III−ompA−２のXb
a I−Bal I DNAフラグメントをXba IとHing IIで切断
したM13mp19ベクター中に挿入する。ベクターM13mp19は
市販されていてAmersham（Buckinghamshire,England）
から得られる。次に突然変異誘発物質24−merオリゴヌ
クレオチドを一本鎖鋳型にアニーリングし、T4DNAリガ
ーゼの存在下にDNAポリメラーゼのクレノウフラグメン
トにより延長し、突然変異体ヘテロ二重鎖を生成させ
る。
システムはF.Ecksteinらの方法（Nucleic Acids Res.1
3:8765〜8785,1985）に基づくものである。この方法で
はプラークの高収率および95％までの最高の効率が得ら
れる。まず、突然変異を誘発すべきDNAの領域をM13ベク
ター中にクローニングする。このためには、プロアポＡ
−Ｉを有する組換えプラスミドPIN−III−ompA−２のXb
a I−Bal I DNAフラグメントをXba IとHing IIで切断
したM13mp19ベクター中に挿入する。ベクターM13mp19は
市販されていてAmersham（Buckinghamshire,England）
から得られる。次に突然変異誘発物質24−merオリゴヌ
クレオチドを一本鎖鋳型にアニーリングし、T4DNAリガ
ーゼの存在下にDNAポリメラーゼのクレノウフラグメン
トにより延長し、突然変異体ヘテロ二重鎖を生成させ
る。
非突然変異体鎖の選択的除去はin vitro合成時、突然
変異鎖中にチオヌクレオチドを導入し、非ホスホロチオ
ネートのNCi Iによるニツキングによつて可能である。
このようなニツクは、非突然変異体鎖を消化するエキソ
ヌクレアーゼIIIの部位を提供する。突然変異鎖を次に
鋳型として用いて二重鎖環状分子を構築し、ホモ二重鎖
突然変異体分子を作成する。
変異鎖中にチオヌクレオチドを導入し、非ホスホロチオ
ネートのNCi Iによるニツキングによつて可能である。
このようなニツクは、非突然変異体鎖を消化するエキソ
ヌクレアーゼIIIの部位を提供する。突然変異鎖を次に
鋳型として用いて二重鎖環状分子を構築し、ホモ二重鎖
突然変異体分子を作成する。
突然変異誘発はシグナルペプチドの接合部とプロアポ
Ａ−Ｉ遺伝子の最初の配列決定によりチエツクした。組
換えプラスミドpNIV1612はPIN−III−ompA−２ベクター
のXba I−Hind IIIフラグメントを、余分12個の塩基を
予め欠失させたXba I−Bal I DNAフラグメントおよびプ
ロアポＡ−Ｉ遺伝子のBal I−Hing IIIフラグメントと
リゲーシヨンして再構築した。３種のフラグメントをT4
DNAリガーゼでリゲーシヨンし、この混合物を用いて上
述のE.coli JA221コンピーテント細胞を形質転換した。
形質転換体はそのアンピシリン抵抗性によつて選択し、
上述の18−merオリゴヌクレオチドでスクリーニングし
た。形質転換体のひとつは組換えプラスミドpNIV1612を
含有した。最終の構築体はATGコドンをもたない完全プ
ロアポＡ−Ｉ配列に先行するompAシグナルペプチドをコ
ードする配列を有する（第6A、6B、6C図）。次にE.coil
形質転換体についてヒトプロアポＡ−Ｉの発現をアツセ
イした。
Ａ−Ｉ遺伝子の最初の配列決定によりチエツクした。組
換えプラスミドpNIV1612はPIN−III−ompA−２ベクター
のXba I−Hind IIIフラグメントを、余分12個の塩基を
予め欠失させたXba I−Bal I DNAフラグメントおよびプ
ロアポＡ−Ｉ遺伝子のBal I−Hing IIIフラグメントと
リゲーシヨンして再構築した。３種のフラグメントをT4
DNAリガーゼでリゲーシヨンし、この混合物を用いて上
述のE.coli JA221コンピーテント細胞を形質転換した。
形質転換体はそのアンピシリン抵抗性によつて選択し、
上述の18−merオリゴヌクレオチドでスクリーニングし
た。形質転換体のひとつは組換えプラスミドpNIV1612を
含有した。最終の構築体はATGコドンをもたない完全プ
ロアポＡ−Ｉ配列に先行するompAシグナルペプチドをコ
ードする配列を有する（第6A、6B、6C図）。次にE.coil
形質転換体についてヒトプロアポＡ−Ｉの発現をアツセ
イした。
6. ヒトプロアポＡ−I cDNA配列のバクロウイルス中へ
の導入のための輸送ベクターの構築:pNIV1613（第７
図） ヒトプロアポＡ−Ｉ DNA配列を有するプラスミド、p
NIV1613は、クローンpULB9291から誘導されるセグメン
トをバクロウイルスのポリヘドリン遺伝子プロモーター
の下流に置くことにより構築した（第７図）。バクロウ
イルス輸送ベクターpAcRP6（Y.Matsudaほか:J.Gen.Viro
l.67:1515〜1529,1986）を実験に用いた。これはオタワ
大学の微生物および免疫部門から入手できる。このプラ
スミドは、５′リーダー配列中にヌクレオチド−７まで
のポリヘドリン遺伝子プロモーターを有する。これはポ
リヘドリンATGコドンおよびポリヘドリン暗号配列の最
初の170個のヌクレオチドを欠いている。便利なBam I部
位はヌクレオチド−７の下流に位置する。第７図に記載
した構築は以下のように進められる。pAcRP6プラスミド
DNAをBamH Iで線状化した。一方、810bpDNAフラグメン
トをpULB9291から、制限酸素Asp718およびSal Iでの消
化によつて誘導した。このフラグメントはヒトプロアポ
Ａ−Ｉをコードし、ATG翻訳開始コドンを包含する。２
種のフラグメント等モル比をT4DNAポリメラーゼで処理
し、T4DNAリガーゼでリゲーシヨンし、E.coli AR58コン
ピーテント細胞の形質転換に使用した。形質転換体をそ
のアンピシリン抵抗性によつて選択し、アポＡ−Ｉ DN
A配列の部分に相当する32P−標識合成35−merオリゴヌ
クレオチド（第２図参照）でスクリーニングし、制限解
析でチエツクして、プロアポＡ−IDNA配列のポリヘドリ
ン遺伝子プロモーターに対する正しい方向性を確認し
た。形質転換体のひとつが組換えプラスミドpNIV1613を
有し、この条件を満足し、発現実験に使用された。
の導入のための輸送ベクターの構築:pNIV1613（第７
図） ヒトプロアポＡ−Ｉ DNA配列を有するプラスミド、p
NIV1613は、クローンpULB9291から誘導されるセグメン
トをバクロウイルスのポリヘドリン遺伝子プロモーター
の下流に置くことにより構築した（第７図）。バクロウ
イルス輸送ベクターpAcRP6（Y.Matsudaほか:J.Gen.Viro
l.67:1515〜1529,1986）を実験に用いた。これはオタワ
大学の微生物および免疫部門から入手できる。このプラ
スミドは、５′リーダー配列中にヌクレオチド−７まで
のポリヘドリン遺伝子プロモーターを有する。これはポ
リヘドリンATGコドンおよびポリヘドリン暗号配列の最
初の170個のヌクレオチドを欠いている。便利なBam I部
位はヌクレオチド−７の下流に位置する。第７図に記載
した構築は以下のように進められる。pAcRP6プラスミド
DNAをBamH Iで線状化した。一方、810bpDNAフラグメン
トをpULB9291から、制限酸素Asp718およびSal Iでの消
化によつて誘導した。このフラグメントはヒトプロアポ
Ａ−Ｉをコードし、ATG翻訳開始コドンを包含する。２
種のフラグメント等モル比をT4DNAポリメラーゼで処理
し、T4DNAリガーゼでリゲーシヨンし、E.coli AR58コン
ピーテント細胞の形質転換に使用した。形質転換体をそ
のアンピシリン抵抗性によつて選択し、アポＡ−Ｉ DN
A配列の部分に相当する32P−標識合成35−merオリゴヌ
クレオチド（第２図参照）でスクリーニングし、制限解
析でチエツクして、プロアポＡ−IDNA配列のポリヘドリ
ン遺伝子プロモーターに対する正しい方向性を確認し
た。形質転換体のひとつが組換えプラスミドpNIV1613を
有し、この条件を満足し、発現実験に使用された。
7. ヒトプロアポＡ−Ｉの形質転換微生物による製造 pULB9291およびpULB9296でそれぞれ形質転換したE.co
li AR58またはJM101株の20ml培養体を50μg/mlのアンピ
シリンを含有する栄養メジウム中で（LB培地、実験の詳
細についてはT.Maniatisら：前出参照）で、630nmにお
ける光学密度（OD630）が0.6に達するまで生育させた。
pULB9291の場合は、PLラムダプロモーターの誘導は、培
養を初期の生育条件（30℃）から42℃に変化させてPLラ
ムダプロモーターのレプレツサーを不活性化することに
よつて行われた（M.Rosenbergほか:Methods Enzymol.10
1:123〜138,1983）。誘導は20分間実施した。pULB9296
の場合は、lacプロモーターの誘導は37℃で生育させて
いる培養液に化学インデューサーIPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド）を最終濃度1mMになるよう
に添加して行つた（Lorenzettiのほか：前出）。誘導は
60分実施した。他方、pLUB9299で形質転換した酵母細胞
10S44Cの培養体20mlはグルコール（１％）を補給した酵
母窒素ベースメジウム（Difco）中37℃でOD630が0.3に
なるまで生育させた。この特定の場合には発現は構造依
存性でインデューサーは不必要であつた。上記培養液の
サンプル1mlを集めて15,000gで５分間遠心分離した。得
られたペレツトを煮沸したドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）中で次のように溶解させた。ペレツトをSDSサンプル
緩衝液（50mlTris−HCl,pH6.8,2％SDS,6M尿素,5％２−
メルカプトエタノールおよび10％グリセロール）50μ
に再懸濁し、100℃で３分間煮沸した。抽出液を次に15,
000gで10分間遠心分離した。サンプルをそのまま15％ま
たは7.5％SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル上、変性
条件で電気泳動解析に付した（U.K.Laemmli前出）。
li AR58またはJM101株の20ml培養体を50μg/mlのアンピ
シリンを含有する栄養メジウム中で（LB培地、実験の詳
細についてはT.Maniatisら：前出参照）で、630nmにお
ける光学密度（OD630）が0.6に達するまで生育させた。
pULB9291の場合は、PLラムダプロモーターの誘導は、培
養を初期の生育条件（30℃）から42℃に変化させてPLラ
ムダプロモーターのレプレツサーを不活性化することに
よつて行われた（M.Rosenbergほか:Methods Enzymol.10
1:123〜138,1983）。誘導は20分間実施した。pULB9296
の場合は、lacプロモーターの誘導は37℃で生育させて
いる培養液に化学インデューサーIPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド）を最終濃度1mMになるよう
に添加して行つた（Lorenzettiのほか：前出）。誘導は
60分実施した。他方、pLUB9299で形質転換した酵母細胞
10S44Cの培養体20mlはグルコール（１％）を補給した酵
母窒素ベースメジウム（Difco）中37℃でOD630が0.3に
なるまで生育させた。この特定の場合には発現は構造依
存性でインデューサーは不必要であつた。上記培養液の
サンプル1mlを集めて15,000gで５分間遠心分離した。得
られたペレツトを煮沸したドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）中で次のように溶解させた。ペレツトをSDSサンプル
緩衝液（50mlTris−HCl,pH6.8,2％SDS,6M尿素,5％２−
メルカプトエタノールおよび10％グリセロール）50μ
に再懸濁し、100℃で３分間煮沸した。抽出液を次に15,
000gで10分間遠心分離した。サンプルをそのまま15％ま
たは7.5％SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル上、変性
条件で電気泳動解析に付した（U.K.Laemmli前出）。
電気泳動後、ポリアクリルアミドスラブゲルを40mlの
蒸留水および50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）40m
lで軽く洗浄した。タンパク質をゲルからニトロセルロ
ースろ紙上に、同じリン酸緩衝液中、60V,1.5Aで２時間
電気的に処理して移した（T.Cabezonほか：前出）。ニ
トロセルロースろ紙を50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.5）中アルブミン（１％）で飽和し、ついで1/500希釈
ウサギ抗−ヒトアポＡ−Ｉ血清（pULB9296の場合は、マ
ウス抗−β−ガラクトシダーゼモノクローナル抗体）の
存在下、同じであるがアルブミンを含まない緩衝液中、
室温で一夜インキユベーシヨンした。
蒸留水および50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）40m
lで軽く洗浄した。タンパク質をゲルからニトロセルロ
ースろ紙上に、同じリン酸緩衝液中、60V,1.5Aで２時間
電気的に処理して移した（T.Cabezonほか：前出）。ニ
トロセルロースろ紙を50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.5）中アルブミン（１％）で飽和し、ついで1/500希釈
ウサギ抗−ヒトアポＡ−Ｉ血清（pULB9296の場合は、マ
ウス抗−β−ガラクトシダーゼモノクローナル抗体）の
存在下、同じであるがアルブミンを含まない緩衝液中、
室温で一夜インキユベーシヨンした。
ろ紙を同じリン酸塩緩衝液40mlで５回洗浄し、40mlの
リン酸塩緩衝液中、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ウサ
ギ（または抗−マウス）血清（10μg/ml）とインキユベ
ーシヨンした。４時間室温でインキユベーシヨンしたの
ち、ろ紙を40mlのリン酸塩緩衝液で５回再び洗浄し、最
後に50mlの発色原基溶液（10mgジアミノベンゼン、100
μ過酸化尿素（10％）、100mM Tris−HCl,pH7.6）50m
lを加えて発色させた。抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応
する単一の生成物が、pULB9291およびpULB9299の場合に
見出された。その分子量は標準天然アポＡ−Ｉのそれに
一致する。pULB9296の場合は、抗−ヒトアポＡ−Ｉ血清
および抗−β−ガラクトシダーゼ血清と反応する融合ポ
リペプチドが、β−ガラクトシダーゼとプロアポＡ−Ｉ
ポリペプチドを合わせた期待させるサイズ（144kDa）に
見出された。サイズは、細胞エキスと同じゲル上に展開
した分子量標準の移動に基づく検量線によつて決定し
た。
リン酸塩緩衝液中、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ウサ
ギ（または抗−マウス）血清（10μg/ml）とインキユベ
ーシヨンした。４時間室温でインキユベーシヨンしたの
ち、ろ紙を40mlのリン酸塩緩衝液で５回再び洗浄し、最
後に50mlの発色原基溶液（10mgジアミノベンゼン、100
μ過酸化尿素（10％）、100mM Tris−HCl,pH7.6）50m
lを加えて発色させた。抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応
する単一の生成物が、pULB9291およびpULB9299の場合に
見出された。その分子量は標準天然アポＡ−Ｉのそれに
一致する。pULB9296の場合は、抗−ヒトアポＡ−Ｉ血清
および抗−β−ガラクトシダーゼ血清と反応する融合ポ
リペプチドが、β−ガラクトシダーゼとプロアポＡ−Ｉ
ポリペプチドを合わせた期待させるサイズ（144kDa）に
見出された。サイズは、細胞エキスと同じゲル上に展開
した分子量標準の移動に基づく検量線によつて決定し
た。
他の実験では、pNIV1612で形質転換したE.coil株JA22
1の培養液20mlをアンピシリン50μg/mlを補充した栄養
倍地中で（LB培地、T.Maniatisほか、前出参照）、630n
mにおける光学密度が0.6に達するまで生育させた。lac
プロモーターの誘導は、37℃で生育させている培養液に
化学インデユーサーIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド）を最終濃度2mMになるように添加して行
つた。誘導は60分間実施した。培養液のサンプル1mlを
集め、15,000gで５分間遠心分離した。得られたペレツ
トを緩和な浸透圧シヨツクに付し、ペリプラスム分画に
放出させた（D.Koshland ＆ D.Botstein:Cell,20:749〜
760,1980）。放出した分画を上述のSDSサンプル緩衝液
（尿素は含まない）に再懸濁し、遠心分離し、12.5％SD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ついでウ
エスタンブロツト解析を行つた。合成965プロアポＡ−
Ｉの分画は細胞中に見出され、ペレプラズムには認めら
れなかつた。これは、一部のプロアポＡ−Ｉが分泌され
ないかまたは浸透圧シヨツクの効率が至適ではなかつた
たことのいずれかであろう。プロアポＡ−Ｉの主分画は
浸透圧シヨツク後メジウム中に放出され、このタンパク
質が細胞によつて分泌されることを示している。
1の培養液20mlをアンピシリン50μg/mlを補充した栄養
倍地中で（LB培地、T.Maniatisほか、前出参照）、630n
mにおける光学密度が0.6に達するまで生育させた。lac
プロモーターの誘導は、37℃で生育させている培養液に
化学インデユーサーIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド）を最終濃度2mMになるように添加して行
つた。誘導は60分間実施した。培養液のサンプル1mlを
集め、15,000gで５分間遠心分離した。得られたペレツ
トを緩和な浸透圧シヨツクに付し、ペリプラスム分画に
放出させた（D.Koshland ＆ D.Botstein:Cell,20:749〜
760,1980）。放出した分画を上述のSDSサンプル緩衝液
（尿素は含まない）に再懸濁し、遠心分離し、12.5％SD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ついでウ
エスタンブロツト解析を行つた。合成965プロアポＡ−
Ｉの分画は細胞中に見出され、ペレプラズムには認めら
れなかつた。これは、一部のプロアポＡ−Ｉが分泌され
ないかまたは浸透圧シヨツクの効率が至適ではなかつた
たことのいずれかであろう。プロアポＡ−Ｉの主分画は
浸透圧シヨツク後メジウム中に放出され、このタンパク
質が細胞によつて分泌されることを示している。
8. バクロウイルス感染昆虫細胞によるヒトプロアポＡ
−Ｉの製造 組換えプラスミドpNIV1613を野生型バクロウイルスと
ともに用いて、培養液中のSpodoptora frugiperda細胞
を共感染させた。ポリヘドリン欠落組換えウイルスのス
クリーニングにより組換えプラークが得られた。プラー
クから精製された組換えウイルスを用いて昆虫細胞を感
染させた。操作は本技術分野においてよく知られている
とおりで、M.D.Summers ＆ G.E.Smithににより“A Manu
al of Methods for Baculovirus Vectors and Insect c
ell culture Procedures"Texas University,College St
ation（1987）に記載されている。組換えウイルスにつ
いてプロアポＡ−Ｉの産生を、ウエスタンブロツト解
析、および、細胞をRIPA緩衝液（0.15M NaCl,1％Triton
X100,0.1％SDS,0.1％デオキシコール酸ナトリウムおよ
び1mMフエニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）
含有0.05M Tris−HCl緩衝液,pH7.2）で溶解し煮沸ドデ
シル硫酸ナトリウムで処理したのちの12.5％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上電気泳動によつてアツセイした。
抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応する単一の生成物が見出
された。これは、標準天然アポＡ−Ｉのひとつと一致す
る分子量を含有し、発現されたタンパク質が総タンパク
質含量の主成分である。単一ラジアル免疫拡散（G.Manc
iniほか:Immunochem.２:235〜254,1965）によつて測定
したプロアポＡ−Ｉの濃度は培養液１あたりプロアポ
Ａ−Ｉ約100mgであつた。
−Ｉの製造 組換えプラスミドpNIV1613を野生型バクロウイルスと
ともに用いて、培養液中のSpodoptora frugiperda細胞
を共感染させた。ポリヘドリン欠落組換えウイルスのス
クリーニングにより組換えプラークが得られた。プラー
クから精製された組換えウイルスを用いて昆虫細胞を感
染させた。操作は本技術分野においてよく知られている
とおりで、M.D.Summers ＆ G.E.Smithににより“A Manu
al of Methods for Baculovirus Vectors and Insect c
ell culture Procedures"Texas University,College St
ation（1987）に記載されている。組換えウイルスにつ
いてプロアポＡ−Ｉの産生を、ウエスタンブロツト解
析、および、細胞をRIPA緩衝液（0.15M NaCl,1％Triton
X100,0.1％SDS,0.1％デオキシコール酸ナトリウムおよ
び1mMフエニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）
含有0.05M Tris−HCl緩衝液,pH7.2）で溶解し煮沸ドデ
シル硫酸ナトリウムで処理したのちの12.5％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上電気泳動によつてアツセイした。
抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応する単一の生成物が見出
された。これは、標準天然アポＡ−Ｉのひとつと一致す
る分子量を含有し、発現されたタンパク質が総タンパク
質含量の主成分である。単一ラジアル免疫拡散（G.Manc
iniほか:Immunochem.２:235〜254,1965）によつて測定
したプロアポＡ−Ｉの濃度は培養液１あたりプロアポ
Ａ−Ｉ約100mgであつた。
9. ヒトプロアポＡ−ＩのE.coli中細胞質産生。限定最
小メジウムの使用 最小メジウム中E.coliでのヒトプロアポＡ−Ｉの細胞
質産生には、プラスミドpULB9292を使用した。pULB9292
は、PLラムダプロモーターをコードするプラスミドpULB
9291のEcoR I−Nco Iフラグメントを、プラスミドpOTS
（M.Rosenbergほか:Methods Enzymol.101:123〜138,198
3）の同じEcoR I−Nco Iフラグメントで交換することに
よつて構築した。pOTSベクターのEcoR I−Nco Iフラグ
メント（G.Devareほか:Cell,36:43〜49,1984）はまた、
効率的なフアージラムダの調節可能PLプロモーターも含
有する。pULB9292で形質転換したE.coli AR58株の培養
液20mlを限定最小メジウム中で生育させた。最小メジウ
ムの組成（１中）は、3g Na2HPO4・2H2O:3g KH2PO4:
0.5g NaCl;1g NH4Cl;1.37mM MgSO4・7H2O;29.5μM FeCl
3・6H2O;236μM MnSO4・H2O;10gグルコース;1mgビタミ
ンB1;50mgアンピシリン;LB培地1/20（v/v）である。細
胞をこの最小メジウム中でOD630が0.5になるまで生育さ
せた。PLラムダプロモーターの誘導は、培養体の初期の
生育条件30℃を42℃に変えて、PLラムダプロモーターの
レプレツサーを不活性化することによつて実施した（M.
Rosenbergほか：前出）。誘導は60分間実施した。培養
液のサンプル1mlを集め、フレチプレスに通すかまたは1
5,000gで３分間遠心分離した。得られた全細胞エキスま
たはペレツトを§７に記載したと同様にして煮沸SDSで
処理した。電気泳動についでウエスタンブロツト解析後
に、抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応する単一の生成物が
見出された。その分子量は標準天然アポＡ−Ｉのそれと
一致する。限定最小メジウム中に発現したプロアポリポ
タンパク質Ａ−Ｉの量は、総タンパク質含量の13.5％を
示す。すなわち、培養液１中のプロアポＡ−Ｉの濃度
は約270mgと評価された。
小メジウムの使用 最小メジウム中E.coliでのヒトプロアポＡ−Ｉの細胞
質産生には、プラスミドpULB9292を使用した。pULB9292
は、PLラムダプロモーターをコードするプラスミドpULB
9291のEcoR I−Nco Iフラグメントを、プラスミドpOTS
（M.Rosenbergほか:Methods Enzymol.101:123〜138,198
3）の同じEcoR I−Nco Iフラグメントで交換することに
よつて構築した。pOTSベクターのEcoR I−Nco Iフラグ
メント（G.Devareほか:Cell,36:43〜49,1984）はまた、
効率的なフアージラムダの調節可能PLプロモーターも含
有する。pULB9292で形質転換したE.coli AR58株の培養
液20mlを限定最小メジウム中で生育させた。最小メジウ
ムの組成（１中）は、3g Na2HPO4・2H2O:3g KH2PO4:
0.5g NaCl;1g NH4Cl;1.37mM MgSO4・7H2O;29.5μM FeCl
3・6H2O;236μM MnSO4・H2O;10gグルコース;1mgビタミ
ンB1;50mgアンピシリン;LB培地1/20（v/v）である。細
胞をこの最小メジウム中でOD630が0.5になるまで生育さ
せた。PLラムダプロモーターの誘導は、培養体の初期の
生育条件30℃を42℃に変えて、PLラムダプロモーターの
レプレツサーを不活性化することによつて実施した（M.
Rosenbergほか：前出）。誘導は60分間実施した。培養
液のサンプル1mlを集め、フレチプレスに通すかまたは1
5,000gで３分間遠心分離した。得られた全細胞エキスま
たはペレツトを§７に記載したと同様にして煮沸SDSで
処理した。電気泳動についでウエスタンブロツト解析後
に、抗−ヒトアポＡ−Ｉ抗体と反応する単一の生成物が
見出された。その分子量は標準天然アポＡ−Ｉのそれと
一致する。限定最小メジウム中に発現したプロアポリポ
タンパク質Ａ−Ｉの量は、総タンパク質含量の13.5％を
示す。すなわち、培養液１中のプロアポＡ−Ｉの濃度
は約270mgと評価された。
10. 形質転換微生物によつて産生されたヒトプロアポ
Ａ−Ｉの単離、精製および特性 10.1. 単離および精製 組換えプロアポＡ−Ｉの粗エキスを4,000gで15分間遠
心分離して、ペレツトは捨てた。上澄液を100,000gで２
時間遠心分離した。得られたペレツトを、20mM Tris−H
Cl,pH7.5;1mM EDTA;100mM NaCl;1.75μg/mlPMSFおよび1
00μg/mlナトリウムメチルチオレート〔（Ｏ−カルボキ
シフエニル）チオ〕エチルマーキユリーナトリウム塩）
からなる緩衝液（TEN100）の最小容量に懸濁し、この懸
濁液および上澄液の容量を別個に同じ緩衝液で最初のエ
キスの容量に調整した。ついでイソプロピルアルコール
の濃度を増加させていつて、両懸濁液からタンパク質を
沈殿させた。ヒトアポＡ−Ｉ関連免疫活性の主要部分を
含有する各懸濁液の沈殿タンパク質分画をラジアル免疫
拡散（G.Maneiniほか：前出）によつて、市販のアポＡ
−Ｉを標準として測定した。このようにして得られた各
分画をSephacryl S200カラムを通し同じ緩衝液を溶出液
としたクロマトグラフイーによつて精製した。0.9mlの
フラクシヨンを集め、アポＡ−Ｉの免疫活性を有する総
タンパク質量を各フラクシヨンについてのラジアル免疫
拡散で定量した。フラクシヨン中の溶出タンパク質の分
子量は分子量標準、アルドース、ウシ血清アルブミン、
オバルブミン、キモトリプシノーゲンおよびシトクロー
ムC2によつてカラムを検量し、同一条件下で測定を行つ
た。主要な組換えプロアポＡ−Ｉ含有フラクシヨンにお
ける総タンパク質1mgあたりのプロアポＡ−Ｉの純度
は、標準の市販用に製造されているアポＡ−Ｉと同じ免
疫活性を有し、mg単位で発現されたタンパク質の場合、
95％と測定された。
Ａ−Ｉの単離、精製および特性 10.1. 単離および精製 組換えプロアポＡ−Ｉの粗エキスを4,000gで15分間遠
心分離して、ペレツトは捨てた。上澄液を100,000gで２
時間遠心分離した。得られたペレツトを、20mM Tris−H
Cl,pH7.5;1mM EDTA;100mM NaCl;1.75μg/mlPMSFおよび1
00μg/mlナトリウムメチルチオレート〔（Ｏ−カルボキ
シフエニル）チオ〕エチルマーキユリーナトリウム塩）
からなる緩衝液（TEN100）の最小容量に懸濁し、この懸
濁液および上澄液の容量を別個に同じ緩衝液で最初のエ
キスの容量に調整した。ついでイソプロピルアルコール
の濃度を増加させていつて、両懸濁液からタンパク質を
沈殿させた。ヒトアポＡ−Ｉ関連免疫活性の主要部分を
含有する各懸濁液の沈殿タンパク質分画をラジアル免疫
拡散（G.Maneiniほか：前出）によつて、市販のアポＡ
−Ｉを標準として測定した。このようにして得られた各
分画をSephacryl S200カラムを通し同じ緩衝液を溶出液
としたクロマトグラフイーによつて精製した。0.9mlの
フラクシヨンを集め、アポＡ−Ｉの免疫活性を有する総
タンパク質量を各フラクシヨンについてのラジアル免疫
拡散で定量した。フラクシヨン中の溶出タンパク質の分
子量は分子量標準、アルドース、ウシ血清アルブミン、
オバルブミン、キモトリプシノーゲンおよびシトクロー
ムC2によつてカラムを検量し、同一条件下で測定を行つ
た。主要な組換えプロアポＡ−Ｉ含有フラクシヨンにお
ける総タンパク質1mgあたりのプロアポＡ−Ｉの純度
は、標準の市販用に製造されているアポＡ−Ｉと同じ免
疫活性を有し、mg単位で発現されたタンパク質の場合、
95％と測定された。
10.2. 特性 10.2.1. 組換えプロアポＡ−Ｉの特理的特性 N.Catsimpoolasの操作（Anal.Biochem.26:54〜62,196
9）に従つて等電点フオーカシングに付し、pH4〜６の自
己生成勾配を適用した場合は、100,000g（上記10.1）で
遠心分離した。上澄液およびペレツトから単離、精製さ
れた組換えプロアポＡ−Ｉは、単一のバンドを示し、等
電点は4.95と判定された。
9）に従つて等電点フオーカシングに付し、pH4〜６の自
己生成勾配を適用した場合は、100,000g（上記10.1）で
遠心分離した。上澄液およびペレツトから単離、精製さ
れた組換えプロアポＡ−Ｉは、単一のバンドを示し、等
電点は4.95と判定された。
ヒト血漿アポＡ−Ｉはわずかながらもつと酸性を示
し、その等電点は4.75と判定された。組換えプロアポAI
と血漿アポＡ−Ｉの等電点の間のこの0.2pH単位の差
は、血漿アポＡ−Ｉと血漿プロアポＡ−Ｉの間の公知の
等電点の差とよく一致する。この場合の差は0.17と報告
されている（G.L.Millsほか:Lab.Tech.Biochem.Mol.Bio
l.14:244〜245,1984）。
し、その等電点は4.75と判定された。組換えプロアポAI
と血漿アポＡ−Ｉの等電点の間のこの0.2pH単位の差
は、血漿アポＡ−Ｉと血漿プロアポＡ−Ｉの間の公知の
等電点の差とよく一致する。この場合の差は0.17と報告
されている（G.L.Millsほか:Lab.Tech.Biochem.Mol.Bio
l.14:244〜245,1984）。
分子量に関しては、ペレツトおよび上澄液の組換えプ
ロアポＡ−Ｉいずれも同一の分子量を有する１個の単一
ポリペプチド鎖から構成され、その値は29.9±1.4kDaで
あることが明らかにされた。ヒト血漿アポＡ−Ｉの分子
量はわずかに低く、29.3±1.3kDaであつた。
ロアポＡ−Ｉいずれも同一の分子量を有する１個の単一
ポリペプチド鎖から構成され、その値は29.9±1.4kDaで
あることが明らかにされた。ヒト血漿アポＡ−Ｉの分子
量はわずかに低く、29.3±1.3kDaであつた。
10.2.2. BNPS−スカトールによる組換えプロアポＡ−
Ｉのペプチド地図の作成 A.Fontana（Methods Enzymol.25:419〜423,1972）の
操作に従い、３−ブロモ−３−メチル−２−〔（２−ニ
トロフエニル）チオ〕−3H−インドール（BNPS−スカト
ール）による化学的切断を実施した。精製タンパク質プ
レパレーシヨン５〜10μｇを、50％（v/v）酢酸水溶液1
00μに溶解した。ついで氷酢酸1mlあたり4.8mgのBNPS
−スカトールを含む溶液50μを加え、25℃で72時間イ
ンキユベーシヨンした。ついで50μの２−メルカプト
エタノールを添加したのち、２回目のインキユベーシヨ
ンを37℃で３時間行つた。サンプルを蒸発させ、水100
μに再溶解し、酢酸エチル200μで３回抽出した。
有機相を捨て、水相を凍結乾燥して、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で解析した。
Ｉのペプチド地図の作成 A.Fontana（Methods Enzymol.25:419〜423,1972）の
操作に従い、３−ブロモ−３−メチル−２−〔（２−ニ
トロフエニル）チオ〕−3H−インドール（BNPS−スカト
ール）による化学的切断を実施した。精製タンパク質プ
レパレーシヨン５〜10μｇを、50％（v/v）酢酸水溶液1
00μに溶解した。ついで氷酢酸1mlあたり4.8mgのBNPS
−スカトールを含む溶液50μを加え、25℃で72時間イ
ンキユベーシヨンした。ついで50μの２−メルカプト
エタノールを添加したのち、２回目のインキユベーシヨ
ンを37℃で３時間行つた。サンプルを蒸発させ、水100
μに再溶解し、酢酸エチル200μで３回抽出した。
有機相を捨て、水相を凍結乾燥して、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で解析した。
BNPS−スカトールによる化学的切断の場合は、用いた
実験条件によりBNPS−スカトールはトリプトフアン残基
の後を切断するので、アポＡ−Ｉ誘導フラグメントの数
およびサイズはある程度予測できる。各切断部位におけ
る効率を100％と仮定すると、期待される最大のフラグ
メントは15.4kDaのＣ末端フラグメントである。他のフ
ラグメントの分子量は0.5から5.3kDaまでの範囲であ
り、検出するには小さすぎる。
実験条件によりBNPS−スカトールはトリプトフアン残基
の後を切断するので、アポＡ−Ｉ誘導フラグメントの数
およびサイズはある程度予測できる。各切断部位におけ
る効率を100％と仮定すると、期待される最大のフラグ
メントは15.4kDaのＣ末端フラグメントである。他のフ
ラグメントの分子量は0.5から5.3kDaまでの範囲であ
り、検出するには小さすぎる。
不完全切断の場合、15.4kDaフラグメントはＮ末端の
方向に延長され、それぞれ20.7kDa,23.1kDaおよび27.6k
Daのフラグメントを生じることが予想される。これらの
期待は、ヒト血漿アポＡ−Ｉについて、また組換えプロ
アポＡ−Ｉの別の精製プレパレーシヨンについても完全
に実現するものである。
方向に延長され、それぞれ20.7kDa,23.1kDaおよび27.6k
Daのフラグメントを生じることが予想される。これらの
期待は、ヒト血漿アポＡ−Ｉについて、また組換えプロ
アポＡ−Ｉの別の精製プレパレーシヨンについても完全
に実現するものである。
第1A図および第1B図はヒトプレプロアポＡ−Ｉのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を示す模式図である。 第２図はオリゴヌクレオチドアダプターの構築を示す図
である。 第３図、第４図、第５図、第6A〜6C図および第７図は、
それぞれpULB9291,puLB9296,pULB9299,pNIV1612およびp
NIV1613の構築を示す図である。
オチドおよびアミノ酸配列を示す模式図である。 第２図はオリゴヌクレオチドアダプターの構築を示す図
である。 第３図、第４図、第５図、第6A〜6C図および第７図は、
それぞれpULB9291,puLB9296,pULB9299,pNIV1612およびp
NIV1613の構築を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】ヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉをコー
ドする配列からなる組換えDNA配列であって、プロアポ
リポタンパク質Ａ−Ｉのアミノ酸−６から＋14までをコ
ードする天然配列が次の配列（一本鎖のみを示す） ５′−ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTG
GGATAGAGTTAAGGACTTG−３′ で置換され、その配列は付加されたATG翻訳開始コドン
ならびにアミノ酸残基−6,−1,＋1,＋3,＋4,＋5,＋6,＋
7,＋10,＋11および＋14の修飾コドンからなる組換えDNA
配列 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA
配列からなる複製可能なクローニングベクター - 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA
配列からなり、これが調節DNA配列と機能可能に結合
し、翻訳開始および停止シグナルに隣接している発現ベ
クター - 【請求項４】調節DNA配列はフアージラムダPLプロモー
ター領域からなる特許請求の範囲第３項に記載の発現ベ
クター - 【請求項５】ヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ DNA
配列がβ−ガラクトシダーゼDNA配列に下流で融合し、
調節DNA配列はlacプロモーター領域からなる特許請求の
範囲第３項に記載の発現ベクター - 【請求項６】調節DNA配列は酵母ARG3プロモーターと転
写ターミネーター領域からなる特許請求の範囲第３項に
記載の発現ベクター - 【請求項７】ATGコドンを欠くヒトプロアポリポタンパ
ク質Ａ−１ DNA配列をE.coli OmpAタンパク質シグナ
ルペプチドのDNA配列に下流で融合し、調節DNA配列はlp
pプロモーターおよびlacプロモーターオペレーター領域
からなる特許請求の範囲第３項に記載の発現ベクター - 【請求項８】調節DNA配列はバクロウイルスポリヘドリ
ン遺伝子プロモーター領域からなる特許請求の範囲第３
項に記載の発現ベクター - 【請求項９】特許請求の範囲第３項から第８項までのい
ずれか一つに記載の発現ベクターで形質転換された培養
細胞または微生物 - 【請求項１０】特許請求の範囲第９項に記載の形質転換
された細胞または微生物を適当な培養条件下に培養し、
得られたヒトプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉを採取する
ことからなるヒトプロアポリポタンパク質Ａ−１の製造
方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8712540 | 1987-05-28 | ||
| GB878712540A GB8712540D0 (en) | 1987-05-28 | 1987-05-28 | Expression of human proapolipoprotein a-i |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6416589A JPS6416589A (en) | 1989-01-20 |
| JP2634193B2 true JP2634193B2 (ja) | 1997-07-23 |
Family
ID=10618034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63130033A Expired - Fee Related JP2634193B2 (ja) | 1987-05-28 | 1988-05-27 | ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現 |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5059528A (ja) |
| EP (1) | EP0293357B1 (ja) |
| JP (1) | JP2634193B2 (ja) |
| KR (1) | KR970000808B1 (ja) |
| CN (1) | CN1031892C (ja) |
| AT (1) | ATE89006T1 (ja) |
| AU (1) | AU615654B2 (ja) |
| CA (1) | CA1323851C (ja) |
| CY (1) | CY1809A (ja) |
| CZ (1) | CZ283648B6 (ja) |
| DD (1) | DD291093A5 (ja) |
| DE (1) | DE3880739T2 (ja) |
| DK (1) | DK175686B1 (ja) |
| EG (1) | EG19101A (ja) |
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| FI (1) | FI100056B (ja) |
| GB (1) | GB8712540D0 (ja) |
| HK (1) | HK137794A (ja) |
| HU (1) | HU204562B (ja) |
| IE (1) | IE62422B1 (ja) |
| IL (1) | IL86480A (ja) |
| LT (1) | LT3600B (ja) |
| LV (1) | LV5288A3 (ja) |
| NO (1) | NO179253C (ja) |
| NZ (1) | NZ224808A (ja) |
| PL (1) | PL158064B1 (ja) |
| PT (1) | PT87562B (ja) |
| RU (1) | RU2009198C1 (ja) |
| SG (1) | SG131594G (ja) |
| SK (1) | SK279166B6 (ja) |
| SU (1) | SU1834904A3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2606228B2 (ja) * | 1987-09-18 | 1997-04-30 | 三菱化学株式会社 | ヒトプロアポリポプロテインａ−ｉ様蛋白の産生法 |
| EP0345155B1 (en) * | 1988-05-31 | 1994-08-10 | Mitsubishi Kasei Corporation | Process for producing natural human apolipoprotein e-like proteins |
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| US5460961A (en) * | 1988-06-14 | 1995-10-24 | La Region Wallonne | Human myeloperoxidase and its therapeutic application |
| IT1229996B (it) * | 1989-04-20 | 1991-09-20 | Cesare Sirtori | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
| ATE158816T1 (de) * | 1990-11-26 | 1997-10-15 | Genetics Inst | Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung |
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| ATE132269T1 (de) * | 1990-11-30 | 1996-01-15 | Monoclonetics Int | Verfahren zur diagnose chronischer niedriger rückenschmerzen und nackenschmerzen |
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| US5994061A (en) * | 1995-09-29 | 1999-11-30 | Queen's University At Kingston | DNA constructs and methods for screening for increased expression of human apo AI gene |
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| SE9603304D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
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