LT3600B - Nucleic acid fragment which codes for human proapolipoprotein a-i - Google Patents

Nucleic acid fragment which codes for human proapolipoprotein a-i Download PDF

Info

Publication number
LT3600B
LT3600B LTIP828A LTIP828A LT3600B LT 3600 B LT3600 B LT 3600B LT IP828 A LTIP828 A LT IP828A LT IP828 A LTIP828 A LT IP828A LT 3600 B LT3600 B LT 3600B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
sequence
human
dna sequence
proapo
dna
Prior art date
Application number
LTIP828A
Other languages
English (en)
Inventor
Alex Bollen
Jean Gobert
Ernst Wuelfert
Original Assignee
Ucb Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ucb Sa filed Critical Ucb Sa
Publication of LTIP828A publication Critical patent/LTIP828A/xx
Publication of LT3600B publication Critical patent/LT3600B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Šis išradimas skirtas naujai rekombinantinių dezoksiribonukleino rūgščių sekai (DNR), apimančiai seką, koduojančią žmogaus proapolipoproteiną A-I, klonavimo ir ekspresijos vektoriams, turintiems šias DNR sekas, naudojamiems ląstelių arba mikroorganizmų, sugebančių produkuoti žmogaus proapolipoproteiną A-I, transformacijai.
Žmogaus apolipoproteinas A-I (apo A-I) yra pagrindinė baltyminė sudėtinė didelio tankio lipoproteinų (DTL) ir limfos chilomikronų dalis. Kepenys ir plonoji žarna yra pagrindiniai apo A-I sintezės centrai. Apo-I sintezuojamas šiuose organuose kaip baltyminis pirmtakas (preproapo A-I). Bendras transliacinis prepeptido suskaldymas vyksta ląstelės viduje, ir proapo A-I yra išskiriamas plazmoje ir limfoje.
Proapo A-I turi šešias papildomas aminorūgštis (Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln), prijungtas prie apo A-I galinės amino grupės. Pasiekęs kraujagyslių išsidėstymo sritį, proapo A-I suskaldomas organizme specifiniu proteolitiniu fermentu (apo A-I propeptidaze), sudarydamas susiformavusį apo A-I.
Šis subrendęs apo A-I yra vienintelis neglikozilintas žinomos sekos, susidedančios iš 243 aminorūgščių, polipeptidas (H. B. BREWER ir kt., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, (1978), 623-630); jis tarnauja kaip kofaktorius plazmos fermentui lecitinui: cholesterolio aciltransferazei, kuri atsakinga už daugumos cholesterolio esterių susidarymą plazmoje. Defektai apolipoproteino struktūroje arba biosintezėje gali sukelti sutrikimus plazmos lipidų pernešimo sistemoje ir koronarinių arterijų susirgimus. Įrodyta, kad žemos apo A-I ir DTL koncentracijos plazmoje yra reikšmingas širdies priepuolių (miokardo infarkto) ir kitų susirgimų, susijusių su kraujagyslių ateroskleroze, rizikos faktorius. Geno, koduojančio apo A-I, mutacijos susijusios su DTL koncentracijos sumažėjimu, o taip pat pirmalaikiais koronarinių kraujagyslių susirgimais.
Apo A-I ir DTL yra pagrindinės plazmos sudėtinės dalys, kurios dalyvauja cholesterolio pernešime iš periferinių audinių (arterijų) į kepenis (taip vadinamame atvirkštiniame cholesterolio pernešime) ekskrecijai iš organizmo. Turint omeny tai, kad cholesterolio susikaupimas arterijose yra svarbiausias aterosklerozės mechanizmas ir ypatybė, atvirkštinio cholesterolio pernešimo stimuliacija apo A-I gali sulėtinti bei transformuoti aterosklerozinį procesą ir tuo pačiu sumažinti širdies priepuolių galimybes.
Proapo A-I ir apo A-I susiformavimas gali vykti kiekybiškai ne ląstelėje, išsilaikant kraujyje mažiau negu 12 valandų. Turint omeny tai, kad A-I yra pagrindinis, jeigu ne vienintelis susiformavusio apo A-I pirmtakas, jis gali būti naudojamas pakeičiančioje terapijoje kiekvieną kartą, kai sumažėja DTL koncentracija, pvz., esant įgimtoms ir įgytoms ydoms. Dėl apo A-I terapinio naudingumo tyrinėtojai bandė rasti būdus, įgalinančius produkuoti apo A-I dideliais kiekiais. Tokie visuotinai žinomi būdai apima apo A-I, gauto iš kraujo plazmos, išvalymą.
Keliose publikacijose (P.CHEUNG and L. CHAN, Nucleic Acids Res. 11, (1983), 37033715; J.J. SEILHAMER ir kt., DNA, 3, (1984), 309-317 ir Japonijos patento paraiškoje Nr. 96998/86) buvo parodyta, kad papildančioji DNR koduojanti preproapo A-I, gali būti gauta gerai žinomais genetinės inžinerijos būdais. R. LORENZETTI ir kt. (FEBS Lett. 194, (1986), 343-346) parodė, kad apo A-I gali būti ekspresuojamas E.coli kaip nesuskaldomas sujungtas su beta-galaktozidaze baltymas. Tačiau bandymai ekspresuoti susiformavusį nesujungto baltymo pavidalo apo A-I buvo nesėkmingi.
Japonijos patento paraiškoje Nr. 98998/86 aprašoma baltymo, panašaus į žmogaus apolipoproteiną A-I, ekspresija E.coli, kuris transformuojamas plazmidė pHAIE-I, turinčia struktūrinį apo A-I geną, kontroliuojant promotoriui tac. Tačiau šis struktūrinis genas yra nepilnas ir sudarytas iš aminorūgščių kodonų nuo +4 iki +243, prieš kuriuos eina ATG transliacijos iniciacijos kodonas. Dėl to gautas ekspresijos produktas turi Ngalinį metioniną (atitinkantį ATG kodoną), kuris gali sukelti pašalinius poveikius, naudojant terapijoje.
J.B. MALLORY ir kt. (J. Biol. Chem. 262, (1987), 4241-4247; PCT paraiškų publikacijos
WO 86/04920 ir WO 87/02062) aprašyta žmogaus apolipoproteino A-I ekspresija kinietiškų žiurkėnų kiaušidžių ląstelėse (gyvulėlių ląstelių kultūra). Ši naudojama struktūra turi pilną žmogaus preproapolipoproteino A-I geną. Kinietiškų žiurkėnų kiaušidžių ląstelės, matyt, transformuoja proapo formą j susiformavusią formą,kadangi tik 5-10% išskirto baltymo apo A-I yra baltymas proapo A-I, likusią dalį sudaro susiformavęs baltymas apo A-I. Sistemos produktyvumas santykinai mažas, kadangi 0.5 x 10^ ląstelių išskiria tik 25-30 pg/ml apo A-I per 24 valandas. Tarptautinės patentinės PCT paraiškos aprašyme WO 87/02062 pateikti pavyzdžiai, susiję su žmogaus apolipoproteino A-I ekspresija kituose šeimininkuose, tokiuose kaip E. coli (bakterinis šeimininkas) ir S. cerevisiae (mielės). Tačiau nė vienoje iš naudotų struktūrų nėra genetinės informacijos apie proapo formą, ir išreikštas baltymas nėra žmogaus proapolipoproteinas A-I.
Šis išradimas apima žmogaus proapolipoproteino A-I, t.y. susiformavusio proapo A-I, kurį galima suskaldyti specifiniu proteolitiniu apo-I fermentu propeptidaze, gavimo rekombinantinės DNR metodais priemones ir būdus. Čia naudojama sąvoka susiformavęs reiškia ne tik žmogaus proapo A-I kaip tokį, bet taip pat atitinkamą baltymą, kurio pirmoji aminorūgštis yra metioninas, ir kurio buvimas yra sąlygotas ATC transliacijos iniciacijos kodono ekspresijos vektoriaus struktūroje.
Šis išradimas skirtas klonavimo ir ekspresijos vektorių, turinčių DNR, koduojančią žmogaus proapo A-I, sudarymui tokiu būdu, kad įgalinama amplifikacija ir po to subrendusio žmogaus baltymo proapo A-I ekspresija, o taip pat Met-, jų sujungimo konjugatų arba konjugatų su signaliniu N-galu ekspresija. Toliau šis išradimas skirtas gyvybingų ląstelių kultūroms arba genetiškai modifikuotiems mikroorganizmams, kadangi juose yra šie vektoriai ir jie gali produkuoti žmogaus polipeptidą proapo A-I. Be to, šis išradimas apima žmogaus proapo A-I fizinėje būklėje, besiskiriančioje nuo fizinės būklės, kurioje jis randamas arba iš kurios jis išskiriamas iš natūralių šaltinių arba natūralios supančios aplinkos. Dėl šio gavimo būdo žmogaus proapo A-I visiškai laisvas nuo įprastų endogeninių ir kitų pradinių medžiagų arba produktų.
Šis išradimas taip pat skirtas žmogaus proapo A-I gavimui rekombinantinės DNR būdu su visais aspektais ir nereikėtų manyti, kad tai būdas, apribotas šio aprašymo specifinėmis detalėmis ir rėmais.
Pagrindinis šio išradimo aspektas skirtas gavimui baltymo, kuris sudarytas iš arba kurio sudėtyje yra susiformavęs žmogaus proapo A-I, ir kuris tokiu atveju gali būti paverstas in vitro arba in vivo sąlygose susiformavusiu žmogaus apo A-I, proteolitiškai veikiant apo A-I propeptidaze. Gaunamas žmogaus proapo A-I kaip toks gali būti panaudotas terapiniams tikslams; gali būti naudojamas taip pat met-proapo A-I, jei metionino radikalo buvimas yra farmaciškai priimtinas, kadangi šis produktas gali būti natūraliai ir efektyviai paverstas susiformavusiu autentišku žmogaus apo A-I cirkuliuojančiame kraujyje. Norint žmogaus proapo A-I gali būti produkuotas parinktuose mikroorganizmuose arba ląstelinėse kultūrose, kurios gali paveikti N-terminalinį metioniną ir tuo pačiu gali produkuoti žmogaus proapo A-I tokioje formoje, kurioje nėra N-terminalinio metionino. Alternatyviai žmogaus proapo A-I, nepaisant to, ar jame yra, ar nėra N-terminalinis metionino radikalas, gali būti suskaidytas in vitro sąlygose, taip gaunant susiformavusį žmogaus apo A-I, kuris gali būti naudojamas terapiniams tikslams. Tai taip pat galioja ir sujungimo konjugatams bei konjugatams, turintiems proapo A-I signalinį N-galą: šio produkto suskaldymas veda prie autentiško žmogaus apo A-I be N-terminalinio metionino susidarymo.
Antras svarbus šio išradimo aspektas skirtas modifikuotos sekos, koduojančios bent dalį žmogaus proapo A-I molekulės, panaudojimui; tokia modifikuota koduojanti seka pagerina transliacijos efektyvumą dėl sumažėjusio smeigtukų pavidalo struktūrų susidarymo arba iš viso apsaugojimo nuo jų. Gal būt, R. LORENZETTI ir kt. (FEBS Lett. 194, (1986), 343-346) negalėjo nustatyti nesujungto subrendusio apo A-I proteino, kadangi jų gautos DNR gali sudaryti smeigtukų pavidalo struktūras, dėl ko ekspresija yra labai neefektyvi. Nustatyta, kad efektyvi ekspresija gali būti garantuota, atitinkamai modifikuojant kai kuriuos kodonus sekoje, koduojančioje aminorūgštis nuo -6 iki +14 žmogaus proapo A-I. Sąvokos atitinkamai modifikuojant čia reiškia, kad kai kurie natūralūs kodonai pakeičiami kitais kodonais, kurie pagal genetinį kodą yra tos pačios aminorūgštys, ir be to, šios sąvokos reiškia, kad visos paimtos kartu modifikacijos sumažina smeigtukų pavidalo struktūrų susidarymą arba net visiškai apsaugo nuo jų. Reikia pabrėžti, kad tokios DNR sekos modifikacijos nedaro jokios įtakos skaldymo propetidaze vietai dėl to, kad aminorūgščių seka, atpažįstama propeptidazės, išlieka tokia pat.
Baltymų atžvilgiu šis išradimas skirtas žmogaus proapo A-I kaip genetiškai modifikuotų ląstelių kultūros arba mikroorganizmo produktui. Sis žmogaus proapo A-I gali būti pateiktas susiformavusio proapo A-I formoje, kurio pirmtakas yra metionino radikalas, sujungto baltymo formoje, tokio kaip, pvz., beta-galaktozidazė-proapo A-I, ir preproapo A-I produkto formoje. Gautas produktas faktiškai neturi įprastų endogeninių baltymų ir kitų natyvių medžiagų arba produktų, bendrų su nagrinėjamo baltymo natūraliu šaltiniu (kraujo plazma). Ląstelių kultūra arba mikroorganizmas, naudojami šiam produkavimui, neapsiriboja specifinėmis ląstelių linijomis ir organizmais: gali būti naudojamos ir prokariotinės ląstelės, ir eukariotinės ląstelės, įskaitant gyvulių ir žmonių ląstelių linijas. Tik kaip iliustracija toliau pateikiamas ekspresijos bakterijoje E. coli (kaip prokariotinių ląstelių atstovo) ir mielėse Saccharomyces cerevisiae, taip pat vabzdžių, užkrėstų bakulovirusu, ląstelėse (kaip eukariotinių ląstelių atstovo) pavyzdys.
Baltymų atžvilgiu šis išradimas skirtas taip pat žmogaus apo A-I, gauto žmogaus proapo A-I, produkuoto kaip aprašyta aukščiau, apdirbimu apo A-I propeptidaze. Šis žmogaus apo A-I identiškas žmogaus susiformavusio apo A-I autentiškai formai ir jame nėra jokių N-terminalinio metionino radikalų.
Panaudojimo atžvilgiu šis išradimas skirtas farmacinėms kompozicijoms, kurių sudėtyje yra žmogaus proapo A-I ir/arba žmogaus apo A-I, nurodyti aukščiau, ir bent vienas farmaciškai tinkamas nešiklis tirpiklis, skiediklis arba priedas, parinkti visuotinai priimtinas būdais, atsižvelgiant į įvedimo j organizmą būdus ir įprastus farmacinių kompozicijų receptūrų ruošimo reikalavimus.
DNR atžvilgiu šis išradimas skirtas rekombinantinės DNR sekai, apimančiai seką, koduojančią proapoliproteiną A-I, kurioje natūralios koduojančios sekos dalis pakeista DNR fragmentu, koduojančiu tas pačias aminorūgštis, bet susidedančiu iš kitos nukleotidų sekos, tokiu būdu, kad sumažėja smeigtukų pavidalo struktūrų susidarymas arba iš viso nuo jų apsaugoma. Pagal specifinį šio išradimo įgyvendinimą, kuriam teikiama pirmenybė, natūrali seka, koduojanti proapo A-I aminorūgštis nuo -6 iki +14, pakeičiama tokia seka (nurodyta tik viena grandinė):
5’-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAG
AGTTAAGGACTTG-3’ į kurią įeina papildomas transliacijos iniciacijos ATG kodonas ir modifikuoti kodonai 6, 1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11, +14 aminorūgštims.
DNR atžvilgiu šis išradimas skirtas taip pat replikatyviniams klonavimo vektoriams ir ekspresijos vektoriams, apimantiems rekombinantinę DNR seką, nurodytą aukščiau, kuri koduoja žmogaus proapo A-I. Atskiru atveju šis išradimas skirtas rekombinantinėms plazmidėms pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612, ir pNIV1613, kurių konstravimas yra čia žemiau aprašytas. Pirmos plazmidės pULB9291 ir pULB9292 turi proapo A-I modifikuotos struktūros geną, prieš kurį eina kodonas ATG ir kuris kontroliuojamas fago lambda P^ promotoriaus. Šios plazmidės yra tinkami E, coli ekspresijos vektoriai ir nukreipia žmogaus proapo A-I sintezę, kuris gali būti suskaldytas propeptidaze, gaunant susiformavusį autentišką žmogaus apo A-I. Plazmidė pULB9296, įvesta į E, coli nukreipia sujungto baltymo, susidedančio iš beta-galaktozidazės ir žmogaus proapo A-I, ekspresiją, kontroliuodama E. coli lac promotoriaus sritį. Kadangi šis sujungimo produktas dar turi propeptidazės suskaldymo seką, tai jis gali būti suskaldytas, taip gaunant autentišką subrendusį žmogaus apo A-I.
Plazmidė pULB9299 yra ekspresijos vektorius, tinkantis mielėms, ir turintis ERG3 promotoriaus ir transkripcijos terminatoriaus sritis, įgalinantis garantuoti efektyvią ekspresiją mielėse. Gautas žmogaus proapo A-I gali būti vėl suskaldytas propeptidaze, gaunant autentišką susiformavusį apo A-I.
Plazmidė pNIV1612 turi proapo AT struktūrinį geną, sujungtą su E. coli baltymo ompA signalinio peptido DNR seka, kontroliuojant lpp (lipoproteino) promotoriui ir lac promotoriui-operatoriui. Šioje struktūroje seka, koduojanti signalinį peptidą ompA, eina prieš proapo A-I seką be ATG transliacijos iniciacijos kodono. Ši plazmidė yra tinkantis E. coli sekrecijos vektorius ir nukreipia žmogaus proapo A-I, kuris gali būti išskiriamas periplazmoje be N-terminalinio mationino, sintezę. Plazmidė pNIV1613 yra pernešimo vektoriaus sekos DNR įvedimui iš žmogaus proapo A-I į bakulovirusą. Ji susideda iš bakuloviruso polihedrino promotoriaus ir proapo A-I struktūrinio geno, įskaitant ATG transliacijos iniciacijos kodoną.
Kartu su natūraliu bakulovirusu (Autographa californica branduolinės polihedrozės virusas, AcNPV) plazmidė pNIV1613 nukreipia proapo A-I sintezę vabzdžių ląstelėse ir gali vėl išsilaisvinti iš metionino po posttransliacinių modifikacijų vabzdžių ląstelėse.
Ir galiausiai šis išradimas skirtas taip pat ląstelių kultūroms ir mikroorganizmams, kurie transformuoti klonavimo vektoriumi arba ekspresijos vektoriumi, aprašytais aukščiau, ir, atskiru atveju, ląstelių kultūroms ir mikroorganizmams, kurie transformuoti ir kurie gali produkuoti žmogaus proapo A-I. Čia naudojamo transformuoti prasmė yra plati, kaip genetiškai modifikuoti ir jokiu būdu neapsiriboja siaura bakterinės transformacijos sąvoka.
Priklausomai nuo naudojamo vektoriaus tipo ir pasirinkto šeimininko gali būti naudojamas bet koks genetinės inžinerijos būdas, tinkantis norimos genetinės modifikacijos atlikimui, įskaitant transfekciją, transdukciją ir kt.
Ląstelių kultūros ir mikroorganizmai, gauti pagal šį išradimą, gali būti naudojami gauti žmogaus proapolipoproteiną A-I gamybos sąlygose fermentacijos būdu.
Šis išradimas buvo įgyvendinamas, naudojant tarp kitų E. coli K12 kamieną MM 294 (endoA thi-, hsdR, supE); šis kamienas buvo deponuotas Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje (ATCC Nr. 33625) be apribojimų priėjimui prie jo.
Tačiau gali būti panaudoti įvairūs kiti mikrobiniai kamienai, įskaitant žinomus E. coli kamienus tokius kaip E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC Nr. 31537, deponuotas 1979 birželio
d., be apribojimų), E. coli AR58, darinys Nr. 99 (ATCC Nr. 33956) su cIII ,cl 857, bio, netekusios lambda funkcijos delta H, tiekiamos firmos PL-PHARMACIA (J.E. MOTT ir kt. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, (1985) 88-92; G. DEVARE ir kt. Cell, 36 (1984), 43-49; E. coli JM101 (ATCC Nr. 33876) (J. MESSING ir kt., Nucleic Acids Res. 9, (1981) 309321), arba E, coli JA221 (lpp’, hdsM+, trpE5, leuB6, lacY, recAI/F', laqlq, lac+, pro+) (J. GHRAYEB ir kt., EMBO J., T, (1984), 2437-2442) ir kitus mikrobinius štamus, iš kurių daugelis yra deponuoti ir prieinami žinomuose mikroorganizmų deponavimo bankuose, tokiuose kaip Amerikos tipų kultūrų kolekcija (ATCC) - žiūr. ATCC katalogą. Šie mikroorganizmai apima, pvz., Bacilli, tokias kaip Bacillus subtilis ir kitos žarnyno bakterijos, iš kurių galima paminėti, pvz., Salmonella Typhimurium ir Serratia marcesans, panaudojant plazmidės, kurios gali replikuotis ir ekspresuoti heterologinių genų sekas.
Ekspresijos plazmidės naudojimui bakterijoms, pvz., E. coli, paprastai gaunamos iš plazmidės pBR322, naudojamos kaip vektorius (deponuota ATCC su Nr. 37017), ir atitinkamai įterpiant heterologinio geno sekas kartu su transliacijos iniciacijos ir užbaigimo signalais, skaitymo rėmelyje su funkciniu promotorium, teikiant pirmenybę natūralioms arba dirbtinai sudarytoms kirpimo vietoms. Šis vektorius bus vieno arba kelių charakteringųjų atrinkimo pagal fenotipą genų ir replikacijos šaltinio amplifikacijos šeimininko viduje užtikrinimui nešiklis. Šis heterologinis intarpas gali būti vėl išreikštas tokiu būdu, kad būtų gauta ekspresija kartu su priešeinančia sujungta seka, gauta, pvz., iš genų sistemos lac.
Šie bakuloviruso ekspresijos vektoriai, pvz., pAcRP6 arba pAcYMl (Y. MATSUURA ir kt., J. Gen. Virol., 68, (1987), 1233-1250) ir laukinio tipo bakulovirusas (branduolinės polihendrozės Autographa californica virusas AcNPV) dabar yra plačiai naudojami. Jie smulkiai aprašyti literatūroje ir gali būti gauti Texas eksperimentinėje ūkio stotyje.
Pagal šį išradimą galima naudoti taip pat įvairias vabzdžių ląsteles kaip šeimininką suderinamiems ekspresijos vektoriams, pvz., ląsteles Spodoptera frugiperda Sf9 (M. D. SUMMER and G. E. SMITH, A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect cell culture Procedures, Texas University, College Station, (1987); ATCC CRL 1711).
Pagal šį išradimą, gali būti naudojami įvairūs mielių kamienai, kaip šeimininkai suderinamiems ekspresijos vektoriams, tokiems kaip plazmidė YRp7 (D.T. STINCHCOMB ir kt., Nature, 282, (1979), 39-43), kuri sugeba atrinkti ir replikuoti kartu ir E. coli, ir mielėse, atskiru atveju, Saccharomyces cerevisiae.
Tinkami naudojimui mielių kamienai yra kamienas RH218 (G. MIOZZARI ir kt., J.
Bacteriol., 134, (1987), 48-59), deponuotas Amerikos kultūrų tipų kolekcijoje be apribojimų (ATCC Nr. 44076), kamienas 10S44c (T. CABEZON ir kt., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 81, (1984), 6594-6598), kuris turi genotipą leu2-3, leu2-112, pep4-3 (M.
HOYLAERTS ir kt., FEBS lett. 204, (1986), 83-87) ir kamienas Ic 1697d (arg J., Įeu2-1), braditrofinis argininui (ATCC Nr. 20631).
Heterologinio geno, tokio kaip žmogaus proapo A-I kDNR ekspresijai mielėse būtina sudaryti plazmidinį vektorių, turintį keturis komponentus.
Pirmas komponentas yra fragmentas, kuris įgalina transformaciją kartu ir E. coli, ir mielėse, ir kuris dėl to turi turėti selekcijos geną iš kiekvieno organizmo. Tai gali būti genas, atsakingas už atsparumą ampicilinui iš E. coli (žiūr. AmpA) ir genas leu2 iš mielių. Šis komponentas taip pat reikalauja replikacijos šaltinio iš abiejų organizmų, kad išsilaikytų kaip plazmidinė DNR šiuose dviejuose organizmuose. Tai gali būti šaltinis R coli, kilęs iš pBR322 ir šaltinis arsi mielių chromosomos III arba 2ų ciklinės DNR replikacijos šaltinis.
Antras plazmidės komponentas yra seka, išdėstyta stipriai išreikšto mielių geno padėtyje 5' žemiau patalpinto struktūrinio geno transkripcijos įgyvendinimui. Ši seka, išdėstyta padėtyje 5', gali būti seka, kilusi iš mielių genų TDH3 arba ARG3. Šis fragmentas sudarytas tokiu būdu, kad pašalina struktūrines sekas TDH3 arba ARG3, kurios pakeičiamos seka, turinčia alternatyvius restrikcijos saitus, pvz., restrikcijos saitus Ncol arba BamHI sėkmingam šios sekos, išdėstytos 5' padėtyje, sujungimui su struktūriniu genu.
Trečias sistemos komponentas yra struktūrinis genas, sudarytas tokiu būdu, kad turi kartu ATG transliacijos iniciacijos ir transliacijos užbaigimo signalą.
Ketvirtas komponentas yra mielių DNR seka, turinti seką, išdėstytą mielių geno padėtyje 3', kuri turi savyje atitinkamus transkripcijos užbaigimo ir poliadenilinimo signalus. Pvz., plazmidės, nukreipiančios žmogaus proapo A-d gamybą mielėse, gali būti gautos, įterpiant žmogaus proapo A-I polipeptido geno fragmentus į ekspresijos plazmidės pRIT10774, aprašytos EP paraiškoje Nr. 151102, BamHI saitą.
Papildomos skiriamosios šio išradimo ypatybės paaiškės iš toliau pateikiamo tinkamesnių vektorių, apimančių rekombinantinę DNR pagal šį išradimą, ir sąlygų, kuriose šie vektoriai gali būti naudingai panaudoti, aprašymo.
Aprašyme pateiktos tokios figūros:
Fig. IA, B pateikta žmogaus preproapo A-I nukleotidų ir aminorūgščių seka. Žmogaus preoapo A-I informacinės DNR nukleotidų seka, gauta iš cDNR klono pULBl609 DNR sekos analizės. Aminorugštys, kurios yra signaliniame peptide, propeptide ir susiformavusiame apo A-I polipeptide, yra identiškos ir jos numeruotos nuo baltymo apo A-I pirmos aminorūgščių grupės. Pabraukta sritis, kuri atitinka parinktą sintezuotos DNR sekos prabą, naudojamą šio klono išskyrimui. Raidiniai aminorūgščių sutrumpinimai yra tokie: A, alaninas; C, cisteinas; D, asparagino rūgštis; E, gliutamino rūgštis; F, fenilalaninas; G, glicinas; H, histidinas; I, izoleucinas; K, lizinas; L, leucinas; M, metioninas; N, asparaginas; P, prolinas; G, gliutaminas; R, argininas; S, serinas; T, treoninas; V, valinas; W, triptofanas; ir Y, tirozinas.
Fig. 2 pateikta oligonukleotidinio adapterio DNR fragmento, koduojančio subrendusio apo A-I 6 aminorūgščių peptidą ir 14 pirmų aminorūgščių polipeptidą, sintezės schema kartu su ATG iniciacijos kodonu. Rodyklės rodo oligonukleotidus, naudojamus 65/61 pagrindinių porų NCOI- Bali fragmento sintezei.
Fig. 3 parodytas plazmidės pULB9291, kuri turi reguliacines zonas lambda P^, sudarymas ir proapo A-I nukleotidų seka.
Fig. 4 parodytas plazmidės pULA9296, kuri turi E. coli lac promotorių, sudarymas ir betagalaktozidazės proapo A-I nukleotidų seka.
Fig. 5 parodytas plazmidės pULB9299, kuri turi ARG3 mielių reguliacines zonas, sudarymas ir proapo A-I nukleotidų seka.
Fig. 6A, B ir C parodytas plazmidės pNIV1612, kuri turi lac ir lpp reguliacines zonas, sudarymas; seka, koduojanti ompA signalinį peptidą ir proapo A-I nukleotidų seka.
Fig. 7 parodytas plazmidės pNIV1613, kuri turi polihedrino geno reguliacinę zoną, sudarymas ir proapo A-I nukleotidų seka.
Smulkus išradimo aprašymas
Ribonukleino rūgščią gavimas. Žmogaus kepenų bendra RNR buvo gauta guanidino chlorido metodu (R.A. COX, Methods Enzymol. XII, part B, (1968), 120-129). Šis bendros ribonukleino rūgšties preparatas buvo praleistas per kolonėlę su oligo(dT)celiulioze, norint gauti bendras poliA* RNRs (T.MANIATIS ir kt., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor, New York, 1982). Iš 10 g. žmogaus kepenų buvo gauta 200 ųg polyA+ RNR.
Komplementarios DNR (cDNR) gavimas in vitro sąlygomis. Atvirkštinės transkripcijos reakcijos, panaudojant kaip pradinį produktą 0.1-5 ųg poliA+ RNRs, buvo atliekamos, dalyvaujant oligo(dT)^2 jg (apytikriai 1 ųg; šaltinis BOEHRINGER). Paskui ši viengrandė cDNR transformuojama į molekulę su dviguba grandine (cDNRds), naudojant tą patį atvirkštinės transkriptazės fermentą. cDNRds preparatai, paprastai 1 ųg, buvo apdirbami SI nukleaze, sudarant bukus galus. Šie būdai gerai žinomi šios srities specialistams ir smulkiai aprašyti T. MANIATIS ir kt., nurodyta aukščiau. Paskui cDNRds buvo pailgintos oligo(ds) būdu, aprašytu L.VILLA-KOMAROFF ir kt., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, (1978), 3727-3731). Paprastai 100 ng cDNRds apdirbama terminaline dezoksinukleotidiltransferaze.
Paprastai pailginimai, atitinkantys 15 bazių, prijungiami prie cDNR molekulės 3' galų.
Pailgintos cDNRds klonavimas j plazmidės vektorių pBR322. Plazmidės pBR322 DNR buvo tiesiškai išlyginta fermentu PstI ir pailginta oligo (dG) būdu, aprašytu R.M. LAWN ir kt. (Nucleic Acids Res. (1981), 6103-6114).
Komplementarios DNR, pailgintos oligo(dC), sumaišomos lygiomis moliarinėmis porcijomis su plazmidės pBR322 DNR, pailginta su oligo (dG). Paprastai plazmidės recirkuliacijai buvo aneliuojama 50 ųg mišinio. Šios sąlygos gerai žinomos šios srities specialistams ir smulkiai aprašomos R.M. LAWN ir kt., žiūr. nuorodą aukščiau. Keli šimtai transformantų buvo gaunama atrenkant pagal augimą tetraciklino terpėje, atsparumą šiam antibiotikui suteikia plazmidė pBR322. Taip pat buvo tirtas transformantų jautrumas ampicilinui. Tie iš jų, kurie parodė jautrumą, turėjo chimerinę plazmidę, kadangi svetimos DNR įterpimas į vektorių daro neveikų ampicilino geną.
Selektyvus cDNR banko atrinkimas. E. coli transformantai buvo atrenkami su sintezuotais oligonukleotidais, pažymėtais prie 5' galo izotopu P atitinkančiais apo A-I geno fragmentą.
Žmogaus apo A-I nukleotidų seka jau yra žinoma (žiūr. P. CHEUNG ir L. CHAN, cituota aukščiau ir J.J. SEILHAMER ir kt., cituota aukščiau); tokiu būdu, yra patogu chemiškai sintezuoti N.D. SINHA ir kt. būdu (Nucleic Acids Res. 12, (1984), 4539-4557) oligonukleotidų fragmentą, kurio ilgis atitinka 22 bazes, atitinkantį geno 5' galą. Atrinkta seka yra tokia:
5'-GCTGCGGTGCTGACCTTGGGCCG-3'.
Prieš naudojant hibridizacijai sintezuotas oligonukleotidas fosforilinamas jo 5' gale, 32 panaudojant T4 polinukleotido kinazę (P-L Biochemicals) ir gama- P) adenozintnifosfatą. Žymėjimo ir hibridizacijos sąlygos gerai žinomos šios srities specialistams ir smulkiai aprašytos T. MANIATIS ir kt., cituota aukščiau, ir A BOLLEN ir kt. (DNA, 2, (1983), 255-264).
Ekspresijos plazmidžių sudarymas. DNR gavimo, DNR fragmentų išskyrimo būdai, o taip pat analizės, naudojant restrikcijos fermentus, sąlygos bei fragmentų sujungimo sąlygos gerai žinomos šios srities specialistams ir smulkiai aprašytos R.M LAWN ir kt., cituota aukščiau, ir yra taikomos šiame darbe.
Fragmento NCol-Ball sintezė. Fig. 2 smulkiai parodyti pagrindiniai 35'-narių 30-narių, 18narių ir 43-narių oligonukleotidų projektavimo principai, naudojami 65/61 bpNcol-Ball fragmento sintezei. Šie sintezuoti 30-nariai ir 18-nariai fragmentai buvo fosforilinami jų 5' gale, naudojant T4 polinukleotido kinazę (P-L Biochemicals). 1 ųg kiekvieno oligonukleotido, įskaitant nefosforilintus 35-narius ir 43-narius, buvo aneliuojami tris minutes 95°C temperatūroje 300 mM natrio acetate (PH 7.0), po to lėtai atšaldyti iki 4 °C. Aneliavimo mišinys kaip toks buvo naudojamas klonavimo operacijai ekspresijos plazmidės sudarymui.
DNR sekų nustatymas. DNR sekos analizė buvo atliekama būdais, aprašytais A.M. ΜΑΧΑΜ ir W. GILBERT (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, (1977), 5463-5467).
Baltymų analizė. Ląstelių sankaupos, turinčios optinį tankį OD^g lygų L buvo gaunamos įvairiose kamienų, turinčių žmogaus proapo A-I ekspresijos plazmidės pULB9291, pULB9292, pULB9296 or pULB9299, fermentavimo stadijose (transformuotų atitinkamai į E, coli kamieną AR58, JM101 arba į mielių kamieną 10S44c). Kiekvienas pavyzdys resuspenduotas 50 mM Tris-HCL buferyje, pH 6.8, turinčiame 2% natrio dodecilo sulfato (SDS), 6 M karbamido, 10% glicerolio ir 5% merkaptoetanolio, ir virinamas 3 minutes. Pavyzdžiai tiriami elektroforezės polikrilamido geliuose būdu (Nature, 227, (1970), 680685). Bendras baltymo kiekis nustatytas apdažant Coomassie Brilliant Blue dažu, ir sintezuotas žmogaus proapo A-I indentifikuojamas Western blot analizės būdu (žiūr.
A.BOLLEN ir kt., cituota aukščiau).
Rekombinantinių vektorių žmogaus proapo A-I ekspresijai bakterijose, mielėse ir vabzdžių ląstelėse, užkrėstose bakulovirusu, konstravimas
1. Žmogaus preproapo A-I pradinis cDNR klonas: pULB1609 fFig.lj.
Buvo atrinkta keli šimtai transformantų, gaunamų klonuojant cDNRds, atitinkančią žmogaus kepenų poliA+ RNR, į plazmidės pBR322 saitą PstI, naudojant 22-nario apo AI sintetinį bandinį, aprašytą aukščiau. Siame eksperimente vieno iš klonų hibridizacijos signalas buvo intensyvus. Šis klonas, pažymėtas pULB1609, buvo išskirtas, ir šio DNR intarpo, įterpto į rekombinantinę plazmidę, nustatyta DNR seka. Jos ilgis yra 878 bazių porų (bp); ji koduoja pilną preproapo A-I polipeptidą. Kaip parodyta Fig. 1, šis klonuotas DNR fragmentas turi 5' ir 3' nekoduojančias zonas (atitinkamai 19bp ir 55bp), 54bp seką, pCQV2 buvo aprašyta C. QUEEN, J. Mol. Appl. Genet., (1983), 1-10 ir lengvai prieinama.
Šio konkretaus tipo vektoriaus pasirinkimas nebūtinas: gali būti naudojamas bet kuris kitas vektorius, turintis promotorių ir pasroviui atitinkamą Ncol saitą. Apytikriai 0.1 ųg sintezuotų fragmentų, tokių kaip aprašyti aukščiau, ligųojami DNR ligaze T4, apytikriai su 1 ųg 744bp Ball-PstI fragmento, gauto iš plazmidės pULB1609, ir apytikriai su 1 ųg plazmidės vektoriaus pULB1221, atkirsto Ncol-Ball. Iki sujungimo operacijos 744 bp Ball-pstI fragmentas buvo apdorotas DNR polimeraze T4 tokiu būdu, kad vyktų ištemptų galų padėtyje 3' transformacija j laisvus galus. Šis būdas gerai žinomas šios srities specialistams ir smulkiai aprašytas T. MANIATIS ir kt., cituota aukščiau.
Po amplifikacijos kompetentiškose E. coli kamieno AR58 ląstelėse sudarytos plazmidės charakterizuojamos restrikcijos saitų analizės ir sintezuotų fragmentų bei jungimo saitų DNR sekos analizės būdu. Rekombinantinė plazmidė pULB9291 atitiko visus kriterijus, kadangi ji turėjo visus fragmentus teisinga tvarka ir teisingoje orientacijoje. Ji buvo naudojama ekspresijos tyrinėjimuose.
3, Bakterinio ekspresijos vektoriaus, turinčio sujungtas sekas, atitinkančias betagalaktozidazę ir žmogaus proapo A-I, sudarymas: pULB9296 (žiūr, Fig, 4)
Šioje struktūroje DNR seka, koduojanti žmogaus proapo A-I, buvo sujungta tesingo skaitymo rėmelyje pasroviui su beta-galaktozidazės DNR seka. Beta-galaktozidazės genas yra E. coli ekspresijos plazmidėje, pUR288, kuri yra laisvai prieinama (U. RUTHER and
B. MULLER-HILL, EMBO J. (1983), 1791-1794) ir kuri turi efektyviai indukuojamą promotorių lac ir atitinkamus restrikcijos saitus beta-galaktozės sekoje. Sukonstruota atitinkama rekombinantinė plazmidė, kaip parodyta Fig. 4. Pirmiausia plazmidės pUR288 seka buvo atkirsta BamHI, po to apdorota DNR polimeraze T4 ir vėl atkertama Salį. Paskui 805 bp DNR fragmentas sudarytas iš pULB9291, suskaidant KpnI, apdorojant DNR polimeraze T4 ir suskaidant Salį. Šie du fragmentai buvo sujungti vienas su kitu moliniu santykiu T4 DNR ligaze ir gauta plazmidė panaudota E, coli kamieno JM101, kuris yra plačiai paplitęs ir lengvai prieinamas kamienas (ATCC Nr. 33876), kompetentiškų ląstelių transformacijai. Transformantės buvo tikrinamos restrikcinės analizės būdu dėl teisingos žmogaus prepro A-I sekos orientacijos beta-galaktozidazės geno atžvilgiu ir atstatyto BamHI saito buvimo dviejų sekų sudūrime. Analizė parodė, kad žmogaus proapo A-I seka sujungta pasroviui beta galaktozidazės DNR sekos ir į teisingą skaitymo rėmelį. Viena iš transformančių pULB9296, patenkino visu kriterijus ir buvo naudojama ekspresijos eksperimentams.
4. Mielių ekspresijos plazmidės, turinčios žmogaus proapo A-I cDNR seką, konstravimas:
PULB9299 (Fig. 5)
Šioje struktūroje cDNR seka, koduojanti žmogaus proapo A-I, klonuojama tarp promotoriaus ir terminatoriaus signalų, kuriuos turi mielių ekspresijos plazmidė. Šiam eksperimentui buvo parinktas mielių ekspresijos vektorius pRIT 10774. Ekspresijos plazmidės pRIT 10774 konstravimas yra aprašytas EP paraiškoje Nr. 151, 102. Ji buvo sukonstruota pradedant, iš vienos pusės, iš plazmidės pRIT 10749, deponuotos ATCC Nr. 39133 pagal Budapešto sutarties nuostatus ir, iš kitos pusės iš E. coli-S cerevisiae šaudyklinio vektoriaus YEpl3, aprašyto J.R. BROACH ir kt., Gene, (1979), 121-133, kuris yra saugomas ATCC Nr. 37115 ir yra lengvai prieinamas. Vektorius pRIT 10774 gali lengvai replikuotis ir E. coli , ir mielėse, ir turi ornitinkarbamoilo transferazės transkripcijos terminatorių bei promotorių, atskirtus unikaliu restrikcijos saitu BamHI, patogiu svetimos DNR, turinčios nuosavą ATG transliacijos iniciacijos kodoną, įterpimui. Be to, šis vektorius turi 2μ mielių sekas, metabolinius markerius atrinkimui mielėse ir AmpA atrinkimo markerį šaudykliniam E. coli vektoriui. Tai ne vienintelis vektorius, kuris gali būti naudojamas žmogaus proapo A-I ekspresijai mielėse: gali būti naudojamas bet kuris kitas mielių vektorius, turintis reguliacinius signalus, ir tai veda prie kokybiškai vienodų rezultatų. Konstravimas iliustruotas Fig. 5, buvo atliekamas tokiu būdu. Plazmidės pRIT 10774 DNR tiesiškai išlyginamos naudojant fermentą BamHI, ir veikiamos DNR polimeraze T4. Iš kitos pusės, 810 bp DNR fragmentas gaunamas iš pULB9291, suskaidant fermentais Asp718 ir Salį, paskui veikiant DNR polimeraze T4. Šis fragmentas koduoja žmogaus proapo A-I ir apima transliacijos iniciacijos kodoną. Šie du fragmentai, gauti kaip aprašyta aukščiau, buvo susiuvami vienas su kitu ekvimoliniu santykiu DNR ligaze T4, ir šis mišinys buvo naudojamas kompetentinių E. coli MM294 ląstelių trasformacijai. Transformuojančių kontrolė buvo atliekama restrikcijos analizės būdu, įgalinant patikrinti žmogaus proapo A-I DNR sekos teisingą orientaciją promotoriaus ĄRG3 sekos atžvilgiu. Viena iš transformuojančių turi rekombinantinę plazmidę pULB9299, kuri patenkina šias sąlygas. Plazmidė pULB9299 buvo amplifikuojama E. coli ir naudojama mielių Saccharomyces cerevisiae kamieno 10S44c (pep4-3, leu2-3, leu2-112) sferoplastų transformacijai; (T. CABEZON ir kt. cituota aukščiau). Naudojant kamieną Ic 1679 (ATCC Nr. 20631), gaunami kokybiškai analogiški rezultatai. Paskui mielių transformantės buvo tiriamos dėl žmogaus proapo A-I ekspresijos.
5. Bakterinio sekrecijos vektoriaus, turinčio žmogaus proapo A-I cDNR seką, konstravimas: pNIV1612 (Fig. 6A, B, C)
DNR seka koduojanti žmogaus proapo A-I, sujungiama pasroviui teisingo skaitymo rėmelyje su E, coli Ompa baltymo signalinio peptido DNR seka. Šiam eksperimentui buvo parinktas sekrecijos vektoriaus pIN-III-ompA-2 (J. GHRAYEB ir kt., EMBO J., (1984), 2437-2442). Šis vektorius ir jo šeimininkas E. coli kamienas JA221 yra prieinami ir gali būti gauti Niujorko Valstybinio Universiteto Biochemijos skyriuje.
Šis sekrecijos vektorius turi stiprų lpp (lipoproteino) promotorių, promotoriausoperatoriaus lac fragmentą, represoriaus lac seką lacl ir atitinkamus restrikcijos saitus, išdėstytus betarpiškai po sekos, koduojančios signalinį ompA peptidą. Tinkama rekombinantinė plazmidė sukonstruota kaip parodyta Fig. 6A, B ir C. Pirmiausiai sekrecijos vektorius pIN-III-ompA-2 buvo tiesiškai išlygintas su EcoRI ir apdirbtas DNR polimeraze T4. Po to 805 bp DNR fragmentas išskiriamas iš pULB9291, suskaidytos iš eilės restrikcijos fermentais Kpnl ir Salį, po to apdirbant DNR polimeraze T4. Šis fragmentas koduoja žmogaus proapo A-I ir turi ATG transliacijos iniciacijos kodoną. Abu fragmentai, gauti kaip nurodyta aukščiau, susiuvami vienas su kitu ekvimoliniu santykiu, naudojant DNR ligazę T4, ir šis susiūtas mišinys naudojamas E. coli kamieno JA221 kompetentiškų ląstelių, kultivuotų terpėje M9 (J.H. MILLER, Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972, p. 431), turinčioje triptofano (200 mg/1), leucino (20 mg/1), laktozės (2 g/1) ir ampicilino (50 mg/1), transformacijai. Transformantės buvo parinktos pagal jų atsparumą ampicilinui ir buvo sijojamos su 18-nariu sintezuotu oligonukleotidu (tas pats, kuris buvo naudojamas adapterio sintezėje, kaip parodyta Fig. 2). Atrinktos transformantės buvo tikrinamos restrikcijos analize, nustatant, ar teisinga proapo A-I DNR sekos orientacija signalinio peptido, kurio nešiklis yra sekrecijos vektorius, sekos atžvilgiu (atstatomas taškas EcoRI šių dviejų sekų sujungime). Viena iš transformančių turi rekombinantinę plazmidę, tenkinančią šią sąlygą. Papildoma seka iš adapterio, pabraukta žemiau pateikiamoje nukleotidų sekoje:
5' GTA GCG GAG GCC GCT GAA TTC ATG AGA CAT TTC TGG 3'
Vai Ala Gln Ala Ala Glu Phe Met Arg His Phe Trp aa-6 buvo pašalinta kryptinga mutageneze. Tam buvo atlikta žemiau pateikiamo 24-nario oligonukleotido:
signalinis peptidas-> <-proapo A-I
5' GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3’
Vai Ala Gln Ala Arg His Phe Trp netekusio 12 papildomų bazių, sintezė, ir jis toliau buvo naudojamas pašalinti 12 bazių linkerio seką.
Mutagenezės atlikimui buvo naudojama Amersham sistema. Ji remiasi F. ECKSTEIN ir kt. būdu (Nucleic Acids Res. 13, (1985), 8765-8785). Šiuo būdu gaunama didelė produkto išeiga ir didžiausias efektyvumas iš visų egzistuojančių būdų: iki 95%. Pirmiausiai DNR sritis, kuri turi būti mutagenizuota, klonuojama į vektorių M13. Tam rekombinantinės plazmidės pIN-III-ompA-2 DNR fragmentas Xbal-Ball, turintis proapo A-I geną, įterpiamas j vektorių M13mpl9, atkirstą Xbal ir HindlI. Vektorius M13mpl9 komerciškai prieinamas; jis gali būti gautas iš Amersham firmos (Buckinghamshire, England). Tada mutageninis 24-naris nukleotidas hibridizuojamas vienagrandine matrica ir ištempiamas DNR polimerazės Klenow fragmentu, dalyvaujant DNR ligazei T4, kad būtų gautas mutantinis heterodupleksas.
Selektyvus nemutantinės grandinės pašalinimas galimas, įvedant tionukleotidą į mutantinę grandinę sintezės metu in vitro sąlygose, ir suskaidant nefosforotionuotą grandinę Ncil. Toks įtrūkimas turi saitą ekzonukleazei III, kuri suardo grandinę, kuri nėra mutantas. Tokiu atveju grandinė, kuri yra mutantas, naudojama kaip matrica žiedinės molekulės su dviguba grandine pertvarkymui, susidarant homodupleksinei mutantinei molekulei. Tokia mutagenezė patvirtinama atrenkant jungtį tarp signalinio peptido ir proapo A-I geno sekos pradžia. Rekombinantinė plazmidė pNIV1612 pertvarkoma, susiuvant vektoriaus pIN-III-ompA-2 fragmentą XbaI-HindIII su fragmentu Xbal-Ball DNR fragmentu, kuris netekęs 12 papidomų bazių, ir su proapo A-I geno fragmentu BalI-HindlI. Šie trys fragmentai liguojami DNR ligaze T4, ir šis mišinys naudojamas E. coli kamieno JA221 kompetentinių ląstelių transformacijai, kaip aprašyta aukščiau. Šios transformantės atrenkamos pagal atsparumą ampicilinui ir sijojamo 18-nariu oligonukleotidu, aprašytu aukščiau. Vienas iš transformantų turi rekombinantinę plazmidę pNIV1612. Šioje baigtinėje struktūroje seka, koduojanti signalinį peptidą ompA, eina prieš pilną proapo AI seką be kodono ATG (Fig. 6a, B ir C). E. coli transformantės išbandomos dėl proapo AI ekspresijos.
6. Pernešimo vektoriaus žmogaus proapo A-I cDNR sekos įvedimui j bakulovirusą konstravimas: pNIV1613 (Fig. 7)
Plazmidė pNIV1613, turinti žmogaus proapo A-I DNR seką, buvo sudaryta, išdėstant segmentą, išvestą iš klono pULB9291 pasroviui bakuloviruso polihedrino geno promotoriaus (Fig. 7). Šiame eksperimente buvo naudojamas bakuloviruso pernešimo vektorius pAcRP6 (Y. MATSUURA ir kt., J. Gen. Virol. 67, (1986), 1515-1529). Jis gali būti gautas iš Otavos Universiteto Mikrologijos ir Imunologijos skyriaus. Ši plazmidė turi polihedrino geno promotorių iki nukleotido -7 lyderinėje sekoje 5'; joje nėra polihedrino ATG kodono ir pirmųjų 170 nukleotidų sekos, koduojančios polihedriną. Pageidaujamas
BamHI saitas yra pasroviui nukleotido -7. Konstravimas, iliustruotas Fig. 7., buvo atliekamas taip. Plazmidės pAcRP6 DNR tiesiškai išlyginama su BamHI. Be to, 810 bp DNR fragmentas išskiriamas iš pULB9291, suskaidant restrikciniais fermentais Asp718 ir Salį. Sis fragmentas koduoja žmogaus proapo A-I ir turi ATG transliacijos iniciacijos kodoną. Šie du fragmentai ekvimoliniu santykiu kartu veikiami DNR polimeraze T4, susiuvami DNR ligaze T4 ir naudojami E. coli štamo AR58 kompetentinių ląstelių transformacijai. Šios transformantės atrenkamos pagal jų atsparumą ampicilinui, sijojamo
35-nariu P- žymėtu oligonukleotidų (žiur. Fig. 2), atitinkančiu proapo A-I DNR sekos dalį, ir restrikcine analize kontroliuojama proapo A-I DNR sekos teisinga orientacija polihedrino geno promotoriaus atžvilgiu. Viena iš šių transformančių turi rekombinantinę plazmidę pNIV1613, kuri tenkina šią sąlygą, ji naudojama ekspresijos eksperimentuose.
7. Žmogaus proapo A-I produkavimas transformuotais mikroorganizmais ml E. coli kamieno AR58 arba JM101 kultūros, tansformuotos atitinkamai pULB9291 ir pUFB9296, buvo kultivuojamos praturtintoje terpėje, papildytoje 50 pg/ml ampicilino (kultūrinis buljonas LB, žiūr. T. MANIATIS ir kt. eksperimento detalėms išaiškinti, čia cituota aukščiau), iki tol, kol optinis tankis ties 630 nm (OD ^θ) pasiekia 0.6. pULB9291 atveju promotoriaus lambda P^ indukcija buvo įgyvendinta, pakeičiant pradines kultūros augimo sąlygas nuo 30 °C iki 42 °C, taip kad vyksta promotoriaus lambda PL slopintojo inaktyvacija (M. ROSENBERG ir kt., Methods Enzymol. 101, (1983), 123-138). Indukcija buvo atliekama 20 minučių.
pULB9296 atveju promotoriaus lac indukcija įgyvendinama, įvedant į kultūrą, inkubuotą °C temperatūroje, cheminį induktorių IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktozidą) iki tol, kol pasiekiama galutinė 1 mM koncentracija (L) LORENZETT ir kt., cituota aukščiau). Indukcija vyko 60 minučių.
Iš kitos pusės, kultūros, susidedančios iš 20 ml mielių ląstelių 10S44c, transformuotų pULB9299, kultivuojamos 30 °C temperatūroje azotintos bazės mielėms terpėje (Difco), papildytoje gliukoze (1%) iki tol, kol optinis tankis ties 630 nm pasiekia 0.6. Nereikalingas nė vienas induktorius, kadangi šiuo konkrečiu atveju ekspresija savaiminė.
Atrenkami 1 ml aukščiau nurodytų kultūrų pavyzdžiai, ir jie centrifuguoj ami su 15 000 g penkias minutes. Gautos nuosėdos lizuojamos verdančiame natrio dodecilsulfate (SDS). Šios sankaupos suspenduojamos 50 μΐ buferio, turinčio SDS (5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 6 M karbamido, 5% 2-merkaptoetanolio ir 10 % glicerolio), ir ši suspencija buvo virinama 3 minutes 100 °C temperatūroje. Po to ekstraktai centrifūguojami su 15000 g 10 minučių. Taip šie pavyzdžiai buvo paruošti analizei elektroforeze ant poliakrilamidiniuose geliuose, turinčiuose 15 % arba 7.5 %, SDS, denatūruojančiose sąlygose (U.K. LAEMMLI, cituota aukščiau).
Po elektroforezės poliakrilamidiniai geliai buvo greitai perplauti 40 ml distiliuoto vandens ir 40 ml buferinio natrio fosfato (50 mM) tirpalo su pH 7.5. Po to šie baltymai elektriškai pernešami nuo gelių ant nitroceliuliozinio lapo per dvi valandas, esant 60 V ir 1.5 A tame pačiame buferiniame fosfato tirpale (T. CABEZON ir kt., cituota aukščiau). Nitroceliulioziniai lapai prisotinami albuminu (1%) 50 mM natrio fosfato buferyje, pH
7.5, tada jie inkubuojami kambario temperatūroje per naktį su triušio anti-žmogaus apo A-I serumu, praskiestu 1/500 (plazmidės pULB9296 atveju su monoklonaliniais pelės antibeta-galaktozidazės antikūnais) tame pačiame buferiniame tirpale, tik be albumino. Šie lapai penkis kartus perplauti 40 ml to paties fosfatinio buferio tirpalu ir po to inkubuojami 40 ml fosfatinio buferio tirpalo, turinčio 10 ųg/ml peroksidaze žymėto asilo anti-triušio antikūno arba anti-pelės antikūno serumo. Po 4 valandų inkubavimo kambario temperatūroje šie lapai buvo penkiskart perplauti 40 ml fosfatinio buferio tirpalo ir galiausiai ryškinami, pridėjus 50 ml ch,romogeninio substrato tirpalo (10 mg diaminobenzidino, 100 μΐ karbamido peroksido (10%), 100 mM Tris-HCl su pH 7.6). pULB9291 ir pULB9299 atveju buvo rastas vienintelis produktas, reaguojantis su antižmogaus apo A-I antikūnais. Šio produkto molekulinė masė atitinka molekulinę etaloninio natūralaus apo A-I masę. pULB9296 atveju buvo rastas sujungtas polipeptidas, kurio dydis atitinka beta-galaktozidazės ir proapo A-I polipeptidų sumai (144 kDa), reaguojantis su žmogaus anti-apo A-I serumu ir anti-beta galaktozidazės serumu. Šie išmatavimai nustatyti iš anksto pagal kalibracinę kreivę, paremtą molekulinės masės etalonų, esančių tuose pačiuose galuose, kaip ir ląsteliniai ekstraktai, migracija.
Kitame eksperimente 20 ml E. coli kamieno JA221 kultūrų, transformuotų pNIV1612, kultivuojama praturtintoje terpėje, papildytoje 50 μ g/ml ampicilino (maitinimo buljonas LB, žiūr. T. MANIATIS ir kt., cituota aukščiau), iki tol, kol optinis tankis ties 630 nm pasiekė 0.6, lac promotoriaus indukcija, įvedant į kultūrą, inkubuotą 37 °C temperatūroje, cheminį induktorių IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktozidą) buvo vykdoma iki tol, kol buvo pasiekta galutinė 2 mM koncentracija. Indukcija atliekama 60 minučių. Atrenkami šių kultūrų pavyzdžiai po 1 ml ir centrifūguojama su 15 000 g penkias minutes. Gautos nuosėdos surenkamos nedidelio osmotinio poveikio būdu, kad būtų išlaisvintos periplazminės frakcijos (D. KOSHLAND and D. BOTSTEIN, Cell, 20, (1980), 749-760), Išlasivinta frakcija buvo suspenduota buferiniame pavyzdžio tirpale, turinčiame SDS, minėto aukščiau, bet be karbamido, suspensija buvo pašildyta iki virimo, centrifūguota ir atliekama elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje (SDS koncentracija 12.5 %), ir imunodetekcinė analizė po elektroforezinio pernešimo. Sintezuoto proapo A-I frakcija randama šioje ląstelėje, bet ne periplazmoje. Taip yra dėl to, kad proapo A-I neišskiriamas, arba dėl to, kad osmotinio poveikio efektyvumas nėra optimalus. Proapo AI pagrindinė frakcija buvo rasta laisvoje būklėje šioje terpėje po osmotinio poveikio, tuo parodydama, kad ląstelės baltymą išskiria.
8, Užkrėstų bakulovirusu vabzdžių ląstelių žmogaus proapo A-I produkavimas
Rekombinantinė plazmidė pNIV1613 buvo naudojama kartu su laukiniu bakuloviruso kamienu, kad kartu įvyktų Spodoptora frugiperda ląstelių užkrėtimas kultūroje. Paėmus rekombinantinių virusų, netekusių polihedrino, prabą, buvo gautos rekombinantinės kolonijos. Rekombinantinis virusas, išvalytas nuo kolonijos, buvo naudojamas vabzdžių ląstelių užkrėtimui. Ši procedūra grai žinoma šios srities specialistams ir sulkiai aprašyta
M.D. SUMMERS and G.E. SMITH A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and insect cell culture Procedures, Texas University, College Station, (1987). Šis rekombinantinis virusas buvo tirtas dėl proapo A-I produkavimo imunologiniu Western blot analizės būdu ir elektroforeze poliakrilamidiniame gelyje (SDS koncentracija 12.5 %), po ląstelių buvo lizavimo RIPA buferiu (0.05 M Tris-HCl buferis, pH 7.2, turintis 0.15 M NaCl, 1 % Triton Χ100, 0.1 % SDS, 0.1 % natrio dezoksicholato ir 1 mM fenilmetilsulfonilo fluorido (PMSF)) ir apdorojimo verdančiu SDS. Buvo surastas vienas vienintelis produktas, reaguojantis su anti-žmogaus apo A-I antikūnais. Jo molekuiinė masė atitinka natūralaus apo A-I etalono molekulinę masę, ir šis ekspresuotas baltymas yra pagrindinis bendro baltymų kiekio komponentas. Proapo A-I koncentracija kultūros litrui, išmatuota paprasta radialine imunodifuzija (G. MANCINI ir kt. Immunochem. 2. (1965), 235-254), buvo apie 100 mg.
9. Žmogaus proapo A-I citoplazminis produkavimas E. coli. Nustatytos minimalios terpės panaudojimas
Citoplazminiam žmogaus proapo A-I produkavimui E, coli minimalioje terpėje buvo naudojama plazmidė pULB9292. Plazmidė pULB9292 buvo sukonstruota plazmidės pULB9291, koduojančios promotorių lambda P4, fragmento EcoRI-NcoI pakeitimu plazmidės pOTS fragmentu EcoRI-NcoI (M. ROSENBERG ir kt. Methods Enzymol. 101, (1983), 123-138). Vektoriaus pOTS fragmentas EcoRI-NcoI (G. DEVARE ir kt., Cell 36, (1984), 43-49) turi taip pat efektyvų ir reguliuojamą fago lambda P^ promotorių.
E, coli kamieno AR58, transformuoto plazmidė pULB9292, 20 ml kultūros auginta nustatytoje minimalioje terpėje. Minimalios terpės sudėtis tokia (1 litrui): 3 g Na2HPO4.2H2O; 3 g KH2PO4; 0.5 g NaCl; 1 g NH4CI; 1.37 mM MgSO4.7H2O; 29.5 μΜ FeCl2.6El2O; 236 μΜ MnSO4-H2O; 10 g gliukozės; 1 μg vitamino BĮ, 50 mg ampicilino;
LB buljono 1/20 (tūr./tūr.). Ląstelės buvo kultivuojamos šioje minimalioje terpėje iki tol, kol optinis tankis ties 630 nm pasiekė 0.5. Promotoriaus lambda P^ indukcija pasiekiama, pakeičiant pradines kultūros augimo sąlygas nuo 30 iki 42 °C taip, kad būtų inaktyvuotas promotoriaus lambda P^ slopintojas (M. ROSENBERG ir kt., cituota aukščiau).
Indukcija vykdoma 60 minučių. Buvo atrinkti kultūrų pavyzdžiai po 1 ml ir praleisti per
French presą arba centrifūguoti su 15000 g penkias minutes. Gautas bendras ląstelinis ekstraktas arba nuosėdos apdirbamos SDS verdant, kaip aprašyta 7 sk. Po elektroforezės ir Western blot analizės gautas vienas vienintelis produktas, kuris reaguoja su antižmogaus apo A-I antikūnais. Šio produkto molekulinė masė atitiko etaloninio natūralaus apo A-I molekulinę masę. Ekspresuoto proapolipoproteino A-I kiekis nustatytoje minimalioje terpėje sudaro 13.5 % bendro baltymo kiekio t.y., apskaičiuota proapo A-I koncentracija sudaro maždaug 270 mg kultūros litrui.
10. Žmogaus proapo A-I, produkuojamo transformuotais mikroorganizmais, išskyrimas, valymas ir charakterizavimas
10.1. Išskyrimas ir valymas
Proapo A-I rekombinanto nevalyti ekstraktai centrifūgųojami 15 minučių su 4000 g ir nuosėdos išskiriamos. Spernatantas centrifūguotas su 100000 g dvi valandas. Gautos nuosėdos buvo suspenduotos minimaliame buferinio tirpalo tūryje (TEN100), turinčiame 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 1.75 pg/ml PMSF ir 100 ųg/ml natrio mertiolato (etilgyvsidabrio-tionsalicilo rūgšties natrio druska), ir nurodyti suspencijos bei supernatanto tūriai atskirai vienas nuo kito praskiesti iki pradinio ekstrakto tūrio su tokiu buferiniu tirpalu. Po to baltymas nusodinamas abiejose suspensijose, didinant izopropilo alkoholio koncentraciją. Radialinės imunodifuzijos būdu (G. MANCINI ir kt., cituota aukščiau), panaudojant pramoninį apo A-I etaloną, buvo nustatyta kiekvienos suspensijos nusodinto baltymo frakcija, kuri sudarė pagrindinę imunoreaktyvumo dalį, atitinkančią žmogaus apo A-I. Tokiu būdu gauta kiekviena frakcija toliau gryninama chromatografijos būdu Sephacryl S200 kolonėlėje, panaudojant tą patį buferinį tirpalą kaip eliuentą. 0.9 ml frakcijos buvo surinktos, ir radialinės imunodifuzijos būdu kiekvienoje frakcijoje buvo nustatytas bendras baltymo, pasižyminčio imunoreaktyvumu, atitinkančiu apo A-I imunoreaktyvumą, kiekis. Baltymo, išplauto eliuciją šiose frakcijose, molekulinė masė nustatoma kalibruojant kolonėlę žinomos molekulinės masės etalonais, tokiais kaip aldolazė, jaučio serumo albuminas, ovalbuminas, chimotripsinogenas ir citrochromas C2 identiškose sąlygose. Proapo A-I grynumas 1-am mg bendro baltymo pagrindinėse frakcijose, turinčiose tą patį imunoreaktyvumą, kaip ir pramoninio apo A-I etalono, buvo 95 %.
10.2. Charakterizavimas
10.2.1. Fizinės rekombinantinio proapo A-I savybės
Centrifūguojant su 100000 g rekombinantinį proapo A-I, išvalytą ir atskirtą nuo supernatanto, nuosėdų izoelektriniu fokusavimu pagal N. CANSIMPOOFAS (Anai. Biochem. 26, (1969), 54-62) ir naudojant savaiminį pH gradientą nuo 4 iki 6, buvo gauta viena vienintelė juosta su izoelektriniu tašku 4.95. Plazmos apo A-I buvo truputį labiau rūgštinis ir jo izoelektrinis taškas buvo 4.75. Šis 0.2 skirtumas pH dydyje tarp rekombinantinio apo A-I ir plazmos A-I izoelektriniu taškų gerai atitiko tą skirtumą, kuris kaip buvo pranešta aukščiau, lygus 0.17 (G.L. MIFLS ir kt., Lab. Tech. Biochem. Mol. 14, (1984), 244-245). Kai dėl molekulinės masės, nuosėdų ir supernatanto rekombinantiniai proapo A-I abu susidėjo iš vienos vienintelės identiškos 29.9 ±1.4 kDa molekulinės masės polipeptidinės grandinės. Žmogaus plazmos apo A-I buvo truputį mažesnis turėjo molekulinę masę, lygią 29.3 ±1.3 kDa.
10.2.2. Rekombinantinio proapo A-I peptidinio žemėlapio sudarymas su BNPS-skatolu
Buvo atliekamas cheminis suskaldymas su 3-bromo-3-metil-2-[(2-nitrofenil)tio]-3Hindolu (BNPS-skatolu) pagal A.FONTANA būdą (Methods Enzym. 25, (1972), 419-423). 5-10 ųg išvalytų baltyminių preparatų buvo ištirpinta 100 ųl fenolio tirpalo (0.15 % tūrio %), vandeniniame (50 tūrio %) acto rūgšties tirpale. Tada buvo pridėta 50 ųl BNPSskatolo (4.8 mg mililitrui) tirpalo ledinėje acto rūgštyje, po to inkubuojama 25 °C temperatūroje 72 valandas. Paskui buvo pridėta 50 ųl 2-merkaptoetanolio ir vėl inkubuojama 37 °C temperatūroje 5 valandas. Pavyzdžiai buvo išgarinti, vėl ištirpinti 100 ųl vandens ir ekstrahuoti 200 ųl etilo acetato. Organinės fazės buvo atskirtos, o vandeninės fazės liofilizuotos bei analizuojamos SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze.
Cheminio suskaldymo su BNPS-skatolu atveju fragmentų iš apo A-I skaičius ir dydis gali būti daugiau ar mažiau numatytas, kadangi naudojamose eksperimento sąlygose BNPSskatolas selektyviai skaldo po triptofano likučių. Jei darysime prielaidą, kad skilimo efektyvumas yra 100 % kiekviename skilimo taške, didžiausias fragmentas, kurio galima tikėtis, yra C-galo 15.4 kDa fragmentas. Likusių fragmentų molekulinė masė yra nuo 0.5 iki 5.3 kDa ir tuo būdu jie yra per maži, kad juos galima būtų nustatyti. Nepilno skilimo atveju 15.4 kDa fragmentas bus išplėstas N-galo kryptimi, taip gaunant atitinkamai 20.7 kDa, 23.1 kDa ir 27.6 kDa fragmentus. Šie numatymai yra puikiai patvirtinami žmogaus plazmos apo A-I ir įvairiems išvalytiems rekombinantinio proapo A-I preparatams.

Claims (13)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Rekombinantinė DNR seka, besiskirianti tuo, kad ji apima seką, kuri koduoja žmogaus proapolipoproteiną A-I, kurioje natūralios koduojančios sekos dalis yra pakeista DNR fragmentu, koduojančiu tas pačias aminorūgštis, bet susidedančiu iš kitos nukleotidų sekos, taip kad sumažinamas arba visai panaikinamas smeigtukų pavidalo struktūrų susidarymas.
  2. 2. DNR seka pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad natūrali seka, koduojanti proapoliproteino A-I aminorūgštis nuo -6 iki +14, yra pakeista tokia seka (nurodyta tik viena grandinė):
    5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGG
    GATAGAGTTAAGGACTTG-3' ir nurodyta seka apima papildomą ATG transliacijos iniciacijos kodoną bei modifikuotus kodonus aminorūgščių grupėms -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, + 11 ir +14.
  3. 3. Replikuojamas klonavimo vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis apima rekombinantinę DNR seką pagal 1 arba 2 punktą.
  4. 4. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis apima rekombinantinės DNR seką pagal 1 arba 2 punktą, operaciniu būdu sujungtą su reguliacine DNR seka ir apsuptą transliacijos iniciacijos ir užbaigimo signalais.
  5. 5. Ekspresijos vektorius pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacinė DNR seka apima fago lambda promotoriaus sritį.
  6. 6. Ekspresijos vektorius pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad žmogaus proapolipoproteino A-I DNR seka yra sujungta pasroviui beta-galaktozidazės DNR sekos ir reguliacinė DNR seka apima prmotoriaus lac sritį.
  7. 7. Ekspresijos vektorius pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacinė DNR apima mielių ARG3 promotoriaus ir transkripcijos terminatoriaus sritis.
  8. 8. Ekspresijos vektorius pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad žmogaus proapolipoproteino A-I DNR seka be ATG kodono sujungta pasroviui E, coli OmpA baltymo signalinio peptido DNR sekos, ir tuo, kad reguliacinė DNR seka apima promotoriaus lpp ir promotoriaus-operatoriaus lac sritis.
  9. 9. Ekspresijos vektorius pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad reguliacinė DNR seka apima polihedrino bakuloviruso geno promotoriaus sritį.
  10. 10. Rekombinantinė plazmidė, besiskirianti tuo, kad ji yra parinkta iš grupės, apimančios pULB9291, pULB9296, pULB9299, pNIV1612 ir pNIV1613.
  11. 11. Ląstelės kultūra arba mikroorganizmas, besiskiriantys tuo, kad jie transformuoti ekspresijos vektoriumi pagal bet kurį iš 4-9 punktų.
  12. 12. Ląstelės kultūra arba mikroorganizmas, besiskiriantys tuo, kad jie transformuoti rekombinantine plazmidė pagal 10 punktą.
  13. 13. Žmogaus proapolipoproteino A-I gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina transformuotos ląstelės arba mikroorganizmo pagal 11 arba 12 punktą kultivavimas tinkamose sąlygose ir taip produkuoto žmogaus proapolipoproteino A-I išskyrimas.
LTIP828A 1987-05-28 1993-08-03 Nucleic acid fragment which codes for human proapolipoprotein a-i LT3600B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878712540A GB8712540D0 (en) 1987-05-28 1987-05-28 Expression of human proapolipoprotein a-i

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP828A LTIP828A (en) 1995-02-27
LT3600B true LT3600B (en) 1995-12-27

Family

ID=10618034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP828A LT3600B (en) 1987-05-28 1993-08-03 Nucleic acid fragment which codes for human proapolipoprotein a-i

Country Status (33)

Country Link
US (1) US5059528A (lt)
EP (1) EP0293357B1 (lt)
JP (1) JP2634193B2 (lt)
KR (1) KR970000808B1 (lt)
CN (1) CN1031892C (lt)
AT (1) ATE89006T1 (lt)
AU (1) AU615654B2 (lt)
CA (1) CA1323851C (lt)
CY (1) CY1809A (lt)
CZ (1) CZ283648B6 (lt)
DD (1) DD291093A5 (lt)
DE (1) DE3880739T2 (lt)
DK (1) DK175686B1 (lt)
EG (1) EG19101A (lt)
ES (1) ES2054878T3 (lt)
FI (1) FI100056B (lt)
GB (1) GB8712540D0 (lt)
HK (1) HK137794A (lt)
HU (1) HU204562B (lt)
IE (1) IE62422B1 (lt)
IL (1) IL86480A (lt)
LT (1) LT3600B (lt)
LV (1) LV5288A3 (lt)
NO (1) NO179253C (lt)
NZ (1) NZ224808A (lt)
PL (1) PL158064B1 (lt)
PT (1) PT87562B (lt)
RU (1) RU2009198C1 (lt)
SG (1) SG131594G (lt)
SK (1) SK279166B6 (lt)
SU (1) SU1834904A3 (lt)
UA (1) UA19765A (lt)
ZA (1) ZA883824B (lt)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU587989B2 (en) * 1984-10-16 1989-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins
JP2606228B2 (ja) * 1987-09-18 1997-04-30 三菱化学株式会社 ヒトプロアポリポプロテインａ−ｉ様蛋白の産生法
DE68917379T2 (de) * 1988-05-31 1994-12-01 Mitsubishi Chem Ind Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die ähnlich dem natürlich-menschlichen Apolipoprotein-E sind.
US5460961A (en) * 1988-06-14 1995-10-24 La Region Wallonne Human myeloperoxidase and its therapeutic application
US5846799A (en) * 1988-06-14 1998-12-08 La Region Wallone Human myeloperoxidase and its therapeutic application
IT1229996B (it) * 1989-04-20 1991-09-20 Cesare Sirtori Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine.
JP4236698B2 (ja) * 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
US5844097A (en) * 1990-11-30 1998-12-01 Monoclonetics International, Inc. Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage
DE69115926T2 (de) * 1990-11-30 1996-05-30 Monoclonetics Int Verfahren zur diagnose chronischer niedriger rückenschmerzen und nackenschmerzen
GB9508618D0 (en) * 1995-04-28 1995-06-14 Applied Research Systems Therapeutic protein
SE9500778D0 (sv) * 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
US5994061A (en) * 1995-09-29 1999-11-30 Queen's University At Kingston DNA constructs and methods for screening for increased expression of human apo AI gene
SE9603068D0 (sv) 1996-08-23 1996-08-23 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
SE9603303D0 (sv) 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
SE9603304D0 (sv) 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a compound
KR100330355B1 (ko) * 1999-06-04 2002-04-01 장인순 회전유동발생 날개를 가진 덕트형 핵연료 집합체 지지격자
US20040047853A1 (en) * 2000-06-09 2004-03-11 Dahl Soren W Purified proenzyme of dipeptidyl peptidase i (pro-dppi)
EP1341919A2 (en) * 2000-12-12 2003-09-10 Lexicon Genetics Incorporated Novel human kinases and uses thereof
KR100560102B1 (ko) * 2004-06-25 2006-03-13 한국생명공학연구원 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제
US7427662B2 (en) * 2005-02-01 2008-09-23 Baord Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Inhibition of angiogenesis and destruction of angiogenic vessels by apolipoprotein A-I and high density lipoprotein
US8206750B2 (en) 2005-03-24 2012-06-26 Cerenis Therapeutics Holding S.A. Charged lipoprotein complexes and their uses
JP2009505652A (ja) * 2005-08-26 2009-02-12 セレニス セラピューティクス ホールディング エスア 乳酸菌においてアポリポタンパク質遺伝子生成物を生成するための組成物および方法
US20080293102A1 (en) * 2007-02-28 2008-11-27 Cerenis Therapeutics Holding, S.A. Compositions and methods for producing apolipoprotein
ES2727549T3 (es) * 2008-10-03 2019-10-17 Curna Inc Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la apolipoproteína a1 por inhibición del transcrito antisentido natural a la apolipoproteína a1
ES2993911T3 (en) 2008-11-10 2025-01-13 Arbutus Biopharma Corp Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
AU2010208035B2 (en) 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
NZ594995A (en) 2009-03-12 2013-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF HUMAN KINESIN FAMILY MEMBER 11 (Eg5) AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) GENES
CA2760776C (en) 2009-05-05 2019-07-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents
WO2010129799A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene
DK3431076T3 (da) 2009-06-10 2021-12-20 Arbutus Biopharma Corp Forbedret lipidformulering
AP3574A (en) 2009-08-14 2016-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
US10894098B2 (en) 2012-04-09 2021-01-19 Signablok, Inc. Methods and compositions for targeted imaging
US10525152B2 (en) 2009-10-09 2020-01-07 Signablok, Inc. Methods and compositions for targeted imaging
US12419839B2 (en) 2009-10-09 2025-09-23 Signablok, Inc. Methods and compositions for targeted delivery of protein fragments
US9687550B2 (en) 2009-12-07 2017-06-27 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011143362A1 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Esperion Therapeutics, Inc. Dimeric oxidation-resistant apolipoprotein a1 variants
CN103096875B (zh) 2010-06-03 2016-08-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的生物可降解脂质
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
CN103370054A (zh) 2010-11-09 2013-10-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
WO2012099755A1 (en) 2011-01-11 2012-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
DK2673296T3 (en) 2011-02-07 2019-02-18 Cerenis Therapeutics Holding Sa LIPOPROTEIN COMPLEXES AND PREPARATION AND APPLICATIONS THEREOF
JP6250543B2 (ja) 2011-09-27 2017-12-20 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質
US9610324B2 (en) * 2012-07-11 2017-04-04 Esperion Therapeutics, Inc. Apolipoprotein mixtures
RU2670614C9 (ru) * 2013-05-01 2018-11-23 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr
EP2853259A1 (en) 2013-09-30 2015-04-01 Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) Reconstituted high density lipoproteins composition and uses thereof
CN106488987A (zh) 2014-05-02 2017-03-08 塞勒尼斯医疗控股公司 Hdl疗法标志物
US11492616B2 (en) * 2016-10-27 2022-11-08 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences Method for modifying amino acid attenuator and use of same in production
US20190048049A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Cerenis Therapeutics Holding Sa Cargomers
US20190046608A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Cerenis Therapeutics Holding Sa Apomers
US11461863B2 (en) 2018-08-24 2022-10-04 Bright Marbles, Inc. Idea assessment and landscape mapping
US11081113B2 (en) 2018-08-24 2021-08-03 Bright Marbles, Inc. Idea scoring for creativity tool selection
US11189267B2 (en) 2018-08-24 2021-11-30 Bright Marbles, Inc. Intelligence-driven virtual assistant for automated idea documentation
US11164065B2 (en) 2018-08-24 2021-11-02 Bright Marbles, Inc. Ideation virtual assistant tools
US20240033322A1 (en) 2020-04-16 2024-02-01 Abionyx Pharma Sa Methods for treating acute conditions using lipid binding protein-based complexes
MX2023003877A (es) 2020-10-01 2023-04-18 Abionyx Pharma Sa Composiciones que comprenden complejos basados en proteina de union a lipidos para usarse en el tratamiento de enfermedades oculares.
AU2022258815A1 (en) 2021-04-15 2023-10-19 Abionyx Pharma Sa Use of lipid binding protein-based complexes in organ preservation solutions
EP4504150A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 Abionyx Pharma SA Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes
WO2023194798A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Abionyx Pharma Sa Methods for treating leukocytosis, endothelial dysfunction and carditis using lipid binding protein-based complexes
US20250360184A1 (en) 2022-06-10 2025-11-27 Abionyx Pharma Sa Methods for treating acute conditions using lipid binding protein-based complexes
WO2023237927A2 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Abionyx Pharma Sa Methods for treating hyperinflammatory conditions using lipid binding protein -based complexes
IL322074A (en) 2023-01-13 2025-09-01 Abionyx Pharma Sa Treatment using a lipid-binding protein molecule
WO2025093929A1 (en) 2023-10-31 2025-05-08 Abionyx Pharma Sa Lipid binding protein molecule therapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6198998A (ja) 1984-10-18 1986-05-17 Matsushita Electric Ind Co Ltd 電動送風機
EP0186643A1 (fr) 1984-11-23 1986-07-02 Région Wallonne représentée par l'Exécutif Régional Wallon Procédé de préparation de plasmides vecteurs capables de transformer un hôte bactérien Escherichia coli et d'y promouvoir et contrôler l'expression d'un ADN hétérologue
WO1986004920A1 (en) 1985-02-13 1986-08-28 Biotechnology Research Partners, Limited Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
WO1987002062A1 (en) 1985-10-04 1987-04-09 Biotechnology Research Partners, Ltd. Recombinant apolipoproteins and methods

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU587989B2 (en) * 1984-10-16 1989-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins
GB8507833D0 (en) * 1985-03-26 1985-05-01 Biogen Nv Production of human somatomedin c
GB8625435D0 (en) * 1986-10-23 1986-11-26 Erba Farmitalia Human apolipoprotein ai
EP0269260A3 (en) * 1986-10-29 1988-06-22 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apoai-ciii-aiv, apoaii apob, apoci, and ldl receptor polymorphisms for genetic fingerprinting and predictive of atherosclerosis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6198998A (ja) 1984-10-18 1986-05-17 Matsushita Electric Ind Co Ltd 電動送風機
EP0186643A1 (fr) 1984-11-23 1986-07-02 Région Wallonne représentée par l'Exécutif Régional Wallon Procédé de préparation de plasmides vecteurs capables de transformer un hôte bactérien Escherichia coli et d'y promouvoir et contrôler l'expression d'un ADN hétérologue
WO1986004920A1 (en) 1985-02-13 1986-08-28 Biotechnology Research Partners, Limited Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
WO1987002062A1 (en) 1985-10-04 1987-04-09 Biotechnology Research Partners, Ltd. Recombinant apolipoproteins and methods

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A M MAXAM AND W GILBERT: "A new method for sequencing DNA", PROC NATL ACAD SCI U S A., 1974, pages 560 - 564
BARKER W.C. ET AL.: "Evolution of lipoproteins deduced from protein sequence data", COMP BIOCHEM PHYSIOL, 1977, pages 309 - 315, XP025827046, DOI: doi:10.1016/0305-0491(77)90060-8
BREWER HB JR: "The amino acid sequence of human APOA-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteins", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., 1978, pages 623 - 630, XP024839665, DOI: doi:10.1016/0006-291X(78)91614-5
BROACH JR, STRATHERN JN, HICKS JB.: "Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene", GENE, pages 121 - 133
BROACH, J. R. ET AL.: "Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene", GENE, 121-133
GHRAYEB J ET AL.: "Secretion cloning vectors in Escherichia coli", EMBO J., 1984, pages 2437 - 2442
J E MOTT ET AL.: "Maximizing gene expression from plasmid vectors containing the lambda PL promoter: strategies for overproducing transcription termination factor rho", PROC NATL ACAD SCI U S A., 1985, pages 88 - 92, XP001064522, DOI: doi:10.1073/pnas.82.1.88
JEFFREY H. MILLER: "Experiments in Molecular Genetics"
JEFFREY J. SEILHAMER ET AL.: "Isolation and DNA Sequence of Full-Length cDNA and of the Entire Gene for Human Apolipoprotein AIâ€"Discovery of a New Genetic Polymorphism in the apo AI Gene", DNA, 1984, pages 309 - 317
L. VILLA KOMAROFF ET AL.: "A bacterial clone synthesizing proinsulin", PROC. NATI. ACAD. SCI. USA, 1978, pages 3727 - 3731
LORENZETTI R ET AL.: "Expression of the human apolipoprotein AI gene fused to the E. coli gene for beta-galactosidase", FEBS LETT., 1986, pages 343 - 346
MALLORY JB ET AL.: "Expression and characterization of human apolipoprotein A-I in Chinese hamster ovary cells", J. BIOL. CHEM., 1987, pages 4241 - 4247
MANIATIS T. ET AL.: "Molecular cloning"
MATSUURA Y, POSSEE RD, BISHOP DH.: "Expression of the S-coded genes of lymphocytic choriomeningitis arenavirus using a baculovirus vector", J GEN VIROL., 1986, pages 1515 - 1529
P CHEUNG AND L CHAN: "Nucleotide sequence of cloned cDNA of human apolipoprotein A-I.", NUCLEIC ACIDS RES, 1983, pages 3703 - 3715
RÜTHER U, MÜLLER-HILL B.: "Easy identification of cDNA clones", EMBO J., 1983, pages 1791 - 1794

Also Published As

Publication number Publication date
DK175686B1 (da) 2005-01-17
PT87562B (pt) 1992-09-30
DE3880739D1 (de) 1993-06-09
SG131594G (en) 1995-01-13
NO882341L (no) 1988-11-29
ZA883824B (en) 1989-02-22
US5059528A (en) 1991-10-22
SK363888A3 (en) 1998-07-08
CZ363888A3 (cs) 1998-02-18
PL158064B1 (pl) 1992-07-31
IE881597L (en) 1988-11-28
PL272698A1 (en) 1989-03-06
AU615654B2 (en) 1991-10-10
JPS6416589A (en) 1989-01-20
SK279166B6 (sk) 1998-07-08
HU204562B (en) 1992-01-28
IL86480A (en) 1992-08-18
LTIP828A (en) 1995-02-27
DK289688A (da) 1988-11-29
EG19101A (en) 1994-09-29
AU1672388A (en) 1988-12-01
EP0293357A1 (fr) 1988-11-30
LV5288A3 (lv) 1993-10-10
NO882341D0 (no) 1988-05-27
NO179253B (no) 1996-05-28
CN1031892C (zh) 1996-05-29
ES2054878T3 (es) 1994-08-16
DE3880739T2 (de) 1993-08-19
HK137794A (en) 1994-12-16
KR880014110A (ko) 1988-12-22
RU2009198C1 (ru) 1994-03-15
KR970000808B1 (en) 1997-01-20
FI100056B (fi) 1997-09-15
DD291093A5 (de) 1991-06-20
DK289688D0 (da) 1988-05-27
GB8712540D0 (en) 1987-07-01
CZ283648B6 (cs) 1998-05-13
HUT47153A (en) 1989-01-30
IE62422B1 (en) 1995-02-08
FI882456L (fi) 1988-11-29
NZ224808A (en) 1990-01-29
PT87562A (pt) 1989-05-31
CY1809A (en) 1995-10-20
CN88103118A (zh) 1988-12-14
ATE89006T1 (de) 1993-05-15
NO179253C (no) 1996-09-04
JP2634193B2 (ja) 1997-07-23
FI882456A0 (fi) 1988-05-25
IL86480A0 (en) 1988-11-15
UA19765A (uk) 1997-12-25
CA1323851C (en) 1993-11-02
EP0293357B1 (fr) 1993-05-05
SU1834904A3 (ru) 1993-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3600B (en) Nucleic acid fragment which codes for human proapolipoprotein a-i
US4743679A (en) Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
Ullmann One-step purification of hybrid proteins which have β-galactosidase activity
US6331414B1 (en) Preparation of human IGF via recombinant DNA technology
JP2708099B2 (ja) エリスロポエチン類縁体
US5187261A (en) Process for the preparation of mature human serum albumin
CZ292703B6 (cs) Mutantní proteiny lidského interleukinu-4
JPH04503301A (ja) 合成インターロイキン―６
JP2732556B2 (ja) 生物学的に活性なｈＮＧＦ
US5359033A (en) Cleaved dimers of mullerian inhibiting substance-like polypeptides
US4714674A (en) Chemotactic assay for immunogenicity
JP2002538757A (ja) 食欲制御活性を有するポリペプチド
US5656458A (en) Expression and processing of amino terminus acetylated FGF&#39;s in yeast
US20030207795A1 (en) Methods for the production of purified recombinant human uteroglobin for the treatment of inflammatory and fibrotic conditions
JPS61149089A (ja) Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
CA2002210C (en) Expression and processing of authentic fgf&#39;s in yeast
JPH0680697A (ja) ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製剤
JPS62158487A (ja) 突然変異体コ−デイング配列
Shibui et al. High-level expression of human proapolipoprotein AI in Escherichia coli using expression plasmids containing tandemly polymerized proapolipoprotein AI structural genes
EP0424512B1 (en) Antimetastatic peptides
Inukai et al. Effects of inserting eight amino acid residues into the major lipoprotein on its assembly in the outer membrane of Escherichia coli
DE69123242T2 (de) Physiologisch aktive Peptide, ihre Verwendung und eine Methode besagte Peptide herzustellen
EP0676412A1 (en) Purified human chondrocalcin, process for producing the same, and utilization thereof
JPS62190083A (ja) ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法
INUKAI et al. Effects of Inserting Eight Amino Acid Residues into the Major Lipoprotein on Its Assembly in the Outer Membrane of

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Free format text: 20010321 * MINISTERIE DE LA REGION WALLONNE,BE

MM9A Lapsed patents

Effective date: 20020803