JPH03240798A - １‐カルデスモンポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はカルデスモンの機能単位のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド及びそのＤＮＡ配列に関する。

〔従来の技術〕

カルデスモンは骨格筋、心筋を除くすべての組織に存在
しているカルモジュリン、アクチン、及びトロボミオシ
ン結合能を有するタンパク質で、平滑筋のアクチン−ミ
オシン系の調節機構に関与している。

この調節機構はカルシウムイオン濃度に依存した機構（
フリップ・フロップ制御）でアクチン−ミオシン系を制
御している〔ブロシーデイングズ　オブ　ザ　ナショナ
ル　アカデミーオブ　サイエンシーズ　オブ　ザ　ＵＳ
Ａ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪ
Ｓ＾）、第７８巻、第５６５２〜５６５５頁（１９８１
）　］。

カルシウムイオン濃度が低い時はカルデスモンはアクチ
ンフィラメント・トロポミオシン系に結合し、アクチン
−ミオシン間相互作用を抑制する。一方力ルシウムイオ
ン濃度の増加により活性型カルモジニリン・カルデスモ
ン複合体が形成され、この複合体はアクチンフィラメン
ト・トロポミオシン系から遊離する。この結果、カルデ
スモンによるアクチン−ミオシン間抑制作用が解除され
、アクチン−ミオシン間相互作用が起こる。

カルデスモンには、分子量の異なる２種類のアイソフオ
ームが存在する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果、高分子量（１２０−１５０ｋＤａ）のカルデ
スモンをｈ−カルデスモンと呼び、低分子量（Ｔｏ−８
０ｋＤａ）のカルデスモジを１−力ルデスモンと呼んで
いる。平滑筋組織ではｈ−カルデスモジが豊富に存在し
、非筋組織あるいは細胞では、ｌ−力ルデスモンが優位
である。

ｈ−カルデスモジのアミノ酸配列、及びそれをコードす
るＤＮＡの塩基配列は既に知られている〔バイオケミカ
ル　アンド　バイオフィジカル　リサーチ　コミュニケ
ーションズ（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、（：ｏｍｍｕｎ、　、以下ＢＢＲＣと略記する）
、第１６４巻、第５０３〜５１１頁（１９８９）］。

しかしながら、１−カルデスモジのアミノ酸配列は、゛
いまだ不明である。

細胞の形態変化は細胞ガン化の特徴的な指標として用い
られている。細胞形態の維持とアクチン構造とは密接に
関連しており、ガン化による細胞形態変化は細胞骨格を
構成するフィラメント系の１つであるアクチンケーブル
の形態変化・消失とよく一致する〔プロシーディングズ
オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシー
ズ　才ブ　ザ　ＵＳＡ、第７２巻、第９９４〜９９８頁
（１９７５）］。蛍光抗体法によりカルデスモジの細胞
内局在を調べたところ正常細胞ではアクチンケーブル、
細胞の器壁接着部位、及びラッフル部分に局在が認めら
れるが、ガン細胞では明確な局在場所がなくなることが
示されている［プロシーディングズオブ　ザ　ナショナ
ル　アカデミ−オブ　サイエンシーズ　オブ　ザ　ＵＳ
Ａ、第８１巻、第３１３３〜３１３７頁・（１９８４）
］。

また種々のガン遺伝子を持つウィルスを用いて培養細胞
をガン化させるとカルデスモン量が低下するが逆にリン
酸化の程度は上昇することが報告されている〔プロシー
ディングズ　オブザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンシーズ　才ブ　ザ　ＵＳＡ、第８１巻、第３１３
３〜３１３７頁（１９８４）及び細胞工学　別冊３「カ
ルシウムシグナリングの分子制御」第１４０〜１５３頁
（１９８７）］。

この様にカルデスモジと細胞のガン化による形態の変化
とは密接な関係にあることが示唆される。この因果関係
が解明されれば、カルデスモジはガンの治療薬となるこ
とが期待される。

更に、カルデスモジをコードするＤＮＡ配列はガンの診
断に用いられる可能性がある。

また、アクチン・トロポミオシン結合機能単位、又はカ
ルモジニリン結合単位だけを単離できればカルシウムイ
オン濃度にかかわらずアクチン−ミオシン間相互作用を
抑制又は促進できるため血管拡張物質あるいは消化管運
動促進調節物質として利用できる、可能性もある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、１−カルデスモンポリペブチドのＤＮ
Ａ配列を明確にすることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＩ−カルデ
スモジのポリペプチドに関する発明であって、図面の第
１！！Ｉで表されるアミノ酸配列を有していることを特
徴とする。

また、本発明の第２の発明は本発明の第１の発明のポリ
ペプチドをコードする塩基配列に関する。

本発明者らは、ニワトリｃＤＮＡライブラリーから１−
カルデスモンポリペブチドをコードするｃＤＮ＾クロー
ンを選び出し、その塩基配列分析から１−力ルデスモン
のアミノ酸配列を決定した。

そして、以下に記す知見に基づいて本発明を完成させた
。

以下、本発明を具体的に説明する。

カルデスモジが分布する組織から、Ｐｏ１ｙ（Ａ）”Ｒ
ＮＡを含む全ＲＮＡを抽出し、これをオリゴ（ｄＴ）を
結合させたセルロース担体等で精製する。これを鋳型と
して逆転写酵素を用いてｃＤＮ八合へを行う。ｃＤＮＡ
合成方法として岡山・バーブ法あるいはガブラーパホフ
マン法が知られている。このようにして合成してｃＤＮ
Ａをプラスミドやファージベクターに接続して、宿主に
導入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築する。

ｃＯＮ＾ライブラリーから１−力ルデスモンをコ−ドす
るｃＤＮＡクローンのスクリーニングは、既に公知であ
るｈ−カルデスモジｃＤＮＡ　（前記ＢＢＲＣ参照）を
３２ｐで標識したＤＮＡプローブを用いたプラークハイ
ブリダイゼーションの手法により行った。

組換え体ファージＤＮＡからｃＤＮＡを分離精製し、塩
基配列を決定する。

ｌ−力ルデスモジをタンパク質分解酵素又はシアン化ブ
ロマイド処理することによって得た分解物のＮ末端の部
分アミノ酸を決定し、これと塩基配列分析により決定し
たアミノ酸配列を比較することにより、クローンの確認
を行う。

以上のことから、本発明により、ｌ−カルデスモジの一
次構造が明らかとなった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ １−カルデスモジポリペブチドをコードするｃＤＮＡの
クローニング （１−１）　ｃＯＮ＾ライブラリーの構築ニワトリ胚の
脳から全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム法〔バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ）　、第１
８巻、第５２９４〜５２９９頁（１９７９）］により抽
出し、Ｐｏ１ｙ（Ａ）”　ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セ
ルロースカラムクロマトグラフィーを行って精製する。

精製したＰｏ１ｙ（＾）”　ＲＮＡを鋳型、オリゴ（ｄ
Ｔ）をプライマーとしてｃＤＮＡの合成をガブラー・ホ
フマン法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３〜
２６９頁（１９８３）　〕に従い行った。Ｔ１１ロＮ＾
ポリメラーゼよりｃＤＮＡの末端を平滑末端にした後、
ＢｃｏＲＩ−メチラーゼによりｃＤＮＡ内に存在する　
ＢｃｏＲＩサイトをメチル化した。更に　ＢｃｏＲＩ−
リンカ−〔ｄ　（ｐＧ−Ｇ−＾−＾−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ）
　）とｃＤＮＡをＴ、ＤＮＡリガーゼを用い連結させた
後、ＢｃｏＲＩ分解することにより両末端にＢｃｏＲＩ
サイトを持つｃＤＮＡを構築した。このｃＤＮＡとλｇ
ｔ　１１７ＢｃｏＲＩアーム（ストラドジーン社）をＴ
、ＤＮＡ　！Ｊガーゼを用いて連結させた後、ガイガパ
ックコールド（ストラド・ジーン社）によりインビトロ
パッケージングを行いｃＤＮ＾ライブラリーを構築した
。

（１−２）　ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニン
グ宿主菌として大腸菌Ｙ１０９０株を用いてプラークを
形成させた。すなわちＹ１０９０株をＬ培地に０．０２
％マルトースを含む培地で、３７℃で□−晩培養し、遠
心分離により集菌する。これを１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，
に懸濁したものとファージ液を混合し３７℃で１５分間
保温し、ファージを宿主菌に吸着させる。これを軟寒天
（１０ｍＭＭｇＳＯ＜を含むし培地−に終濃度０．６％
になるようにアガロースを加え、オートクレーブで処理
した後７８℃に保ったもの）を加え、Ｌ−プレート上に
広げた（以下、ブレーティングと略す）。

プレートを４２℃で３時間、更に３７℃で４時間保温し
、プラークを形成させた後、ナイロン膜、ハイボンド（
ｌｌｙｄａｎｄ）−Ｎ　（アマージャム社）をプレート
表面に重ね、１分又−は２分間放置する。ナイロン膜を
プレートからはがし、０、５　Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ
　ＮａＣ１溶液に５分間浸しく変性）、０．５Ｍ）リス
（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ！ｌｆｒ液（ｐＨ７，０）に５分
間浸す（中和）。更に、２ＸＳＳＣ（ＮａＣ１１７，５
３ｇ、クエン酸ナトリウム８．８ｇ／ｌ）ですすいだ後
、ろ紙上で乾燥させる。この後、ナイロン膜をＵＶラン
プで５分間照射してＤＮＡを固定する（以下、これら一
連の操作をフィルター処理と略す）。

上記のフィルター処理、をしたナイロン膜を、ランダム
プライムラベリングキット（宝酒造社）を用いて３２Ｐ
で標識したｈ−カルデスモジｃ　Ｏ−Ｎ　Ａをプローブ
として用い２．６ＸＳＳＣ，１％ＳＤＳ、　１００　μ
ｇ／５ｔｉｉ！ニシン精子ＤＮＡ、５Ｘデンハルト（口
ｅｎｈａｒｄ・１）　（ウシ血清アルブミン、ポリビニ
ルピロリドンを、それぞれ０．１％の濃度で含む）を含
む溶液中において、６５℃でハイブリダイゼーションを
行った。

次に、ナイロン膜を、１　ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ溶
液中において、５分間室温で洗浄した後、同溶液中にふ
いて３０分間６５℃で２回洗浄する。ナイロン膜を風乾
させた後、オートラジオグラフを行った。３０００００
クローン中５つのポジティブシグナルを得た。

シグナルに相当する位置のプラークを寒天ごと５０　Ｑ
ｕｉｔの５Ｍ溶液［５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、ｐｔ１７．５〕
に懸濁し、適度に希釈してブレーティングし、上記と同
様のスクリーニングを行い、５つのシングルファージを
単離した。

（１−３）組換え体λｇ　１１０ＮＡの調製衣にクロー
ン化したファージをそれぞれ１０５個程度ブレーティン
グし、４２℃で３時間、続いて３７℃で一晩保温した後
、１５−の３Ｍ溶。

液、数滴のクロロホルムを加え室温で３０分間放置する
。上層軟寒天をかき取り、５Ｍ溶液と共に遠沈管に入れ
３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離する。上清に４０
％　（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール６０００を終濃
度１０％になる様に加えよくかくはんした後４℃で１時
間放置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行う。

上清を捨て、沈殿物に数−の５Ｍ溶液を加えてかくはん
し、４℃保存する（以下、プレートライセード法と略す
）。

上記の方法でＩ　Ｘ　１０　”　ＰＦｔｌ／ｒｎｌの７
７−ジ液を得た。

Ｌ培地で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０株を集菌し、１
０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，に懸濁し、上記ファージ液と多重
感染度が０．０１になる様に混合し、３７℃で１５分間
保温する。ファージ・大腸菌混合液を１０　ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４を含むＬ培地に接種し、３７℃で溶菌した大腸菌
残渣が認められるまで培養する。塩化ナトリウム、クロ
ロホルムをそれぞれ終濃度が０．５Ｍ及び０．５％にな
る様に加え、更に３７℃で１５分間かくはんする。遠心
分離した上清にポリエチレングリコール６０００を１０
％　（Ｗ／Ｖ）になる様に溶かし、４℃で一晩放置する
。沈殿したファージを遠心分離して集めＴＭ溶液　（５
０ｍＭ）　　リ　ス　−）１ｃ’ｌ、　１　０　ｍＭ　
　Ｍｇ５口４、ｐＨ７，８）に溶かしグリセロールステ
ップグラジェント超遠心分離法（１９８２年、コールド
スプリング　ハーバ−ラボラトリ−発行、Ｔ。

マニアステイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）ほか著、
モレキユラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニ
ユアル（Ｍａｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）第８３〜８４頁〕
によりファージを精製する。

得られたファージをＴＭ溶液に懸濁し、０ＮａｓｅＩ及
びＲＮａｓｅ　Ａを加え３７℃で３０分間保温後、ＥＤ
ＴＡ、プロテネースＫ（シグマ社）、及びＳＤＳをそれ
ぞれ終濃度が２０ｍＭ、　５０　、ｕｇ／−１及び０．
５％になる様に加え６５−℃で１時間保温する。フェノ
ール抽出、ジエチルエーテル抽出を行い、水層に１７１
０量の５Ｍ塩化す）　ＩＪウム溶液と２倍量のエタノー
ルを加え、ＤＮＡを沈殿させた（以下、エタノール沈殿
と略す）。

遠心分離により沈殿したＤＮＡを回収し、７０％エタノ
ールで洗浄した後乾燥し、１００μ！のＴＥ溶液（１０
ｍＭ）リス−ＨＣｌ、１０ａ＋ＭＥｒＪＴＡ、　ｐＨ８
，０）に溶解させた。

（１，−４）挿入断片の塩基配列決定 光に調製した組換え体λｇｔ　１１　ＤＮＡをＢｃｏＲ
Ｉ分解し、挿入断片を分離、精製し、Ｍ　１３　ｍｐ　
１８ＲＦ　ＤＮＡのＢｃｏＲＩサイトにクローニングす
る。

組換え体Ｍ　１３　ｍｐ　１８　ＲＦ　ＤＮＡをＸｂａ
　Ｉ分解及びｓｐｈ　Ｉで分解した後、エキソヌクレア
ーゼ■を用いた手法〔続生化学実験講座１．「遺伝子研
究法１」第１８６〜２００頁（１９８６）：ｌによりＳ
ａｌ　ｌ末端から５′側に約３００ｂｐ（ベースペア）
ずつ欠失した変異体を作製した。挿入断片の方向が逆の
組換え体Ｍ　１３　ｍｐ　１８　ＲＦ　ＤＮＡについて
も同様の操作を行い欠失変異体を作製した。大腸菌ＪＭ
１０９をそれぞれのＭ　１３　ｍｐ１Ｂ誘導体ＲＦ　Ｄ
ＮＡで形質転換上、Ｍ　１３　ｍｐ　１８誘導体−本鎖
ＤＮＡを調製し、ジデオキシ法によって塩基配列を決定
し、アミノ酸配列を決定した（第２図）。すなわち第２
図は本発明のポリペプチドをコードする塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す図である。

〔発明の効果〕

以上の結果から、本発明により１−カルデスモジの全ア
ミノ酸配列及びそのＤＮＡ配列が明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のポリペプチドのアミ ノ酸配 列を示す図、 第２図は本発明のポリペプチドを コードする塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、図面の第１図で表されるアミノ酸配列を有している
   ことを特徴とするポリペプチド。２、請求項１記載のポ
   リペプチドをコードする塩基配列。