CZ363888A3 - Způsob výroby proapolipoproteinu A-I lidského původu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynále2 se týká 2působu výroby proapolipoproteinu A-I lidského původu pomocí nových rekombinantních sledil DNA, které obsahují kód pro proapolipoprotein A-I lidského původu, pomocí vektorů pro klonování a expresi, které tuto DNA obsahují a pomocí hostitelských buněk, transformovaných těmito vektory pro expresi.

Dosavadní__stav techniky

Proapolipoprotein A-I (apo A-I) lidského původu je hlavní proteinovou složkou lipoproteinů s vysokou specifickou hmotností (LDH) a chyl omikronů v lymfě. Játra a tenké střevo jsou primárními místy pro syntézu apo-A-I. Tato látka se v uvedených orgánech ^>ne_ systetisuje ve formě bí1kov i nového prekursoru, nazývaného přeproapo A-I. Ke štěpení tohoto preparátu dochásí uvnitř buněk a proapo A-I je pak vylučován do plasmy a lymfy.

Proapo A-I obsahuje navíc šest aminokyselin (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln), které jsou vá2ány na aminoterminální zakončení apo A-I. Jakmile se tato látka dostane do krve, dochá2Í k jejímu rosšťpení b

in vivo specifickým proteolytickým enzymem apo A-Ipropeptidázou za vzniku apo A-I.

Apo A-I je neglykosylovaný polypeptid se známým sledem, který je složen z 243 aminokyselin, r

jak bylo uvedeno v publikaci H.B. Bj^ewer a další, Biochem, Biophys. Res» Commun. 80 (1978), str. 623-630.

Tato látka je kofaktorem pro plasmatický enzym X leeUoi&í-ř· e citinu ohLee-terolacyltransferázu, která je zodpovědná za vznik většiny esterů cholesterolu v krevní plasmě. Při vzniku poruch ve struktuře nebo v biosyntéze spolipoproteinu může dojít také k poruchám v transportním systému plasmatických lipidů a tím i k onemocnění koronárních tepen. Bylo prokázáno, že i když jsou množství apo A-I a LHD v krevní plasmě poměrně nízká, před stavují změny v množství těchto plátek důležité risiko vzniku srdečních krisí (infarktu myokardu) i pro vznik jiných arteriosklerotických onemocnění cév.

Mutace genu, který je kódem pro apo A-I byly spojeny se snížením množství LHD v krjfevi a také se snížením předčasných onemocnění koronárních tepen.

Apo A-I a LHD jsou hlavními složkami, které se v krevní plasmě účastní transportu choleste4 rolu do periferních tkání, zejména do arterií směrem k játrům, což bývá také nazýváno inversním transportem cholesterolu, pro jeho vylučování z organismu. Vzhledem k tomu, že nahromadění cholesterolu v cévní tkání arterií je charakteristickým mechanismem vzniku arteriosklerózy, mělo by být možné stimulací inversního trahsportu cholesterolu působením apo A-I zpomalit nebo léčit arteriosklerotický proces a tím také snížit výskyt srdečních křísí.

štěpení prekursoru proapo A-I na apo A-I může kvantitativně probíhat mimo buňku po dosažení krevního řečiště za dobu kratší než 12 hodin· Vzhledem k tomu, že proapo A-I je hlavním, ne-li jediným prekurso rem zralého apo A-I, bylo by patrně možno tuto látku využít k substituční léčbě ve všech případech, při nichž docházé ke snížení množství LHD, například při vrozených nebo získaných deficiencích této látky. V případě, že by měl být obecně využit apo A-I k léčebným účelům, bylo by zapotřebí navrhnout způsob, jímž by tuto látku bylo možno získat ve velkých množstvích. Až dosud se uvedená látka získávala čištěním apo A-I z krevní plasmy.

V celé řadě publikací, například P. Cheung a L. Chán, Nucleic Acids Res. 11 (1983), 3703-3715, J.J.Seilhammer a další, DNA 3 (1984) 309-317 a v japonské patentové přihlášce č.96 998/86 bylo prokázáno, že je možno připravit komplementární DNA, která je kódem pro preproapo A-I způsoby, kterých se používá v genetickém inženýrství .

R. Lorenzetti a další v FEBS Lett. 194 (19S6) 343-346 ukázali, že je možno dosáhnout exprese apo A-I v E. coli ve formě bílkoviny, která je vázána na β-galaktosidáfcu a není odštěpitelná. Až dosud pak byly snahy o expresi zralé bílkoviny apo A-I, nenavázané na další látku neúspěšné·

V japonské patentové přihlášce č.

998/86, uvedené svrchu se popisuje exprese bílkoviny, která je podobná apolipoproteinu A-I lidského původu. K expresi došlo v E. coli, která byla transformována při použití plasmidu pHAIE-I, obsahujícího gen se strukturou genu pro apo A-I pod řízením promotoru tac. Struktura uvedeného genu však nebyla úplná, gen sestával z kodonů pro aminokyseliny +4 až +243, tyto kodony předcházel kodon ATG pro počátek translace. V důsledku toho obsahoval získaný produkt exprese N-terminální methionin ( odpovídající kodonu ATG), který může vyvolat vznik sekundárních účinků v případě, že by tato látka byla použita k léčbě.

V publikaci J.B· Mallory a další, J· Biol. Chem. 262 (1987) 4241-4247 a v patentových spisech PCT WO 86/04920 a WO 87/02062 se popisuje exprese lidského apolipoproteinu A-I v ovariálních buňkách čin ského křečka ( tkáňová kultura). Při použité konstruk. ci bylo využito úplného genu pro asa preproapolipoprotein A-I lidského původu. Ovariální buňky čínbého křeč ka jsou pravděpodobně schopné transformovat prekursor na zralý apo A-I, protože pouze 5 až 10 % vylučované bílkoviny uvedeného typu je profr&o-A-I, kdežto zbytek je zralá bílkovina apo A-I· Produktivita získaného sys tému je však poměrně velmi nízká, protože množství o

0,5 x 10° buněk vyloučí pouze 25 až 30 ^ug/ml apo A-I v průběhu 24 hodin. V patentovém spisu PCT WO č. 87/02062 se několik příkladů provedení vztahuje k expresi apolipoproteinu A-I lidského původu v buňkách jiných hostitelů, například v buňkách bakterií ( E. co li), v buňkách kvasja^c^ ( cerevisiae) a podobně·

Přesto však ani v jedné ze svrchu uvedených konstrukcí nebylo použito informace pro formu proapo a proteinem, k jehož expresi došlo, nebyl v žádném z uvedených případů lidský proapolipoprotein A-I.

Vynález se týká prostředků a metod pro získání lidského proapolipoproteinu A-I použitím rekombinantní DNA tak, aby byl získán zralý.proapo A-I, který je možno štěpit specifickým proteolytickým enzymem apo A-I propeptidázou· Pod pojmem *' zralý se v průběhu přihlášky nerozumí pouze lidský proapo A-I jako takový, nýbrž také odpovídající bílkovina, v níž je první aminokyselinou methionin, jehož přítomnost je důsledkem použití iniciačního kodonu ^TG pro počátek translace při konstrukci vektoru pro expresi.

Vynález se rovněž týká konstrukce vektorů pro klonování a pro expresi, které obsahují sled SNA, který je kódem pro proapo A-I lidského původu tak, že získaná konstrukce umožňuje amplifikaci a v důsledku toho také sxlxasi expresi zralého lidského proteinu proapo A-I, jakož i met-proapo A-I, přičemž takto získané látky mohou být konjugovány fúzí nebo mohou být konjugovány s N-terminálním signálem. Vynález s·^ rovněž t ř ř p ř r

- 8 rovnňfc využívá životaschopných tkáňových kultur, různých buněk nebo mikroorganismů, které byly geneticky pozměněny včleněním svrchu uvedených vektorů a jsou proto schopny produkovat lidský polypeptid proapo A-l. Mimo to by mělo být způsobem podle vynálezu možno získat uvedenou látku v poměrně čistém stavu bez dalších bílkovin, jeko je tomu při izolaci z přírodního prostředí. Vzhledem ke specifickému způsobu přípravy je tedy možno získat lidský proapo A-I, který je v podstatě prostý obvyklých endogenních bílkovin a jiných materiálů obvykle obsažených při jiných způsobech výroby.

Vynález se tedy týká způsobu výroby proapo A-I lidského původu při použití techniky s rekombinantní DNA. Tento způsob není omezen na specificky popsané příklady, které ho toliko objasňují.

Podstata vynálezu

Způsob výroby proapolipoproteinu A-I lidského původu spočívá podle vynálezu v tom, že se 1) pěstuje za příslušných podmínek buněčná kultura nebo mikroorganismus ze skupiny E. coli, Saccharomyces cerevisiae nebo buněk Spodoptera frugiperda, transformovaný vektorem pro expresi, který obsahuje řetězec rekombinantní DNA, který je kódem pro lidský proapolipoprotein A-I, vázaný operativním způsobem na řídící sled DNA a zavzatý mezi signály pro iniciaci a pro ukončení translace, přičemž ve sledu řetězce rekombinantní DNA, který je kódem pro lidský apolipoprotein A-I, je vypuštěn fragment přírodního kódového řetězce pro aminokyseliny -6 až +14 a je nahrazen fragmentem DNA

-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3 který je kódem pro tytéž aminokyseliny, přičemž tento sled obsahuje navíc iniciační kodon ATG a modifikované kodony pro aminokyseliny v polohách -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 a +12, ř *

- r f » * ♦ ř » ř ř · · » » # · · s» r » · ř ♦ ř * F ř ♦ · · · ···

- 8 jící mž doohásí ke snížení nebo vyloučení tvorby struktur s dvojitým řetězcem a 2) takto získaný lidský apolipoprotein A-I se izolu j e.

Podstatou vynálezu je tedy způsob výroby bílkoviny, která sestává ze zralého proapo A-I lidského původu nebo tuto látku obsahuje, přiéemž tuto látku je možno převést in vitro nebo in vivo na zralý lidský apo-A-I působením proteolytických en-

zymů, zejména apo A-I-propeptidázy. Produkt této reakce, kterým je lidský proapo A-I je možno využít jako také met-proapo A-I vzhledem k tomu, že přítomnost methionylového zbytku je z farmaceutického hlediska přijatelná, protože tento produkt je možno převést za přírodních podmínek a s velkou účinností v krevním oběhu působením přírodní propeptidázy na autentický zralý lidský apo A-I. Je-li to žádoucí, je možno získat lidský proapo A-I v mikroorganismech nebo ve zvolených tkáňových kulturách buněk, které jsou schopné odstraňovat methionin na N-terminálním zakončení a v důsledku toho i produkovat lidský proapo A-I ve formě, která již neobsahuje N-terminální methionin. Je také možno postupovat tak, že jak v případě, že tato látka obsahuje Nterminální methionin, tak v případě, že jej neobsahuje, může být lidská proapo A-I in vitro rozštěpen za získání zralého lidského apo A-I, který je možno využít k léčebným účelům. Stejně v případě, že je tato látka konjugována fúzí a konjugát obsahuje N-terminální signál proapo A-I, je možno štěpením získat autentický lidský apo A-I, prostý N-tern.inálního methioninu.

Další důležité hledisko způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se jako kódpro alespoň část molekuly lidského proapo A-I úžiije modifikovaného kódového sledu. Tanto modifikovaný sled, který je Kódem pro uvedenou látku zlepšuje účinnost translace vzhledem k tomu, že snižuje nebo úplně zabraňuje vzniku struktury s dvojitým řetězcem. Ja pravděpodobné, že R. Lorenzetti a další v publikaci FEBS Letters 194 (1986) 343-346 nemohli pozorovat expresi zralé bílkoviny apo A-I bez fúze proto, že jejich konstrukce DNA vytvářela struktury s dvojitým řetězcem, což mohlo vést k neúčinné expresi. Bylo s překvapením zjištěno, že je možno dosáhnout účónné exprese tak, že se provede příslušná modifikace některých kodonů ve sledu, který je kódem pro aminokyseliny -6 až +14 řetězce proapo A-I. Pojem ” příslušná modifikace , tak jak je zde používán znamená, že se některé z přírodních kodonů v uvedené oblasti nahradí jinými kodony, které jsou podle genetického kódu kódem pro tytéž aminokyseliny, přičemž mimoto všech ny takto provedené modifikace ve svém celku vedou ke snížení nebo dokonce k potlačení možnosti vzniku struktury s dvojitým řetězcem. Je také důležité, že všechny uvedené modifikace nemají naprosto žádný vliv na mís11 to, v němž je uvedená látka štěpena enzymem propeptidázou, protože místo v řetězci DNA, kde se uvedené změny provádějí jsou uskutečněny na jiném místě, takže sled aminokyselin, vytvářející místo působení enzymu zůstává zachován.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat proapo A-I lidského původu jako produkt buněčné kultury nebo geneticky modifikovaného mikroorganismu. Tento proapo A-I lidského původu může být získán jako zralý proapo A-I, ve formě proapo A-I, před nímž je uložen zbytek methioninu, ve formě složené bílkoviny, k kterou může být například beta-galaktosidáza-proapo A-I a ve formě sloučeniny preproapo A-I. Takto získaný produkt je v podstatě prostý obvyklých endogenních bílkovin a dalších látek, které se obvykle vyskytují v materiálech získaných z přírodních zdrojů, jako je krevní plasma v případě svrchu získávané bílkoviny. Tkáňové kultury pro toto použití nebo mikroorganismy, využívané k produkci uvedených látek nejsou omezeny na použité buněčné linie nebo na specifické organismy.

K uvedenému účelu je možno použít jak buňky eukaryotických, tak buňky prokaryotických organismů, což znamená c

i možnost použití živočišných a lidských buněčných linií» Pouze jako příklad je možno uvést možnost exprese v mikroorganismu Escherichia coli ( jako představitel prokaryotických buněk), dále kvasinky saccharomyces cerevisiae a také hmyzí buňky, infikované bakulovirem jako representanty eukaryotických buněk·

Na bílkovinné úrovni se vynález týká způsobu výroby apo A-I lidského původu, který je možno získat tak, že se působí na proapo A-I lidského původu enzymem^ apo A-I-propeptidázou. Takto získaný apo A-I z lidského proapo A-I, získaného způsobem podle vynálezu je identický s autentickou formou zralého, lidského apo A-I a je také prostý methininového zbytku na N-terminálním zakončení·

Pokud jde o použití takto získaných látek, je možno proapo A-I, lidského původu, získaný způsobem podle vynálezu a/nebo lidský apo A-I zpracovat na farmaceutické prostředky, které budou kromě svrchu uvedených účinných látek obsahovat ještě alespoň jeden nosič, přijatelný z farmaceutického hlediska, rozpouštědlo, ředidlo a podobně podle předpokládaného způsobu podání a podle pomocných látek, obvykle ve framacii k uvedenému účelu užívaných·

Na úrovni DNA se vynález týká získání rekombinantního sledu DNA s obsahem řetězce, který je kódem peo lidský proapolipoprotein A-I, v němž byla část přirozeného kódového sledu pro tuto látku nahrazena fragmentem DNA, který je kódem pro tytéž aminokyseliny jako přírodní sled, avšak sestává z odlišného sledu nukleotidů tak, aby byla snížena nebo zcela vyloučena tvorba struktur s dvojitým řetězcem. Podle jednoho z velmi výhodných provedení se přírodní sled, který je kódem pro aminokyselina v polohách - 6 až +14 v proapo A*I nahradí následujícím sledem:

5-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3* přičemž tento sled obsahuje navíc iniciační kodon ATG pro translaci a modifikované kodony pro zbytky aminokyselin a polohách -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 a +14·

Vynález se rovněž vztahuje k získání vektorů pro klonování s obsahem uvedené rekombinantní DNA a vektorů pro expresi, které obsahují svrchu uvedený sled, který je kódem pro lidský proapo A-I· Vynález se zvláště týká způsobu získání rekombinantních plasmidů pULB9292, pULB929l/pULB9296, pULB9299, pNIV1612 a pNIV1612, jejichž konstrukce bude dále popsána· První z uvedených plasmidů, pULB9291 a pULB9292 obsahují gen s modifikovanou strukturou genu pro proapo A-I, před nímž se nachází kodon ATG pod řízením promotoru P^ z fágu lambda. Tyto plasmidy jsou vektory pro expresi, které je možno použít v případě E. coli a které řídí syntézu lidského proapo A-I, který může být štěpen propeptidázou za vzniku zralého lidského apo A-I v autentické formě. V případě, že se tento plasmid včlení do E. coli řídí plasmid pULB9296 expresi bílkoviny, která je vázána na beta-galaktosidázu pod řízením oblastí lac promotoru z E.coli. Vzhledem k tomu, že takto získaný produkt, obsahující lidský proapo A-I a beta-galakfcostiázu obsahuje také řetězec, v němž dochází ke štěpení působením propeptidázy, je možno jej rozštěpit za vzniku zralého autentického lidského SBpxAxžx apo A-I.

Plasmid pULB9299 je vektor pro expresi, který je vhodný pro použití u kvasinek a obsahuje oblasti promotoru a terminátoru transkripce pro zajištění účinné exprese u kvasinek. Takto získaný lidský proapo A-I je opět možno rozštěpit působením propeptidázy a získat tak zralý autentický lidský apo A-I.

Jako terminátoru transkripce se v případě kvasinek s výhodou užije ARG3 k zajištění účinné exprese·

Plasmid pNIV1612 obsahuje gen pro strukem turu proapo A-I, spojeného se sledem DNA signálního peptidu pro bílkovinu OmpA z E. coli pod řízením promotoru lpp ( lipoprotein) a promotoru operátoru lac. V této konstrukci předchází sled, který je kódem pro signální peptid OmpA sled pro proapo A-I bez kodonu ATG pro počátek translace. Plasmid je příslušným vektorem pro sekreci pro E. coli a řídí syntézu lidského proapo A-I, který může být vylučován do periplasmatu bez ts N-terminálního methioninového zbytku. Plasmid pNIV1613 je vektor pro,přenos a včlenění sledu DNAc pro proapo A-I lidského původu do bakuloviru. Obsahuje polyhedrinový promotor bakuloviru a gen, který je kódem pro strukturu proapo A-I a obsahuje kodon ATG pro počátek translace. Ve spojení s kmene, který je zdrojem bakuloviru (Autographa californica polyhdrosis virus, AcNPV) řídí plasmid pNIV1613 syntézu proapo A-I v buňkách hmyzu a vzhledem ke změnám, k nimž dochází v hmyzích buňkách je možno jej tímto způsobem získat bez N-terminálního methioninového zbytku.

Vynález se konečně také týká způsobu získávání buněčných kultur a mikroorganismů, které byly transformovány vektorem pro klonování nebo vektorem pro expresi, tak jak byly svrchu popsány, vynález se zvláště týká způsobu pěstování buněčných kultur a mikroorganismů, transformovaných a schopných produkovat proapo A-I lidského původu. Pod pojmem transformovaný , tak jak je v průběhu přihlášky používán se rozumí v širokém smyslu organismus geneticky modifikovaný, takže není účelem přihlášky se omezit pouze na úzký pojem bakteriální transformace. Podle povahy použitého vektoru a podle zvoleného hostitele je možno použít jakoukoliv vhodnou techniku, která se v současné době v oboru genetiky používá, jako je například, transfekce, transdukce a podobně.

Kultury buněk mikroorganismů které byly získány způsobem podle vynálezu je možno využít k produkci proapolipoproteinu A-I lidského původu tak, že se uskuteční fermentace pozměněných mikroorganismů v průmyslovém měřítku.

Účelu, který si vynález klade za úkol je zásadně možno dosáhnout také při použití různých kmenů mikroorganismů, například kmene MM 294 mikroorganismu E. coli K12 ( endoA thi, hsdR, supE); tento kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection ( ATCC č. 33 625) kde je k disposici bez omezení, pokud jde o jeho dostupnost. Je však možno využít ještě další mikrobiální kmeny, například některé známé kmeny E. coli, jako E. coli B, E, coli x 1776 f (ATCC č. 31537, kmen uložen 3. července 1979, dostupný bez omezení), dále E. coli AR5S, který je odvozený od kmene N99 ( ATCC č. 33956) s clil, cl 857, bio* funkce delta H-zbavený lambda ( dodává PL-Pharmacia), mikroorganismus byl popsán v publikaci J.E. Mott a další, Proč, Nati, Acad. Sci USA 82 (1985),88-92, G.Devare a další, Cell 36, (1984), 43-49, dále je možno užít kmen

E. coli JM101 ( ATCC č. 33876), popsaný v publikaci Messing a další, Nucleic Acids Res 9 (1981), 309-321 nebo E. coli JA221 (lpp, hdsM⁺, trpE5, leuB6, lacY» recAI/F*, láci, lac*, pro*), tento kmen byl popsán v publikaci J. Ghrayeb a další, EMBO J· 3. (1984), 24372442 nebo ještě další mikrobiální kmeny, jichž byla řada uložena do sbírek a jsou dostupné v různých veřejných sbírkách mikroorganismů, jako například sbírka American

Type Culture Collection (ATCC), která vydává katalogy mikroorganismů, které v ní jsou uloženy, Z dalších mikroorganismů by bylo možno uvést například některé Bacilli, například Bacillus subtilis a další Enterobacteriaceae, z nichž je možno uvést například Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescens, u nichž je možno dosáhnout replikace a exprese řetězců heterologních genů,

Plasmidy pro expresi pro použití u bakterií, například v případě E. coli se obvykle získávájí tak, že se vychází z plasmidu pBR322, který se užije jako vektor ( je uložen ve sbírce ATCC pod číslem 37017) a do tohoto plasmidu se pak včleňují příslušným způsobem sledy heterologních genů a současně také signálý pro počátek a ukončení translace v příslušné fázi s funkčním promotorem, přičemž se využívá výhod přítomnosti přirozeně se vyskytujících míst pro působení restrikčních enzymů nebo se taková místa syntheticky vytvoří. Vektor může nést jeden nebo větší počet genů, které jsou charakterizovány svým výběrem fenotypu a počátkem replikace pro zajištění amplifikace v buňkách hostitele, Heterologní včleněný sled je možno uložit tak, aby docházelo k jeho expresi současně s předběžným sledem, s nímž je požadovaný sled spojen, jako je tomu například v případě genů systému lac·

Vektory pro expresi pro bakulovirus, například plasmidy pAcRP6 nebo pAcYMl, popsané v publikaci Y. Matsuura a další, J. Gen. Virol. 68 (1987), 1233-1250 a pro Autographa californica nuclear polyhedrosis virus ( AcNPV) je rovněž možno široce použít· Tyto vektory jsou podrobně popsány v literatuře a je možno je získat z Texas Agricultural Experiment Stati on·

Při provádění způsobu podle vynálezu je možno jako hostitelských buněk pro kompatibilní vektory využít také různých hmyzích buněk, například buněk Spodoptera frugiperda Sf9, popsaných v publikaci M.D. Summer a G.E. Smith: A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas University College Station ( 1987)· Kmen byl uložen jako ATCC CRL 1711.

Při provádění způsobu podle vynálezu je rovněž možno využít vektorů pro expresi, které jsou kompatibilní s různými kmeny kvasinek, například plasmid YRp7, popsaný v publikaci D.T.Stinchcomb a další, Nátuře 282 (1979), 39-43, který je schopný selekce a replikace v E· coli i v kvasinkách, zejména v Saccharomyces cerevisiae.

Kvasinkové kmeny, které je možno k uvedeným účelům použít jsou kmen RH218, popsaný v publikaci G. Miozzari a další, J. Bacteriol, 134 (1978) 48-59, který byl uložen do American Type Culture Collec tion bez omezení pod číslem ATCC 44076, dále kmen 10S44c, popsaný v publikaci T. Cabezon a další, Proč, Nati. Acad. Sci USA, 81 (1984), 6594-6598, který je genotypem leu2-3, leu2-112, pep4-3 a byl popsán v publikaci M. Hoylaerts a další, FEBS Lett. 204 (1986), 83-87 a dále kmen Ic 1697d ( argJ, leu2-l), bradytrofní pro arginin ( ATCC 20 631).

V případě, že je zapotřebí dosáhnout exprese heterologního genu, jako je DNAc pro proapo A-I lidského původu v buňkách kvasinek, je zapotřebí zkonstruovat vektor, kterým je obvykle plasmid s obsahem čtyř složek.

První složkou je fragment, který dovoluje transformaci jak E. coli, tak kvasinek a který proto musí obsahovat gen pro selekci, původem z každého £ z těchto organismů. Může to být gen pro odlnost proti ampicillinu z E. coli ( AmpA) a gen leu2 z kvasinek. Pak vyžaduje uvedená konstrukce ještě počátek repli21 kace, původem z každého z uvedených organismů,který je možno zachovat jako plasinidovou DNA v obou uvedených organismech. Může jít o počátek z E. coli z plasmidu pBR322 a o počátek arsl z chromosomu III kvasinek nebo o počátek pro replikaci cirkulárního typu DNA 2 /U.

Druhou složkou plasmidu sled, uložený v poloze 5*kvasinkového genu, u něhož dochází k silné expresi za uskutečnění transkripce genu se strukturou, uloženou za ním. Sledem, uloženým v poloze 5*může být sled z genů TDH3 nebo ARG3 z kvasinek. Fragment se sestrojí tak, že dojde k vynechání řetězců ze struktury genů TDH3 nebo ARG3, přičemž tyto řetězce se nahradí řetězci, které obsahují alternativní místa pro působení restrikčních enzymů, například pro restrikční enzymy Ncol nebo BamHI, takže je možno snadno zapojit tento řetězec do polohy 5*ve struktuře svrchu uvedeného genu.

Třetí složkou uvedené konstrukce je gen, jehož struktura je zkonstruována tak, že obsahuje současně signál ATG pro počátek translace a signál pro ukončení této translace.

Čtvrtou složkou svrchu uvedené konstrukce je řetězec DNA kvasinky, který obsahuje sled, uložený do polohy 3*genu kvasinky a obsahuje příslušné signály pro ukončení transkripce a pro polyadenylaci. Nq příklad plasmidy, které řídí produkci proapo A-I lidského původu v kvasinkách mohou být konstruovány tak, že se fragmenty genu pro polypeptid proapo A-I lidského původu uloží do místa pro působení restrikčního enzymu BamHI plasmidu pRIT -prBxwyp.KS. 10774 pro expresi, který byl popsán v evropském patentovém spisu č.151102,

Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkres^ a také v souvislosti s popisem výhodných provedení způšobu podle vynálezu, zejména pokud jde o konstrukci vektorů a rekombinantní DNA·

Na obr. IA a LB je znázorněn nukleotidový sled a řetězec aminokyselin pro lidský preproapoA-I. Nukleotidový sled pro m-RNA lidského preproapo A-I byl zjištěn na základě ana lyzy sledů DNA a cDNA klonu pULB1609. Aminokyseliny jejichž přítomnost je předpokládána v signálním peptidu, propetidu a vlastním úplném polypeptidu apo A-I jsou uvedeny a označeny od prvního zbytku aminokyseliny bílkoviny apo A-I. Podtržena je oblast, která odpovídá syntetické sondě DNA, která byla užita pro izolaci uvedeného klonu.

Byly užity následující jednopísraenové zkratky pro označení aminokyselinových zbytků: A-alanin, C-cystein, D-kyselina asparagová, E-kyselina glutamová, F-fenylalanin, G-glycin, H-histidin, I-isoleucin, K-lysin, L-leucin, M-methionin, N-asparagin, P-prolin, Q-glutamin, R-arginin, S-se/rin, T-threonin, V-valin, W-tryptofan a Y-tyrosin,

Na obr. 2 je znázorněno schéma pro syntézu oligonukleotidového řetězce, který byl užit pro konstrukci fragmentu DNA, který je kódem pro 6 aminokyselin propeptidu a pro prvních 14 aminokyselin úplného oolypeptidu apo A-I spolu s iniciačním kodonem

v

< m

ATG. Jsou označeny oligonukleotidy, užité pro syntézu fragmentu Ncol-Ball s 65/61 páry bázi (pb).

Na obr. 3 je znázorněna konstrukce plasmidu pULB9291, který obsahuje řídící oblasti P_L lambda a nukleotidový sled pro proapo A-I.

Na obr. 4 je znázorněna konstrukce plas midu pULB9296, který obsahuje promotor lac z E. coli a nukleotidový sled, který je kódem pro β-galaktosidázu,spojený se sledem pro proapo A-I.

Na obr. 5 je znázorněna konstrukce plas midu pULB9299, který obsahuje řídící oblasti ARG3 kvasinek a mimoto nukleotidový sled pro prcqoo A-I.

Na obr. 6A, 6B a 6C je znázorněna tonstrukce plasmidu pNIV1612, který obsahuje řídící oblasti lac a lpp, dále kódový sled pro signální peptid ompA a nukleotidový sled pro proapo A-I.

Na obr. 7 je znázorněna konstrukce plas midu pNIV1613, který obsahuje řídící oblast polyhedrinového genu a nukleotidový sled, který je kódem pro proapo A-I.

Příprava RNA

Celková RNA z lidských jater se připraví způsobem s použitím guanidiniumchloridu, popsaným v publikaci Cox R.A., Methods Enzymol. XII, část B (1968), 120-129. Takto získaná RNA se pak nechá projít sloupcem s obsahem oligo(dT)-cellulozy k získání celkové polyA RNA způsobem podle publikace Maniatis a další, Molecular Cloning ( Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, New York 19S2). Z 10 g lidských jater je tímto způsobem možno lískat 200 ^ug celkové polyA⁺RNA.

Syntéza komplementární DNA (cDNA) in vitro

Reversní transkripce se při použití 0,1 až 5 /Ug polyA RNA zahájí při použití přibližně 1 /Ug oligo(dT)₁₂„ig (Boehringer), Získaná cDNA s jedním řetězcem se pak transformuje na cDNA s dvojitým řetězcem (cdbDNA) působením enzymu reversní transkriptázy. Vzorky této látky v množství přibližně 1 /Ug se zpracovávají působením S1 nukleázy k získání vazných zakončení. Tento postup je v oboru dobře znám a byl podrobně popsán v publikaci T. Maniatis a další, tak jak byla svrchu uvedena. Pak se na tato volná zakončení naváže oligo(dC) způsobem, popsaným v publikaci

Villa-Komaroff a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1978), 3727-3731. Obvykle se působí na 10 ng cdbDNA enzymem deoxynukleotidyltransferázou (terminální). Na 3-zakončení molekuly cdbDNA se naváže obvykle zbytek o délce 15 baží.

Klonování cdbDNA s vaznými zakončeními v plaanidu pBR322

DNA plasmidu pBR322 se linearizuje působením enzymu Pstl a zakončení se vyplní oligo(dgí způsobem podle publikaceLawn R.M. a další, Nucleic Acids Res. 9_ (1981), 6103-6114. Pak se cdbDNA s vaznými zakončeními oligo(dC) smísí v ekvimolekulárním poměru s DNA z plasmidu pBR322 s vaznými zakončeními oligo(dG).

Obvykle s k recirkularisaci plasmidu hybridizuje 50^ug směsi. Podmínky této reakce jsou v oboru dobře známy a byly podrobně popsány v publikaci R.M. Lawna, tak jak byla svrchu uvedena. Hybridi začni směs se pak užije k transformaci příslušných buněk kmene MM294 E. coli, například způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci R.M. Lawna a dalších. Selekcí pěstováním na prostředí s obsahem tetracyklinu je možno získat několik stovek transformantů, odolnost proti tomuto antibioti27 ku je vlastní Ν» plasmidu pBR322, Transformanty byly rovněž zkoušeny na svou citlivost proti ampicilinu·

Ty, které byly citlivé, obsahují chimérní plasmid, takže včleněni cizorodé DNA do vektoru inaktivuje gen pro odolnost proti ampicilinu.

Třídění získané sestavy eDNA.

Transformanty E. coli byly tříděny při použití synthetických oligonukleotidů a označeny na svém 5-zakončení pbmocí ' P, zakončení odpovídá fragmentu genu pro apo A-I. Sled nukleotidů peo apo A-I lidského původu je znám například ze svrchu uvedených publikací Cheunga a Chana a také J.J. Seilhamera a dalších a je tedy v důsledku toho možné jej chemicky synthetizovat způsobem, popsaným v publikaci N.Sinha a další, Nucleic Acids Res. 12 (1984), 4539 - 4557 ve formě nukleotidové sondy, která obsahuje 22 baží, odpovídajících 5-zakončení uvedeného genu. Vybraný řetězec má následující sled: 5-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG-3C Před použitím k hybridizaci byl synthetický oligonukleotid fosforylován na svém 5-zakončení působením T4polynkuleotidkinázy ( P-L Biochemicals) a (gamma P)ATP.

Podmínky pro značení a hybridizaci jsou v oboru známy a byly podrobně popsány ve svrchu uvedené publikaci T. Maniatise a dalších a v publikaci A. Bollen a další, DNA 2 (1983), 255-264.

Konstrukce plasmidů pro expresi

Způsoby výroby DNA, izolace fragmentů DNA, jakož i podmínky analyzy působením restrikčních enzymů a podmínky navázání fragmentů jsou v oboru známy a byly podrobně popsány v publikacích R.M.Lawna a dalších a T, Cabezona a dalších, tak jak byly svrchu uvedeny a je možno je v tomto případě použát.

Dále bude popsána syntéza fragmentů pro vazbu promotoru vektorů pro extresi na 5-zakončení genu.

Syntéza fragmentu Ncol-Ball·

Na obr. 2 jsou podrobně popsány principy, které jsou podkladem pro oligonukleotidy s obsahem 35, 30, 18 a 43 baží kterých se užívá při syntéze fragmentu Ncol-Ball s 65/61 pb, Synthetické fragmenty s a 18 bázemi se na svých 5-zakončeních fosforylují působením enzymu T4-polynukleotidkinázy ( P-L Biochemicals). Pak se 1 ^ug každého oligonukleotidu včetně oligonukleotidů a 35 a 43 bázemi, které nejsou fosforylovány hybrídizuje 3 minuty při teplotě 95° C ve 300 mM octanu sodném o pH 7,0, načež se séěs nechá pomalu zchladnout na teplotu 4° C. Pak se hybridizační směs užije jako taková v průběhu klonování pro konstrukci plasmidů pro expresi.

Zjištění sledu DNA

Analýza sledu DNA byla prováděna způsobem, popsaným v publikacích Α·λί, Maxam a W. Gilbert Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-564 a

F. Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463 - 5467»

Analýz a bílkovin

Usazeniny buněk s hustotou 1 jednotky při 630 nm ( 1 0Dg_3Q)se získají v různých stupních v průběhu fermentace kmenů, které obsahují plasmidy pro expresi proapo A-I lidského původu, pULB9291, pULB9292, pULB9296 a pULB9299 (užité k transformaci kmenů AR58 a JM101 E. coli a kmene 10S44c kvasinek). Každý vzorek se znovu uvede do suspenze v pufru 50 mM tris-HCl o pH 6,8 s obsahem 2 % dodecylsíranu sodného (DSS), 6 M močoviny, 10 % glycerolu a 5 % 2-merkaptoethanolu, směs se zahřeje na 3 minuty na teplotu varu, načež se vzorky podrobí elektroforéze na polyakrylamidovém gelu podle publikace U.K Laemmli, Nátuře 227, (1970), 680 - 685. K detekci bílkovin se užije coomasiová modr a synthetizovaný proapo A-I lidského původu se identifikuje po elektroforetickém přenosu imunologicky ( A. Bollen a dala, svrchu).

Konstrukce rekombinantních vektorů pro expresi proapo A-I lidského původu v bakteriích, kvasinkách a v buňkách hmyzu, infikovaného bakulovirem.

1. Klon cDNA pro lidský preproapo A-I: pULB1609 (obr.l).

Několik stovek transformantů, získaných klonováním cdbDNA, odpovídající polyA⁺RNA z lidských jater, v místě po štěpení enzymem Pstl plasmidu pBR322 se třídí pomocí synthetického oligonukleotidů jako son31 dy s 22 nukleotidy pro apo A-I, tak jak byla svrchu popsána· U jednoho z klonů bylo možno pozorovat v průběhu sledování intensivní hybridizační sigiiál. Tanto klon, který byl označen pULB1609 byl izolován a včleněná DNA, obsažená v tomto plasmidu byla charakterizována analýzou svého sledu. Délka tohoto včleněného sledu je 878 párů baží (pb). Tato DNA je kódem pro úplný polypeptid preproapo A-I lidského původu. Jak je znázorněno na obr. 1, klonovaný fragment cDNA obsahuje nekodové oblasti na 3- a 5-zakončení o 19 bp a 55 bp, dále sled o 54 pb, který je kódem pro prekursor ( aminokyseliny -24 až -7, sled pro propeptid o 18 pb ( aminokyseliny -6 až -1) a sled o 732 bp, který je kódem pro úplný apo A-I ( aminokyseliny 1 až 243) spolu s terminačním kodonem pro ukončení translace. Řetězec bílkoviny, odvozené od tohoto sledu DNA přesně odpovídá sledu aminokyselin, které jsou obsaženy v preproapo A-I v nezávisle izolovaných klonech cDNA ( W.C.Barker a další, Comp. Biochem- Physiol. 57B, (1977), 309-315, Japonská patentová přihláška č. 96998/86, ř. Cheung a L. Chán, svrchu a J.J. Seilhamer a další, svrchu).

2. Konstrukce vektoru pro expresi v bakteriích s obsahem sledu cDNA proapo A-I lidského původu: pULB9291 ( obr. 2 a 3).

Plasmid pULB9291, při jehož expresi vzniká proapo A-I lidského původu je možno zkonstruovat tak, že se uloží segment z klonu pULB16O9 za řídící oblast promotoru P^ lambda, jak je znázorněno na obr. 3. Konstrukce tohoto plasmidů pro expresi vyžaduje syntézu fragmentů DNA, které obsahují místo působení restrikčního enzymu Ncol, iniciační kodon ATG pro počátek translace a sled nukleotidů, který je kódem pro aminokyseliny genu se strukturou pro proapo A-I lidského původu až do prvního místa působení restriční endonukleázy Balí, jak je znázorněno na obr. 2*

Pomocný řetězec se připraví synthetickým způsobem ( N.D. Sinha a další, svrchu;). Připraví se čtyři synthetické oligonukleotidy; po hybridizaci jsou kódem pro methionin, odpovídající iniciačnímu kodonu ATG pro počátek translace, pro 6 aminokyselin, odpovídajících propeptidú a pro 14 prvních aminokyselin úplného apo A-I lidského původu, jak je znázorněno na obr. 2. Pomocný řetězec byl synthetizován proto, aby byla na nejnižší míru snížena tvorba sekundárních struktur na 5-zakončení genu. K tomuto účelu byly vybrány kodony, které jsou kódem pro aminokyseliny -6, -1, 1,

3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 a 14 tak, že neodpovídají přírodním kodonům pro tyto aminokyseliny, které je možno nalézt v cDNA klonu pULB1609.

Svrchu uvedený pomocný řetězec se užije pro spojení fragmentu DNA o 744 pb z plasmidu pULB1609 s promotorem P^ lambda v plasmidu pro expresi pULB1221.

Konstrukce vektoru pro expresi pULB1221 je popsána v evropském patentovém spisu č. 186 643.

Tato konstrukce sestává ze tří základních etap, vychází se z plasmidu pCQV2. Plasmid pCQV2 je popsán v publikaci C. Queen, J. Mol. 8¾¾¾¾ Appl. Genet, 2 (1983), 1-10 a je volně dostupný.

Volba určitého vektoru není závazná.

Je možno užít jakýkoliv jiný vektor, který obsaliuje promotor a před ním příslušné místo pro působení restrikčního enzymu Ncol. Naváže se přibližně 0,1/Ug svrchu popsaných synthetických fragmentů působením DNA-ligázy T4 na přibližně 1 /Ug fragmentu Ball-Pstl o 744 pb z plasmidu pULB1609 a přibližně 1 ^ug vektoru, kterým je plasmid pULB1221, rozštěpený Ncol a Balí.

Před uskutečněním vazby se fragment Ball-Pstl o 744 pb zpracovává působením T4 DNA-polymerázy, že se zakončení změní na 3-vazná zakončení. Tento postup je v oboru anám a byl popsán v publikaci T, Maniatis a další, uvedené svrchu·

Po amplifikaci v příslušných hostitelských buňkách kmen^AR58 E. coli byly rekonstruované plasmidy charakterizovány analýzou restrikčních míst a stanovením sledu DNA synthetických fragmentů a míst spojení. Jeden z rekombinantních plasmidů, pULB9291 splňoval všechna kriteria, protože obsahoval všechny fragmenty ve správném pořadí a směru, tento plasmid byl použit pro studie exprese,

3. Konstrukce vektoru pro expresi v bakteriích s obsahem složeného sledu pro beta-galaktosidázu a pro lidský proapo A-I: plasmid pULB9296 ( obr, 4),

Při této konstrukci se sled DNA, který je kódem pro lidský proapo A-I uloží před sled DNA, který je kódem pro beta-galaktosidázu ve správném pořadí a s tímto sledem se spojí. Gen pro beta-galaktosidázu se nachází v plasmidu pro expresi v E. coli pUR28S, který je volně dostupný, byl popsán v publikaci U. Ruther a B. Muller-Hill, EMBO J., 2 (1983), 17911794 a nese promotor lac v účinné formě a mimoto obsahuje příslušná restrikční místa pro sled beta- galaktosidázy. Příslušný rekombinantoí plasmid se zkonstnuje tak, jak je znázorněno na obr. 4. Především se DNA plasmidu pUR288 rozštěpí působením enzymu BamHI, pak se zpracovává působením T4-DNA-polymerázy, načež se znovu rozštěpí enzymem Sáli. Pak se postupně izoluje fragment o velikosti 805 pb z plasnidu p(JLB9291 štěpením působením restrikčního enzymu KpnI, působením T4-DNA-polymerázy a nakonec štěpením restrikčním enzymem Sal.I. Oba fragmenty se naváží v molárním poměru působením T4-DNA-ligázy a získaný plasmid se užije k transformaci hostitelských buněk kmene JM101 E. coli, což je volně dostupný kmen ATCC č. 33 876. Získané transformanty se ověří analýzou působením restrikčních enzymů k průkazu správné orientace sledu pro proapo A-I lidského původu vzhledem ke genu pro beta-galaktosidázu a na přítomnost místa pro působení restrikčního enzymu BamHI, které je rekonstruováno ve spojení obou uvedených sledů. To znamená, že sled, kteiý je kódem pro proapo A-I lidského původu je zařazen před sled pro beta-galaktosidázu ve správné fázi. Jeden z transformantů, obsahující plasmid pULB9296 splňoval všechna kriteria a byl pak použit při studiích na expresi,

4, Konstrukce plasmidu pro expresi u kvasinek pULB9299, který obsahuje sled DNA, který je kódem pro proapo-A-I lidského původu ( obr. 5).*

Při této konstrukci se sled cDNA, který je kódem pro proapo A-I lidského původu klonuje mezi signálem promotoru a terminačního kodonu v plasmidu pro expresi u kvasinek. K těmto pokusům byl vybrán bektor pro expresi u kvasinek pRIT10774. Konstrukce plasmidu pro expresi pBIT10774 je popsána v evropské patentové přihlášce č, 151 102. Tento vektor byl zkonstruován na jedné straně z plasmidu pRIT 10749, uloženého ve sbírce ATCC pod číslem 39133 podle Budapeštské úmluvy a nadruhé straně z vektoru YEpl3 pro E- coliSaccharomyces cerevisiae, který byl popsán v publikaci J.R. Broach a další, Gene, 8 (1979), 121-133, a který je dostupný ve sbírce ATCC pod ěíslem 37 115, Vektor pRIT 10774 je schopen replikace v E, coli i v kva37 šipkách a nese promotor e terminátor transkripce ornírhinkarbamoyltransferázy (ARG3), který je oddělený jediným místem pro působení restrikčního enzymu BamHI, vhodným pro včlenění cizorodé DNA spolus příslušným iniciačním kodonem ATG pro počátek translace. Mimoto obsahuje vektor sledy 2//U kvasinek, metabolické znače ní pro selekci v kvasinkách a značení AmpA pro selekci po transformaci E. coli tímto vektorem. Není tovšak jediný vektor, jehož by byle možno užit pro dosažení exprese proapo A-I lidského původů v kvasinkách. Je zásadně možno užít jakýkoliv jiný vektor pro kvasinky, který obsahuje řídící signály a jeho použití pak povede k získání kvalitativně obdobných výsledků. Konstruk ce, která je znázorněna na obr. 5 se provádí následujícím způsobem: DNA z plasmidu pRIT10744 se linearizuje působením restrikčního enzymu BamHI a pak se na ni působí T4 polymerázou DNA.

*

Dále byl izolován z plasmidu pULB9291 působením restrikčních endomukleáz Asp 718 a Sáli frag ment DNA o velikosti 810 pb a tento fragment byl pak podroben působení T4 polymerázy DNA. Tento fragment je kódem pro proapo A-I lidského půcovu a současně obsahuje i iniciační kodon ATG pro počátek traaaslace.

Oba fragmenty, získané svrchu uvedeným způsobem se vzájemně naváží v ekvimolárních poměrech působením T4 DNA-ligázy a získaná směs se použije k transformaci příslušných buněk E. coli kmene MM 294. Transformanty se sledují pomocí restrikční analyzy, aby bylo možno ověřit správnou orientaci sledu DNA pro proapo lidského původu vzhledem ke sledu promotoru ÁRG3* Jeden z transformantů obsahoval rekombinantní plasmid pULB9299, který splňoval všechny požadavky. Tento plasmid pULB9299 byl schopen amplifikace v E. coli a pak byl použit k transformaci sferoplastů kvasinky Saccharomyces cerevisiae, kmen 10S44c (pep4-3, leu2-3, leu2-112) podle svrchu uvedené publikace T. Cabezona a dalších.

Použití kmene Ic 1679d ( ATCC č. 20631) vedlo k získání kvalitativně obdobných výsledků. Transformaty kvasinek pak byly zkoumány na schopnost exprese proapo A-I lidského původu.

5. Konstrukce vektoru pro použití u bakterií s obsahem sledu DNA pro proapo A-I lidského původu: PNIV1612 ( obr. 6A, 6B, 6C).

. Při provádění této konstrukce se sled

DNA, který je kódem pro proapo A-I lidského původu zařadí ve správné fázi za sled DNA signálního peptidu bílkoviny OmpA z E. coli· K tomuto sledování byl vybrán vektor pro sekreci pIN-III-ompA-2, popsaný v publikaci J. Ghrayeb a další, EMBO J. 3 (19S4), 24372442. Tento vektor a tímto vektorem transformovaný kmen E. coli JA221 jsou dostupné na požádání v Department of Biochemistry of the State University of New Yourk (Stony Brook).

Tento vektor pro sekreci obsahuje velmi účinný promotor lpp ( lipoprotein), frament promotoruoperátoru lac, sled láci represoru lac a příslušná místa pro působení restrikčních endonukleáz, uložená bezrpostředně za sledem, který je kódem pro signální peptis genu ompA.Příslušný rekombinantní plasmid je možno zkonstruovat způsobem, který je znázorněn na obr. 6A, 6B a 6C. V první řadě se vektor pro xk sekreci pIN-III-ompA-2 linearizuje působením restrikčního enzymu EcoRI a pak se pdrobí působení T4-DNA-polymerázy. Pak se z plasmidu pULB9291 vyjme fragment o velikosti 805 pb tak, že se postupně působí restrikčními endo40 nukleázami KpnI a Sáli, načež se na získanou směs působí T4-DNA-polymerázou. Uvedený fragment je kódem pro proapo A-I lidského původu a obsahuje iniciační kodon ATG pro počátek translace.Oba takto získané fragmenty se navzájem naváží v ekvimolárním poměru působením T4DNA-ligázy a takto získaná směs se pak použije k transformaci příslušných buněk kmene JA221 E. coli, pěstovaných na živném prostředí M9, popsaném v publikaci J.H. Miller, Experimente in Molecular Genetics,

Cold Jpring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York 1972, str. 431. Prostředí obsahuje 20 mg/1 T_ryptofanu, 20 mg/1 leucinu, 2g/l laktózy a 50 mg/1 ampicilinu. Získané transformanty se podrobí selekci podle své odolnosti proti ampicilinu a pak se třídí při použití oligonukleotidu s obsahem 18 baží. Jde o synthetický oligonukleotid, který byl použit také při syntéze pomocného řetězce, jak je znázorněno na obr.2.

Transformanty, které byly získány selekcí se pak podrobí kontrole analýzou svého sledu působením restrikčních endonukleáz k ověření správné orientace sledu DNA pro proapo A-I lidského původu vzhledem ke sledu DNA, který je kódem pro signální peptid, obsažený ve vektoru pro sekreci ( v místě spojení obou sledů je rekonstituováno místo působení restrikčního enzymu EcoRI). Jeden z transformantů nese rekombinantní plasmid, který splňuje všechny požadavky. Řízenou mutagenezou se pak odstraní přebytečný sled, který pochází z konstrukce pomocného řetězce a který je v následujícím nukleotidovém sledu podtržen:

o*- GTA GCG GAG GCC GCT GAA TTC ATG AGA CAT TTC TGG 3'

Val Ala Gin Ala Ala Glu Phe Met Arg His Phe Trp aa

-o

K tomuto účelu se konstruuje následující oligonukleotid s obsahem 24 baží signální peptid-—)|£—-----proapo A-I

5* GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3*

Val Ala Gin Ala Arg His Phe Trp zbavený 12 přebytečných baží a tento sled se pak užije k odstranění přebytečného sledu s obsahem 12 baží z pomocného řetězce.

K provedení mutagenezy se užije Amershamova systému. Tento systém je založen na postupu, který byl uveden v publikaci F. Eckstein a další, Nucleic Acids Res, 13, (1985), 8765-8785. Tento postup poskytuje vysoké výtěžky a jeho celková účinnost je až 95 %.

V první řadě se ta oblast DNA, která má být podrobena mutagenezi klonuje ve vektoru M13.

K tomuto účelu se včlení fragment DNA mezi místy působení restrikčních enzymů Xbal-Ball rekombinantního plasmidů pIN-III-ompA-2, který obsahuje gen pro proapo A-I do vektoru M13mpl9, rozštěpeného působením restrikčnich endonukleáz Xbal a HindlI. Vektor M12mpl9 se běžně dodává a je možno jej získat na objednávku (Amersham, Buckirgiamshire, Velká Británie). Pak se oligonukleotid s obsahem 24 baží, získaný mutagenezou hybridizuje s matricí s jedním řetězcem a prodlouží se při použití Klenowova fragmentu DNA-polymerázy za přítomnosti T4-DNA-ligázjt za vzniku heteroduplexní mutanty·

Selektivní odstranění nemutovaného sledu je možno provést včleněním thionukleotidu do mutovaného sledu v průběhu syntézy in vitro s následným štěpením řetězce, který neobsahuje fosfothionát působením restrikční endonukleázy NCil. Tento řetězec obsahuje místo pro štěpení exonukleázou III, která nemutovaný řetězec rozštěpí. Mutovaný řetězec se tedy užívá jako matrice pro rekonstrukci cirkulární molekuly s dvěma řetězci, čímž dochází ke vzniku homoduplexní mutované molekuly. Průběh mutagenezy je možno ověřit analýzou sledu mezi signálním peptidem a počátkem genu, který je kódem pro proapo A-I. Rekombinantní plasmid pNIV1612 se rekonstruuje tak, že se naváže fragment vektoru pIN-III-ompA-2 po štěpení restrikčními enzymy Xbal a HindlII s fragmentem po štěpení enzymy Xbal-Ball, který byl zbaven 12 přebytečných baží a s fragmentem genu pro proapo A-I po štěpení enzymy Balí a HindlII.

Všechny tři fragmenty se naváží působením T4-DNA-ligázy a získaná směs se užije k transformaci příslušných buněk E. coli kmene 0221, jak již bylo uvedeno svrchu. Získané transformanty se podrobí selekci na svou resistenci proti ampicilinu a pak se třídí pži použití oligonukleotidu s obsahem 18 baží, jak již bylo svrchu uvedeno. Jeden ze získaných transformantů obsahuje plasmid pNIV1612 . Jde o rekombinantní plasmid, v jehož konstrukci je uložen sled, který je kódem pro signální peptid ompA před úplným sledem pro proapo A-I bez iniciačního kodonu ATG, jak je znázorněno na obr. 6A, 6B a 6C. Takto získané trans formanty E. coli se pak sledují na svou schopnost exprese lidského proapo AtI.

6. Konstrukce vektoru pro přenos pro včlenění sledu cDNA pro lidský proapo A-I do bakuloviru: pNIV1613, obr, 7.

Plasmid pNIV1613, který obsahuje sled

DNA, který je kódem pro lidský proapo A-I je možno zkonstruovat tak, že se uloží řetězec z klonu pULB9291 před polyhedri nový gen bakuloviru, jak je znázorněno na obr. 7. Při těchto pokusech bylo užito vektoru pro přenos pAcRP6 bakuloviru, který byl popsán v publikaci Y. Matsuura a další, J. Gen Virol. 67, (1986), 15151529. Tento plasmid je možno získat z Department of

Microbiology and Immunology university v Ottawě.

Plasmid obsahuje promotor polyhedri nového genu aý do nukleotidu -7 ve svém signálním sledu na 5-zakončení. Chybí mu kodon ATG polyhedtinového genu a prvních 170 nukleotidů sledu, který je polyhedrinovým genem. Příslušné místo pro štěpení restrikčním enzymem BamHI je uloženo před nukleotidem -7. Konstrukce, která je znázorněna na obr. 7 se realizuje následujícím způsobem DNA plasmidu pAcRPG se linearizuje působením enzymu BamHI. Pak se vyjme fragment DNA o velikosti S10 pb z plasmidu pULB9291 působením restrikčních enzymů Asp718 a Sall. Tento fragment je kódem pro proapo A-I lidského původu a obsahuje iniciační kodon ATG pro počátek translace. &1jss Oba fragmenty se v ekvimolárním poměru smísí a podrobí působení T4-DNA-polymerázy, naváží se působením T4-DNA-ligázy a pak se užijí pro transformaci příslušných buněk E. coli kmene AR58. Transformanty, které se tímto způsobem získají, se podrobí selekci na svou resistenci proti ampicilinu a pak se třídí při použití synthetického oligonukleotidů s obsahem 35 bázi, značeného P, jak je znázorněno na obr. 2, který odpovídá části sledu DNA, který je kódem pro proapo A-I lidského původu, načež se provede kontrola analýzou sledu DNA při použití restrikčních enzymů k ověření správné orientace sledu DNA, který je kódem pro lidský proapo A-I vzhledem k promotoru polyhedrinového genu. Jeden z takto/ získaných transformantů obsahuje rekombinantní plasmid pNIV1613, který odpovídá těmto požadavkům. Tento plasmid se pak užije k pokusům na expresi.

7. Produkce proapo A-I lidského původu transformovanými mikroorganismy ml kultury kmene AR58 nebo JM101 E. coli, transformované plasmidem plTLB9291 nebo plasmidem pULB9296 se pěstuje na bohatém živném prostředí, doplněném 50 ^ug/ml arapicilinu ( živný bujón LB, podrobnosti jsou uvedeny ve svrchu zmíněné publikaci T· Maniatise a dalších). Buňky se pěstují až do optické hustoty 0,6 při 630 nm, V případě plasmidu pULB9291 se indukce promotorem P^ lanbda uskuteční tím, že se kultura nejprve pěstuje při teplotě v rozmězí 30 až 42° C tak, aby došlo k inaktivaci represoru promotoru P_L lambda, tak jak je uvedeno v publikaci M.Rosenberg a další, Methods Enzymol. 101, (1983), 123-138, Indukce se provádí celkem 20 minut.

V případě plasmidu pULB9296 se provádí indukce promorotu lac tím způsobem, že se ke kultuře, inkubované při teplotě 37° C přidá chemický induktor IPTG ( isopropyl-beta-D-thiogalaktosid) až do dosažení konečné koncentrace 1 mM ( podle svrchu uvedené publikace R- Lorenzettiho a dalších). Indukce se v tomto případě provádí 60 minut.

ml kultury kvasinkových buněk kmene 10S44c, transformované plasmidem pULB9299 se pěstuje při teplotě 30° C v prostředí pro pěstování kvasinek (Difco) s obsahem dusíkatých baží a 1 % glukózy tak

A dlouho, až je dosaženo optické hustoty 0,3 při 630 nm, V tomto případě není zapotřebí použít žádné indukce, protože v tomto zvláštním případě je exprese konstitutivní ·

Pak se odeberou vzorky takto získaného materiálu o objemi 1 ml a tyto vzorky se odstředí 5 minut při 15 000 g. Pak se získaná usazenina rozruší působením vroucího dodecylsíránu sodného (DSS), Pak se usazenina znovu uvede do suspenze v 50 /Ul pufru obsahujícího DSS ( 50 mM Tris-HCl o pil 6,8, 2 % DSS,

M močoviny, 5 % 2-merkaptoethanolu a 10 % glycerolu) a pak se směs zahřívá na teplotu varu 100°C celkem 3 minuty. Pak se extrakty odstředí při 15 000 g celkem 10 minut. Tím jsou vzorky připraveny k provádění analýzy elektroforézou na polyakrylamidovém gelu o koncentraci 15 % nebo 7,5 % za přítomnosti DSS za denaturačních podmínek ( svrchu uvedená publikace Laemmliho a dalších)»

Po ukončení elektroforézy se polyakrylamidové gely promyjí 40 ml destilované vody a pak 40 ml pufru s fosforečnanem sodným o koncentraci 50 mM a o pH 7,5. Pak se bílkoviny elektrickým způsobem přenesou z gelů na listy nitrocelulózy v průběhu dvou hodin při použití napětí 60 V a proudu 1,5 A v tomtéž fosfátovém pufru { svrchu uvedená publikace T, Cabezona a dalších). Listy nitrocelulózy se pak nasytí 1% albuminem v 50 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 7,5, načež se inkuhgí při teplotě místnosti přes noc za přítomnosti králičího séra s obsahem protilátek proti apo A-I lidského původu v ředění 1/500 ( a za přítomnosti monoklonálních protilátek proti beta-galaktosidáze myšího původu v pří49 pádě plasmidu pULB9296), a to v tomtéž pufru, který byl zbaven albuminu.

Listy nitrocelulózy se pak pětkrát promyjí 40 ml téhož fosfátového pufru a pak se inkubují ve 40 ml fosfátového pufru, který obsahuje 10 ^ug/ml kozí protilátky proti protilátce králíka ( nebo proti protilátce myši), a označí se peroxidázou. Po čtyřech hodinách inkubace při teplotě místnosti se listy nitrocelulózy znovu pětkrát promyjí 40 ml fosfátového pufru a ,pak se vyvíjí přidáním 50 ml chromogenního substrátu ( 10 mg diaminobenzidinu, 100 yul peroxidu močoviny a koncentraci 10 % a 100 mM tris-HCl o pH 7,6.(.

V případě plasmidu pULB 9291 a pULB9299 je možno nalézt jediný produkt, který reaguje s protilátkami proti apo A-I lidského původu. Tento produkt má molekulovou hmotnost, která odpovídá molekulové hmotnosti vzorku přírodního apo-A-I lidského původu. V případě plasmidu pULB9296 je možno prokázat složený pólypeptid, jehož velikost odpovídá předpokládané velikosti polypeptidů beta-galaktosidázy a proapo A-I lidského původu ( 144 kjednotek), tento složený polypeptid reaguje se sérem s obsahem protilátek proti apo A-I lid50 ského původu a se sérem s obsahem protilátek proti betagalaktosidáze. Rozměry uvedených látek byly stanoveny předběžně pomocí kalibračních křivek, založených na migraci různých vzorků s odlišnými molekulovými hmotnostmi při použití týchž gelů, které byly užity pro zpra cování molekulárních extraktů.

V dalším pokusu bylo pěstováno 20 ml kultury kmene E. coli JA221, transformované plasmidem pNIV1612 v bohatém prostředí, doplněném 50 yug/ml χγχ ampicilinu ( živný bujón LB, svrchu uvedená publikace T. Maniatise a dalších) až do dosažení optické hustoty 0,6 při 630 nm. Indukce promotoru lac byla prováděna tak, že ke kultuře, inkubované při teplotě 37° C byl přidán chemický induktor IPTG ( isopropyl-betaD-thiogalaktosid) až do konečné koncentrace 2 mM. Indukce byla prováděný) 60 minuti Pak byly odebraný vzorky těchto kultur o objemu 1 ml a tyto vzorky byly odstřelovány při 15 000 g celkem 5 minut. Získaná usazenina byla podrobena osmotickému šoku, aby bylo možno oddělit periplasmatickou frakci, postup byl uveden v publikaci D, Koshland a D. Botstein, Cell 20, (1980),

749 - 760. Uvolněná frakce se znovu uvede do suspenze ve svrchu uvedeném pufru s obsahem DSS, avšak bez močoviny, směs se uvede na teplotu varu, pak se odstředí a podrobí se elektroforéze na pólyakrylamidovém / gelu o koncentraci 12,5 % za přítomnosti DSS, načež se po elektroforetickém přenosu provádí detekce imunologickým způsobem o Frakci proapo A-I, synthetizováného tímto způsobem je možno prokázat v buňkách, avšak nikoliv v periplasmě. Tento jev je pravděpodobně způsoben tím, že nedochází k sekreci proapo A-I. Je také možné, že nebyla zvolena optimální účinnost osmotického šoku. Hlavní frakci proapo A-I je možno volně pro kázat v prostředí po provedení osmotického šoku, což znamená, že došlo k sekreci této bílkoviny buňkami.

8. Produkce proapo A-I lidského původu hmyzími buňkami, infikovanými bakulovirem

Rekombinantní plasmid pNIV1613 byl užit spolu s kmenem, který je reservoárem bakuloviru k společné infekci buněk Spodoptera frugiperda ve tkáňové kultuře. Tříděním rekombinant viru, zbavených polyhedrinu byly získány rekombinantní plaky. Rekombinantní virus, získaný čištěním z jednoho plaku, se pak užije k infekci hmyzích buněk. Tento postup je v oboru dobře znám a byl podrobně popsán v publikaci M.D. Summers a G.E. Smith, Manul of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas University College Station, (1987). Rekombinantní virus byl zkoumán na svou schopnost prosukce proapo A-I imunologicky po elektroforetickém přenosu Elektroforézou na 12,5% polyakrylamidovém gelu za přítomnosti DSS_f po rozrušení buněk působením pufru RIPA ( 0,05 M pufru Tris-HCl o pH 7,2 s obsahem 0,15 M NaCl, 1 % Tritonu X100, 0,1 % DSS, 0,1 % desoxycholátu sodného a 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (FPMS)) s následným působením vroucího DSS. Bylo možno prokázat jediný produkt, který reagoval s protilátkami proti apo A-I lidského původu. Tento produkt měl molekulovou hmotnost, která odpovídala molekulové hmotnosti standardního vzorku přírodního lidského apo A-I. Bílkovina, k jejíž expresi došlo, tvořila hlavní složku celkových bílkovin. Koncentrace proapo A-I v 1 litru kultury, měřené jednoduchou radiální imunodifuzí způsobem podle publikace

G. Mancini a další, Immunochem. 2, (1965), 235 - 254 byla přibližně 100 mg.

9. Cytoplasmatická produkce lidského proapo A-I v E· coli. Použití minimálního definovaného orostřnxií.

Plasmid pULB9292 byl užít pro cytoplasmatickou produkci proapo A-I lidského původu mikroorganismem E. coli v prostředí, označeném jako minimální, jehož složení bude dále uvedeno. Plasmid pULB9292 je možno zkonstruovat tak, že se vymění fragment po štěpení enzymy EcoRI a Ncol plasmidu pULB9291, který je kódem pro promotor lambda za fragment, získaný z plas midu pOTS rovněž štěpením pomocí enzymu EcoRI a Ncol podfe publikace M. Rosenberg a další, Methods Enzymol. 101, (1983), 123 - 138. Fragment plasmidu pOTS, získaný štěpením pomocí enzymů EcoRI a Ncol a popsaný v publikaci G. Devare a další. Cell, 36.» (1984), 43 - 49 obsahuje rovněž promotor P^ fágu lambda, který je účinný a řiditelný. Pak se pěstuje na dále definovaném minimálním prostředí 20 ml kultury kmene AR5S mikroorganismu E. coli, transformovaného plasmidem pULB9292. Minimální prostředí obsahuje na 1 litr následující množ štvi jednotlivých složek: 3 g Na^HPO^. 2 H^O, 3 g KH₂P0₄, 0,5 g NaCl, 1 g NH₄C1, 1,37 mM MgS0₄· 7 HgO,

29,5 /UM FeCl₃ . 6 HgO, 236 ^uM MnS0₄ . HgO, 10 g glu54 kozy, 1 mg vitaminu B^, 50 mg ampicilinu, živné prost ředí LB 1/20 ( objemový poměr). Buňky se pěstují ve svrchu uvedeném minimálním živném prostředí tak dlouho až optická hustota dosáhne hodnoty 0,5 při 630 nm* Indukce promotoru lambda se provádí tak, že se na počátku kultura pěstuje při teplotním rozmezí 30 °C až 42°C, čímž dojde k inaktivaci represoru promotoru P^ lanbda, jak bylo popsáno ve svrchu uvedená publikaci M. fíosenberga a dalších. Indukce se provádí celkem 60 minut. Pak se odeberou vzorky získané kultury s objemem 1 ml a tyto vzorky se nechají projít Frenchovým lisem nebo se odstředí celkem 5 minut při 15 000 g. Celkový získaný buněčný extrakt nebo získaná usazenina se pak zpracovávají působením vroucího DSS, tak jak bylo popsáno v odstavci 7). Po provedení elektroforézy a po elektroforetickém přenosu je možno prokázat jediný produkt, který reaguje s protilátkami proti apo A-I lidského původu. Tento produkt má mole» kulovou hmotnost, která je v souladu s molekulovou hmotnostní standardního vzorku přírodního lidského apo A-I. Podíl proapolipoproteinu A-I, který se po expresi dostal do svrchu definovaného minimálního živ55 ného prostředí je 13,5 % celkových bílkovin, stanovený obsah proapo A-I je přibližně 270 mg na litr kultury.

10. Izolace, čištění a charakterizace lidského proapo A-I, produkovaného transformovanými mikroorganismy

10.1 Izolace a čištěni

Surové extrakty takto získaného surovév ho rekombinantního ρκηρχ proapo A-I se odstředují celkem 15 minut při iSsSSfi 4 000 g a usazenina se odloží. Supernatant se pak odstřeďuje dvě hodiny při 100 000 g. Získaná usazenina se znovu uvede do suspenze v co nejmenším objemu pufru (TEN100), se složením 20 mM Tris-HCl o pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1,75 /Ug/ml FPMS a 100 /Ug/ml merthiolátu sodného ( sodná sůl kyseliny ethylmerkurithiosalicylové), načež se odděleně upraví objem suspenze a supernatantu na původní objem extraktu přidáním téhož pufru. Pak se bílkovina vysráží z obou suspenzí přidáním zvyšující se koncentrace isopropylalkoholu. Pak se stanoví při použití radiální imu56 nodifuze, popsané ve svrchu uvedené publikaci G, manciniho a dalších frakce bílkoviny, vysrážená z každé suspenze, která obsahuje hlavní podíl imunologické reaktivity, odpovídající apo A-I lidského původu při použití běžně dodávaného autentického vzorku lidského apo A-I· Každá takto získaná frakce se s výhodou čistí chromatografií na sloupci pryskyřice Sephacryl S200, jako eluční činidlo se opět užije svrchu uvedený pufr. Odebírají se frakce s objemem 0,9 ml a pak se v každé z těchto frakcí stanoví pomocí radiální imunodifuze množství celkové bílkoviny, která má imunologickou reaktivitu, která odpovídá imunologické reaktivitě apo A-I lidského původu. Molekulová hmotnost bílkoviny ve frakcích, získaných vymýváním chromatograf ick ého sloupce se stanoví kalibrací sloupce pomocí sloučenin se známou molekulovou hmotností, jako jsou například aldoláza, sérový albumin skotu, vaječný albumin, chymotrypsinogen a Cytochrom C, kalibrace se provádí za stejných podmínek. Čistota lidského proapo A-I na 1 mg celkové bílkoviny v hlavních frakcích, které obsahují rekombinantní proapo A-I lidského původu, vyjádřeno v mg bílkoviny se stejnou imunologickou reaktivitou, jakou má běžně dodávaný vzorek autentického lidského apo A-I byla stanovena jako 95 %«

10«2, Charakterizace

10«2«1« Fysikální vlastnosti rekombinantního proapo A-I

V případě, že se podrobí rekombinantní proapo A-I, čištěný a izolovaný ze supernatantu a z usazeniny po odstředili při 100 000 g isoelektrické fokusaci způsobem, popsaným v publikaci N.Catsimpoolas, Anal· Biochem 26 (1969), 54 - 62 při postupně se zvyšujícím pH v rozmezí 4 až 6, získá se jednotný pás, jehož isoelektrický bod leží při pH 4,95. Apo A-I z lidské plasmy je o něco kyselejší a jeho isoelektrický bod leží při pH 4,75. Celkový rozdíl mezi hodnotou isoelektrického bodu pro rekombinantní proapo A-I a pro proapo A-I, izolovaný z lidské plasmy činí pouze 0,2 jednotky pH, což je v dobré shodě s rozdílem, který je znám pro hodnoty isoelektrických bodů pro plasmatický apo A-I a plasmatický proapo A-I, který byl stanoven jako 0,17 jednotky pH podle publikace G.L. Millis a další, Lab. Tech. Biochem. Mol. Biol. 14, (1984), 244-245.

Pokud jde o molekulovou hmotnost, sestává jak rekombinantní proapo A-I z usazeniny, tak proapo A-I ze supernatantu z jediného polypeptidového řetězce, který má v obou případech stejnou molekulovou hmotnost 29,9 ± 1,4 kjednotek. Apo A-I z lidské plasmy má o něco menší molekulu, jeho molekulová hmotnost je rovna 29,3 i 1,3 kjednotek.

10.2.2« Zjištěni peptidového sledu pro rekombinantní proapo A-I při použiti BNPS-skatolu

Štěpení chemickým způsobem bylo provedeno při použití 3-brom-3-methyl-2-/(2-nitrofenyl)thio/-3H-indolu, tj·

BNPS-skatolu způsobem, popsaným v publikaci A. Fontana, Methods Enzymol 25 (1972), 419-423. 5 až 10 ^ug vzorku čištěné bílkoviny se rozpustí ve 100 /ul roztoku fenolu o koncentraci 15 % objemových ve vodném roztoku kyseliny octové o koncentrací 50 % objemových. Pak se přidá 50 ^ul roztoku s obsahem 4,8 mg BNPS-skatolu na 1 ml ledové kyseliny octové a směs se inkbuje 72 hodin při teplotě 25° C. Pak se přidá 50 /ul 2-merkaptoethanolu a směs se podruhé inkubuje 5 hodin při teplotě 37° C· Vzorky se odpaří, znovu se rozpustí ve 100 /ul vody a roztok se extrahuje třikrát 200 yul ethylacetátu. Organické fáze se odloží, vodné fáze se lyofilizují a analyzují elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s obsahem DSS·

V případě chemického štěpení působením BNPS-skatolu jsou počet a rozměry fragmentů apo A-I více nebo méně předem dány, protože za použitých experimentálních podmínek nastává působením BNPS-skatolu selektivní štěpení za tryptofanovým zbytkem.

Při předpokládané 100% účinnosti štěpení v každém štěpeném místě je největším frag mentem, jehož přítomnost je možno očekávat, C-terminální fragment o velikosti 15,4 kjednotek. Molekulová hmotnost zbývajících fragmentů se pohybuje v rozmezí 0,5 až 5,3 kjednotek, tyto fragmenty jsou tedy příliš malé pro detekci,

V případě neúplného štěpení může být fragment o velikosti 15,5 kjednotek prodloužen ve směru k N-terminálnímu zakončení, tvoří se fragmenty o velikosti

20,7 kjednotek, 23,1 kjednotek a 27,6 kjednotek. Tento jev je možno pozorovat jak v případě lidského apo A-I z krevní plasmy, tak pro různě čištěné vzorky rekombinantního proapo A»I.

c ' 7uP ,

JUDr. Ivan/KOREČEK

AdvoKatni a agentova kancelář 160 00 Praha/o Na baště sv.dlny P.O. BOX$75, 160 41 Praha 6 eska republika

Claims (7)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Způsob výroby proapolipoproteinu A-I lidského původu vyznačující se tím, že se 1) pěstuje za příslušných podmínek buněčná kultura nebo mikroorganismus ze skupiny E. coli, Saccharomyces cerevisiae nebo buněk Spodoptera frugiperda, transformovaný vektorem pro expresi, který obsahuje řetězec rekombinantní DNA, který je kódem pro lidský proapolipoprotein A-I, vázaný operativním způsobem na řídící sled DNA a zavzatý mezi signály pro iniciaci a pro ukončení translace, přičemž ve sledu řetězce rekombinantní DNA, který je kódem pro lidský apolipoprotein A-I, je vypuštěn fragment přírodního kódového řetězce pro aminokyseliny -6 až +14 a je nahrazen fragmentem DNA

   5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3 který je kódem pro tytéž aminokyseliny, přičemž tento sled obsahuje navíc iniciační kodon ATG a modifikované kodony pro aminokyseliny v polohách -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 a +12, čímž dochází ke snížení nebo vyloučení tvorby struktur s dvojitým řetězcem a 2) takto získaný lidský apolipoprotein A-I se izoluje.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že vektor pro expresi obsahuje řídící sled DNA s obsahem oblasti promotoru Pl fágu lambda.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že vektor pro expresi obsahuje řídící sled DNA pro proapo1ipoprotein A-I lidského původu, uložený před sledem DNA pro betagalaktosidázu a řídící sled DNA obsahuje oblast lac promotoru.

   Ιζ,ΐΡ-#? Τι '

   M a.

   - 62
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že vektor pro expresi obsahuje řídící sled PNA s oblastí promotoru a terminátoru transkripce ARG3 z kvasinek.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že vektor pro expresi obsahuje řídící sled PNA s oblastí pro proapolipoprotein A-I lidského původu, prostý kodonu ATG, uložený před sledem PNA pro signální peptid bílkoviny OmpA E. coli, přičemž řídící sled PNA obsahuje oblasti promotoru lpp a promotoru- operátoru 1 ac.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že vektor pro expresi obsahuje řídící sled PNA s oblastí promotoru polybydri nového genu bakuloviru.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc í se tím, že jako vektor pro expresi se volí rekombinantní plasmid ze skupiny pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612, pNIV1613.

   JUDr. Ivan KOREČEK

   Advokátní aM/aWhMya/kanceláf 160 00 PrahaQmá^aXte/sv. Jin 9 P.O. BOX ^o^6ý\44f Praha 6 Česká renu blíka

   JW-H>

   20 30 AO 50 60 70

   TCCOCCAQjGCOTTCflBGOTGftAflGCTCOGCTGCT6ACCn<iGCQnECTCTTCCrfiAfifififiRafyrAfifirTrRfirft,

   MKAAVLTLAVLFLT6SOARH -20 -10

   SO 100 110 120 130 1A0 150 nTCTGGWGCACT&WXCCCCCAGAGCCCCTGGGATCGAGTGAftGGACCIGGCOCFGTGTACGTGMTGIGCTC

   F « 0 OD E P P 0 S Ρ V D R V K D L A TV Y V D V L 1 10 20

   160 170 180 190 200 210 220 230

   AA/CW3SX^GA5ACTATGTGTCCWCTTT6WGGCTCC6CCTTGG6AWACAGCrAWCCTWjCTCCrT6ÍCA KDSGRDYVSOFEGSALGKQLKLKLLD

   A0

   2A0 250 260 270 280 290 300 310

   ACTSGGACAGCGTaOTCOCOTCA5CA«nGCGCGMCACTffiGCCCTGTQYX(AGeSGncrGGMTAACCT

   NWDSVTSTFSKLRE0L6PVTQEFKDNL a 60 70

   320 330 340 350 360 370 380 390

   EBAAMGGAjtt/CA3GGCCIGflGGWGGAGATGAGCAA3jATCfGGAjGflQnriAASGCCAN9nGCAGCCCIACCT^r’

   E KE Τ E 6 L R 0 E « S K D L Ε Ε V KA KV C PYL · » 100

   Α0ΟΑ1ΟΑ20Α3ΟΑΑΟΦΟΑ6ΟΑ7Ο

   WMCTTra&MWGGWfcttGfcAT^^

   D D F 0 K K K O Ε E « E L Y R 0 K V EP LRAELO 110 120