JPH08308564A - 組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法 - Google Patents

組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法

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JPH08308564A
JPH08308564A JP7118067A JP11806795A JPH08308564A JP H08308564 A JPH08308564 A JP H08308564A JP 7118067 A JP7118067 A JP 7118067A JP 11806795 A JP11806795 A JP 11806795A JP H08308564 A JPH08308564 A JP H08308564A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は組換えＤＮＡ法により形質転換され
た大腸菌を培養して、目的とするトランスグルタミナー
ゼを製造する方法において、大腸菌熱ショックタンパク
質（ＤｎａＪ）を共生産させることにより、その当該ト
ランスグルタミナーゼの過剰発現に伴う大腸菌体内での
不溶化を抑制し、生理活性を発現しやすい可溶化状態
で、該トランスグルタミナーゼを産生し、取得するとい
う製造法に関する。 【効果】 本発明の組換えＤＮＡ法によるトランスグル
タミナーゼの新規製造法は、従来の製造法に比べ、活性
を発揮しやすい形態でのトランスグルタミナーゼを極め
て著量に生産可能とする。この事は、食品産業上利用価
値が高いトランスグルタミナーゼを、大量にかつ安価に
供給する系を提供できるものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ法により
形質転換された大腸菌を培養して、目的とするトランス
グルタミナーゼ（以下、ＴＧと略する）を効率的に製造
する方法に関する。より詳細には、本発明はＴＧの過剰
発現に伴う大腸菌内での不溶化を抑制し、より生理活性
を発現しやすい可溶化状態でＴＧを産生し、取得すると
いう製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌を宿主に、組換えＤＮＡ技術を用
いて、菌体内に目的ポリペプチドを産生させることは、
現在広く用いられている手法である。しかしながら、目
的ポリペプチドを過剰産生させた多くの場合、その目的
ポリペプチドは、大腸菌体内に、本来の高次構造を持た
ずに、変性状態にて蓄積してしまう。一般には、菌体内
封入体と呼ばれる不溶性顆粒を形成しながら蓄積する
〔Schein, Bio/Technology, 7: 1141-1149(1989)〕。
【０００３】この不溶性顆粒から、生理活性を発現しう
る目的ポリペプチドを得る為には、一旦塩酸グアニジン
や尿素といった変性剤を用いた変性溶液中で、その顆粒
を処理し、その顆粒中のポリペプチドを解きほぐした後
に、適当な立体構造再生処理を行うという一連の煩雑な
操作が必須であった〔Kohno et al., in Methods inEnz
ymology vol.185, pp187〕。この立体構造再生処理とし
ては、（１）目的ポリペプチドを含む変性溶液を透析操
作にて、変性剤を徐々にぬき、該ポリペプチドの立体構
造を再生させる方法や、（２）目的ポリペプチドが分子
内ジスルフィド結合を有する場合などは、適当な濃度の
酸化型そして還元型グルタチオンを加えた酸化還元系の
変性剤中で、該ポリペプチドをインキュベートする手法
等が知られている。
【０００４】しかしながら、極めて再生効率の低い例や
あるいは、試験管内では立体構造を再生しきれない蛋白
質等もあり、このことは、大腸菌を宿主として組換えＤ
ＮＡ技術を用いても、最終的に正しい立体構造で活性を
発現できる目的ポリペプチドを取得する事が困難であっ
たり、あるいは、その取得の為には、極めて多大な労力
や精製コストが必要になる事を示している。また、組換
えポリペプチドを治療目的で投与する様な場合等は、不
完全に再生されたポリペプチドでは、これが生体中で抗
原性を発現する事になり、極めて大きな問題となってし
まう。
【０００５】上述したような不溶性顆粒形成問題の簡便
な解決方法の一つに、目的ポリペプチドを産生する為に
改良された微生物、特に大腸菌の生産培養温度を下げる
という手法が知られている〔Schein, et al., Bio/Tech
nology, 6: 291-294(1988),Kopetzki, et al., Mol.Ge
n.Genet., 216: 149-155 (1989)〕。しかし、この低温
培養の場合、生産宿主である大腸菌の生育速度の低下と
共に、目的ポリペプチドの生産量も低下するという欠点
があった。
【０００６】また、別の解決方法としては、目的ポリペ
プチドを大腸菌から分泌させる事で、立体構造を形成さ
せるという手法も報告されている。しかしながら、一般
に、大腸菌を宿主とした、外来ポリペプチドの分泌生産
性は低く、特にその目的ポリペプチドが、本来、非分泌
性のポリペプチドである場合などは、更に生産量は低い
とされる。
【０００７】そこで、目的ポリペプチドが可溶化状態
で、且つ、活性発現可能な状態で、菌体内に著量蓄積さ
せる為の技術開発が切望されていた。
【０００８】最近の研究によって、分子シャペロンと呼
ばれる一群の熱ショック蛋白質が、試験管内での蛋白質
の立体構造形成に極めて重要な働きをしている事が明ら
かになってきた〔Gething et al., Nature, vol.355, p
p33(1992)〕。それらの分子シャペロンは、各々の受け
持つ蛋白質の立体構造が崩れた時に、一時的に、それら
の蛋白質を安定化し、不適切な変性を防ぐ様に機能する
と考えられている。大腸菌においては、ＤｎａＫ、Ｇｒ
ｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ等が知られている。
【０００９】そのような背景の下、蛋白質の立体構造形
成にかかわる補助因子（分子シャペロン）の重要性が、
認識されるようになり、分子シャペロンの過剰発現によ
る目的ポリペプチドの不溶化抑制効果が研究されてき
た。ＤｎａＫ単独、あるいはＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳの
過剰発現による目的ポリペプチドの溶解性改善の成功例
としては、リーらによるプロコラゲナーゼの研究〔Lee,
et al.,J.Biol.Chem.267: 2849-2852 (1992)〕があ
る。
【００１０】最近、カスパースらは〔Caspers, et al.,
Cell. mol. Biol., 40: 635-644 (1994)〕プロテイン
チロシンキナーゼの大腸菌での発現の際に、（１）Ｇｒ
ｏＥＬとＧｒｏＥＳを同時に、あるいは（２）Ｄｎａ
Ｋ，ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ全てを同時に、その宿主へ導入
する事で可溶性のキナーゼ量の比率が増えたと報告して
いる。但し、それらのキナーゼは活性を発揮できる状態
かどうかは不明である。更に発現させたキナーゼの総生
産量は低下してしまうと報告している。一般に、蛋白質
合成速度を低下させると、該ポリペプチドの可溶性が増
すとされている為〔Kopetzki, et al., Mol.Gen, Gene
t., 216巻、149-155頁(1989)〕、彼らの報告では、実際
に分子シャペロンの機能効果なのか、分子シャペロンの
量産化の為に起こった宿主大腸菌の機能低下による効果
であるかは不明である。更に、彼らは、分子シャペロン
として、どの分子シャペロンの効果であるかは全く触れ
ていないし、溶解しているキナーゼが実際に、活性を発
揮したかどうかも不明である。
【００１１】さて、ＴＧはペプチド鎖内にあるグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル基転移反応を
触媒する酵素である。このＴＧはアシル受容体としてタ
ンパク質中のリジン残基のεアミノ基が作用すると、分
子内及び分子間にε−（γ−グルタミル）リジン架橋結
合が形成され、また、アシル受容体としてアミノ酸、ア
ミノ酸誘導体等の、一級アミンが存在した時は、それが
タンパク質に導入される。そして水がアシル受容体とし
て機能する時は、グルタミン残基が脱アミド化されグル
タミン酸残基になる反応を進行させる酵素である。
【００１２】ＴＧはゲル状食品、ゲル状化粧品をはじめ
としてヨーグルト、ゼリー及びチーズ等を製造する際に
用いられている（特公平1-50382、特開平64ー27471号等
参照）。
【００１３】ＴＧは微生物から哺乳類まで、存在する酵
素である。例えば、モルモット由来のもの〔Connellan,
et al., Journal of Biological Chemistry 246巻4
号、1093-1098頁、(1971)〕、ヒトの血液凝固第１３因
子〔Takahashi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83巻、8019-8023頁、(1986)〕、微生物由来のもの（特
開昭64-27471号参照）等が知られている。
【００１４】更に最近、我々は、魚類由来のＴＧの精製
に成功し、その遺伝子ｃＤＮＡを取得し、構造について
解明した（特開平7-23787号参照）。
【００１５】一方、ＴＧの組換えＤＮＡ技法による、大
腸菌を宿主とした生産例としては、モルモット肝ＴＧの
例〔Ikura, et al., Eur. J. Biochem. 187巻、705-711
頁(1990)〕やヒト血液凝固第１３因子の例〔Board, et
al., Thrombosis and Haemostasis, 63巻2号、235-240
頁(1990)〕が報告されているが、共に、それぞれの抗体
で、その生産量を検定する程度の極めて少量の発現量で
あると言える。
【００１６】我々は、先に組換えＤＮＡ技術を用い、真
鯛ＴＧの大腸菌を宿主にして、従来は思いもしなかった
大量発現生産に成功している（特開平６−２２５７７５
参照）。 しかし、そのＴＧを生産するように改変され
た大腸菌の培養を３７℃で行うと、産生されたＴＧは、
やはり菌体内に封入体を形成して、不活性体として蓄積
するにとどまっていた。一方、培養温度３０℃では、活
性を発揮するＴＧの生産に至るが、詳細にその蓄積状態
を解析すると、大腸菌の細胞抽出液中に回収されない不
溶性のＴＧは、生産されたＴＧの約４／５ある事が判明
した。つまり、培養温度３０℃でも、充分な可溶化状態
で該ＴＧが蓄積していない事が判明したのである。
【００１７】更に低温側の培養温度にて、該ＴＧの生産
菌を培養したところ、ＴＧの可溶性分子の比率は増加し
たものの、総生産量の顕著な低下がみられ、結局、従来
の方法では、大腸菌を宿主にして目的ポリペプチドであ
るＴＧを、更に極めて著量に蓄積させる有効な製造方法
がなかった。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】食品に馴染みの深い魚
由来ＴＧの食品製造における産業的応用を考えるに、該
ＴＧの大量、かつ安価な製造法の開発は待望されてい
る。その解決の為の中心課題は、量産化目的ポリペプチ
ドの生産宿主菌体内での不溶化阻止あるいは抑制技術の
開発にある。つまり、更なる量産化の為には、菌体内で
の不溶化ＴＧを可溶化し、活性発現可能な立体構造を保
持するＴＧとして、著量蓄積せしめる技術を開発する事
である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、研究当
初、既に公知技術である、ＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ，そ
してＤｎａＫの過剰産生による、目的ポリペプチドであ
るＴＧの可溶化能の検討を行った。しかしながら、従
来、報告されてきた、各シャペロンでは、全くその効果
を発揮できず、あるいは、逆に、宿主菌体の生育を阻害
してしまうという結果を得た。
【００２０】そこで、本発明者らは上記課題を解決すべ
く、様々なシャペロンの効果を鋭意検討を加えた結果、
従来のＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、やＤｎａＫとは異な
り、全く思いもよらないシャペロンの補助的因子である
ところのＤｎａＪが、目的ポリペプチドであるＴＧの菌
体内での可溶化蓄積、及び活性発現可能状態での著量蓄
積において、有効な効果を発揮する事を見いだした。更
に解析した結果、そのＤｎａＪが該ＴＧの可溶化に中心
的な役割を果たしており、そこへｄｎａＫ遺伝子産物が
追加する事で、よりその可溶化及び活性発現可能な状態
での蓄積効果が安定する事を見いだした。
【００２１】つまりは、ＤｎａＪ又はＤｎａＪ，Ｄｎａ
Ｋの過剰発現大腸菌を用いた宿主において、目的ポリペ
プチドを生産させる事で、目的ポリペプチドを即活性発
現可能な状態の可溶化状態にて著量蓄積させ、そして取
得できる事を発見し、このことにより、目的ポリペプチ
ドであるＴＧを極めて効率よく、且つ経済的に製造する
方法の開発に成功し、本発明を完成した訳である。
【００２２】本発明は全ての種類のＴＧに適用できる汎
用性の高い技術であるが、特に、魚由来のＴＧの生産に
は最もふさわしい技術である。本発明により、食品産業
上有益な酵素であるＴＧを安価に、効率的に、かつ大量
に生産することができる。
【００２３】即ち、本発明はＤｎａＪが過剰産生されて
いる大腸菌を宿主としたＴＧの製造法である。以下に本
発明を詳細に説明する。
【００２４】本発明は、上述したように、（１）ｄｎａ
Ｊ遺伝子、又は（２）ｄｎａＫ遺伝子及びｄｎａＪ遺伝
子の発現を強化した大腸菌宿主を用いたＴＧの製造法に
関するが、その一例としては、（１）ｄｎａＪ遺伝子、
あるいは（２）ｄｎａＫ遺伝子及びｄｎａＪ遺伝子を含
有するベクター及び目的ポリペプチドであるＴＧをコー
ドする遺伝子を含有するベクターを保持する大腸菌を培
養し、菌体内に活性発現可能な形態で蓄積した目的ＴＧ
を採取する事を特徴とするＴＧの製造法に関するもので
ある。
【００２５】ここに、ＤｎａＫとは大腸菌の主要な熱シ
ョックタンパク質のひとつで、熱以外にも様々な環境的
ストレスに対応して合成され、細胞内でのタンパク質の
立体構造形成過程において、重要な役割をもつ。一方、
ＤｎａＪは、ＤｎａＫの反応を補助する因子として知ら
れている〔Gething, et al., Nature, 355巻, 33-45頁
(1992)〕。
【００２６】それらのシャペロン遺伝子の取得方法とし
ては、（１）まず、それらの温度感受性株を用いて、そ
の温度感受性を相補できる遺伝子を、大腸菌の野生株の
染色体からクローニングする方法や、（２）それらシャ
ペロンのＤＮＡ塩基配列は公知であるので、ＰＣＲ法
（ポリメラーゼ連鎖反応法）によるクローニング等が挙
げられる。いずれの方法を用いても構わない。
【００２７】（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ、ｄｎ
ａＪ遺伝子の発現には、それぞれのプロモーターの利用
でもよいし、あるいは、ベクター上にあるものや大腸菌
由来のものを組み込んでもよい。例えば、trpプロモー
ター、lacプロモーターなどを用いる事もできる。
【００２８】これら（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａ
Ｋ，ｄｎａＪ遺伝子を組み込むベクターは市販されてい
るものでも、任意に各人が作製したものでもかまわな
い。しかしながら、一般には、目的ポリペプチドである
ＴＧの大量生産用プラスミドはpBR322由来か、pUC18やp
UC19由来である事が多い為、これらのプラスミドと共存
できるプラスミドベクターである事が望ましいため、pA
CYC184由来やpMW118由来のプラスミド等に代表されるプ
ラスミドベクターを用いるのが一般的である。このよう
に、熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードする遺伝子を
含有するベクターとＴＧをコードする遺伝子を含有する
ベクターの２種類のベクターを大腸菌内に保持させても
よい。
【００２９】また、一方で、これら（１）ｄｎａＪ又は
（２）ｄｎａＫ，ｄｎａＪの遺伝子発現系を、目的ポリ
ペプチドであるＴＧの遺伝子発現プラスミド上に組み込
んでもよい。このように、ｄｎａＪをコードする遺伝子
及びＴＧをコードする遺伝子が同一ベクター上に存在す
るベクターを用いても良い。
【００３０】更には、宿主大腸菌の染色体上にある
（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ，ｄｎａＪ遺伝子の
発現を強化した株を予め作製しておき、これを目的ポリ
ペプチドであるＴＧ生産の宿主としても用いる事もでき
る。
【００３１】それらシャペロン発現の強化方法は、該シ
ャペロン遺伝子の上流にlacプロモーター等の強力なプ
ロモーターを接続させたシャペロン発現系を試験管内
で、公知の方法により作製し、これを、元の大腸菌染色
体内の該シャペロン遺伝子と置換する方法や、染色体上
の該シャペロンの遺伝子の数を増幅させる方法による。
即ち、この方法はｄｎａＪ遺伝子の発現が増強された、
又は、ｄｎａＪの遺伝子量が増幅された染色体を有し、
かつＴＧをコードする遺伝子を含有するベクターを保持
する大腸菌を用いる方法である。
【００３２】一方、ＴＧの発現プラスミドは公開特許明
細書に記載された方法により取得できる（特開平6-2257
75、欧州出願公開EP-0555649A参照）。
【００３３】次に、ＴＧ遺伝子を搭載する発現ベクター
や、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ等の熱ショックタンパク質遺伝
子を搭載するベクターで形質転換された種々の形質転換
体について説明する。本発明に於いて形質転換体として
用いられる生物は大腸菌Ｋ−１２株である。この中でも
Escherichia coliＨＢ１０１株やＪＭ１０９株が好まし
い。これら形質転換体を適切な培地中で培養することに
より、真鯛ＴＧ遺伝子の発現産物である真鯛由来ＴＧを
細胞内に産生、蓄積させる。尚、形質転換は通常用いら
れる方法により行われる。例えば、カルシウムクロライ
ド法やエレクトロポレーション法等である。もちろん、
他の方法を用いても構わない〔Sambrook, et al., Mole
cular cloning: a Laboratory Manual. ColdSpring Har
bor Laboratory Press, New York(1989)〕。
【００３４】最後に、上記の形質転換体を培地中で培養
する事により、組換型ＴＧを製造する方法について説明
する。培養条件は、形質転換体や遺伝子発現系の種類に
応じて当業者が適宜決定し得るものである。また、発現
され細胞内に蓄積された当該ＴＧは、従来から公知の種
々の方法で単離、精製される。例えば、報告されている
天然の真鯛からの精製方法と同様の手法により〔Yasued
a, et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 58: 2041-2045
(1994)〕、遺伝子組換型ＴＧも精製できる。
【００３５】なお、ＴＧの活性は、ジメチル化カゼイン
とモノダンシルカダベリンを基質として反応を行い、取
り込まれたモノダンシルカダベリンに由来するカゼイン
の蛍光強度増加を測定することにより求める。反応組成
液を以下に記載する。 〈反応組成液〉 １．０ｍｇ／ｍｌ ジメチル化カゼイン ０．０１５ｍＭ モノダンシルカダベリン ３．０ｍＭ ジチオスレイトール ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ５ｍＭ 塩化カルシウム なお、後記実施例でも、特段の記載がない限り本条件を
採用している。
【００３６】上記反応組成液２．４ｍｌにＴＧ溶液２０
から１００μｌ加え、３７℃、３０分の反応を行った
後、５００ｍＭのＥＤＴＡを１００μｌ加えて反応を停
止させ、蛍光強度を測定する（島津社製 ＲＦー１５０
０、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍ）。
【００３７】
【実施例】以下、本発明を実施例に従って更に詳細に説
明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
【００３８】（実施例１） （真鯛由来トランスグルタミナーゼの製造法） （１）熱ショックタンパク質をコードするｄｎａＫ遺伝
子、ｄｎａＪ遺伝子、そしてｇｒｏＥＳＬ遺伝子群のク
ローニング 本発明者らは、各種熱ショック蛋白質の遺伝子を大腸菌
の染色体からＰＣＲ法によりクローニングした〔Erlic
h, et al., Nature, 331巻、461-462頁(1988)〕。
【００３９】各遺伝子、ｄｎａＫ〔Cowing, et al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 82巻、2679-2683頁(1985)、Bar
dwell, et al.,Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 81巻、848-
852頁(1984)〕、ｄｎａＪ〔Ohki, et al., J.Biol. Che
m., 261巻、1778-1781頁 (1986)〕、ｇｒｏＥＳＬ〔Hem
mingsen, et al., Nature, 333巻、330-334頁（１９８
８）〕の塩基配列は既に公知である。そこで、各２種の
ＤＮＡプライマーを作製した。まず、ｄｎａＫについて
は、プライマーＤＮＡＫ−０１（５’−ＣＣＴＴＧＡＴ
ＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＡＣＧ−３’）（配列番号１）と
DNAK-02(5'-CCTTCGCCCGTGTCAGTATA-3')（配列番号２）
を、ｄｎａＪについてはプライマーDNAJ-01(5'-CTGATGG
AATTCGCCCAGCA-3')（配列番号３）とDNAJ-02(5'-CGTGAG
AGGAATTCATCGGC-3')（配列番号４）をｇｒｏＥＳＬにつ
いては、GROELS-01(5'-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3')（配
列番号５）とGROESL-02(5'-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3')
（配列番号６）を作製した。なお、プライマーDNAJ-01
とDNAJ-02のＤＮＡ断片の5'端には制限酵素EcoRI切断認
識配列が組込まれている。
【００４０】大腸菌のゲノムDNAを鋳型として、それぞ
れのDNAプライマーを用いて、94℃１分間、37℃２分
間、72℃３分間の反応を２５サイクル行う条件にてＰＣ
Ｒ増幅を試みたところ、目的の各遺伝子、ｄｎａＫ、ｄ
ｎａＪ、ｇｒｏＥＳＬのDNA断片が増幅され、取得する
事ができた。ｄｎａＫ遺伝子の場合、まず、増幅された
DNA断片の両末端を平滑化した後、市販のプラスミドベ
クターpSTV28（宝酒造）の制限酵素HincII部位へ、公知
の方法により組み入れ、プラスミドpDnaK-01を構築し
た。このプラスミドの複製起点はp15A由来であるため、
pBR322やpUC19等のプラスミドと一つの細胞の中で共存
可能なプラスミドである。
【００４１】遺伝子ｇｒｏＥＳＬの場合は、ＰＣＲにて
増幅させたDNA断片を、公知の方法により、市販のベク
ターpSTV28の制限酵素HincII部位へ組み入れ、pGroESL-
01を構築した。
【００４２】遺伝子ｄｎａＪの場合は、ＰＣＲ増幅DNA
断片を、まず制限酵素EcoRIで処理し、そのＤＮＡ末端
をEcoRI切断端とした。これを市販されているクローニ
ングベクターpSTV28のEcoRI部位へ挿入する事で、dnaJ
発現プラスミドpDnaJ-01を構築した。
【００４３】（２）熱ショック蛋白質ＤｎａＫ，Ｄｎａ
Ｊオペロン遺伝子のクローニング ｄｎａＫ、ｄｎａＪオペロン遺伝子の塩基配列も既に公
知である〔Cowing, etal., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 8
2巻、2679-2683頁(1985)、Bardwell, et al.,Proc. Nat
l. Acad.Sci.USA, 81巻、848-852頁(1984)、Ohki, et a
l., J.Biol. Chem., 261巻、1778-1781頁 (1986)〕。そ
こで、同様に、ＰＣＲ法により目的遺伝子群をクローニ
ングした。使用したプライマーは、プライマーDNAKJ-0
1: 5'-CCTGGATCCCGTGGTTTACGACCCCATTTAGTAGTC-3'
（配列番号７）及び DNAKJ-02: 5'-TTCACCTGCAGGTTAAAT
CATATCAGGCGTAATAC-3'（配列番号８）であった。なお、
プライマーDNAKJ-01の、及びDNAKJ-02の5'側には、それ
ぞれ、制限酵素BamHI、Sse8387Iの切断認識配列を組み
入れた。また、増幅させる為の鋳型ＤＮＡは、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株より調製したゲノムである。これに対してＰ
ＣＲ反応を行ったところ、目的遺伝子オペロン断片に相
当する約3.4kbpのＤＮＡ断片を得た。なお、ＰＣＲ条件
は、94℃で90秒間の熱変性後、98℃10秒、68℃５分30秒
を25サイクル、その後、72℃１０分間であった。
【００４４】これを制限酵素BamHI、Sse8387Iにて処理
し、それぞれの制限酵素切断端を持つＰＣＲ増幅断片を
得た。一方、ベクターにはpSTV28を用いた。これを同酵
素にて処理し、ここへ、上記PCR増幅ＤＮＡ断片をクロ
ーニングする事で、プラスミドpDnaKJ-01を構築した。
【００４５】（２）熱ショック蛋白質を過剰生産する大
腸菌宿主中で、真鯛ＴＧを生産する例 真鯛ＴＧの高発現プラスミドpTTG2-22（本プラスミドを
含有する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ12742）は、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（以下、生命研と
略する。）に寄託されており、その寄託番号はFERM BP-
4117である。）は、特開平6-225775、欧州出願公開EP-0
555649A に記載されているプラスミドである。
【００４６】このＴＧ生産菌に対して、上に記載した各
シャペロン遺伝子発現プラスミドを公知の方法にて大腸
菌に形質転換した。pTTG2-22とpDnaK-01を保持する株と
して、ＡＪ-１３０９８を得た。尚、Escherichia coli
AJ13098は生命研に寄託されており、その寄託番号はFER
M P-14914である。pTTG2-22とpDnaJ-01を保持する株と
して、ＡＪ−１３０９７を得た。尚、Escherichia coli
AJ13097は生命研に寄託されており、その寄託番号はFE
RM P-14913である。また、pTTG2-22とpGroESL-01を保持
する株としてＡＪ−１３０９９を得た。尚、Escherichi
a coli AJ13099は生命研に寄託されており、その寄託番
号はFERM P-14915である。更に、そして、pTTG2-22とpD
naKJ-01を保持する株としてＡＪ-１３０９６を得た。
尚、Escherichia coli AJ13096は生命研に寄託されてお
り、その寄託番号はFERM P-14912である。
【００４７】取得した各形質転換体のコロニーを、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのク
ロラムフエニコールを含む、２ｘＴＹ培地(1.6％バクト
トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl、ｐＨ７の組成
よりなる)３ｍｌに植菌し、３２℃にて１４時間振とう
培養した。
【００４８】次に、上記の培養液0.5ｍｌを修正Ｍ９カ
ザミノ酸培地（培地１リットルに、燐酸水素２ナトリウ
ム１２水15.1g、燐酸２水素カリウム3.0g、カザミノ酸
8.0g、酵母エキス0.2g、L-ロイシン0.2g、L-プロリン0.
2g、ビタミンＢ１塩酸塩2mg、硫酸マグネシウム７水0.5
g、塩化カルシウム２水14.5mg、グルコース5.0gを含む
組成よりなる）５０ｍｌを含む坂口フラスコに接種し、
２８℃、３２℃並びに３７℃で２０時間振とう培養し、
菌体を遠心操作にて集菌した。
【００４９】集菌した菌体を、３０ｍｌの菌体破砕液
(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、３０ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡよりなる)に懸濁し、更
に１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム溶液を２ｍｌ加え、氷上
に２時間静置した。その後、菌体懸濁液を超音波破砕し
た。次に、これを遠心処理（２００００ｘｇで１０分
間）し、菌体破砕上清を調製した。また、同様に、コン
トロールとしてｐＴＴＧ２−２２及びベクターpSTV28を
保持する大腸菌についても菌体破砕し、その後、遠心分
離により菌体破砕上清液を調製した。
【００５０】図１には、上記のうち、（１）大腸菌AJ13
096（FERM P-14912)株、（２）大腸菌AJ13097(FERM P-1
4913)株 及び（３）pTTG2-22と pSTV28を保持する大腸
菌ＨＢ１０１株を32℃で培養したものの菌体破砕液の全
画分と遠心上清画分に含まれるタンパク質状態をＳＤＳ
ーＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて展
開し、解析した結果を示した。この結果から分かるよう
に、pTTG2-22と pSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株
の遠心上清画分にはＴＧタンパク質は認められなかっ
た。
【００５１】次に、（１）pTTG2-22及び pSTV28を保持
する大腸菌ＨＢ１０１株、（２）pTTG2-22及びpDnaK-01
を保持する大腸菌AJ13098株（FERM P-14914）、（３）p
TTG2-22及びpGroESL-01を保持する大腸菌AJ13099株（FE
RM P-14915)、（４）pTTG2-22及びｐTTG2-22及びpDnaJ-
01を保持する大腸菌AJ13097株(FERM P-14913）及び
（５）pTTG2-22及びpDnaKJー01を保持する大腸菌AJ1309
6株（FERM P-14912）の遠心上清画分中のＴＧ活性につ
いて調べた。その結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】その結果、表１に見られるように、Ｄｎａ
Ｊの過剰発現株において、明らかに活性発現可能なトラ
ンスグルタミナーゼが著量産生される事、そして、その
効果は、ｄｎａＪとｄｎａＫとの共存により、安定化す
る事が判明した。このような結果は、従来のＤｎａＫ、
ＧｒｏＥＳＬといった主要シャペロンの機能からは、全
く予想されなかった事であり、本研究結果により、全く
新規に見いだされた効果である。
【００５４】
【発明の効果】ＴＧは特に食品タンパク質の物性改質用
酵素として、利用が益々期待されている酵素である。そ
の酵素の大量生産法として、組換えＤＮＡ法による生産
は有効な方法であるが、従来の組換えＤＮＡ法の場合、
更なる大量生産を試みると、大腸菌体内に不活性なＴＧ
が蓄積するという問題がある。しかし、本発明の熱ショ
ックタンパク質（１）ｄｎａＪ、又は（２）ｄｎａＪと
ｄｎａＫを用いた方法を用いれば、大量に、可溶化状態
で、目的ＴＧを取得できる。即ち、本発明は従来の製法
でのＴＧ生産量の限界を打破した画期的な製法である。
また、本発明を用いれば、不溶化した目的ＴＧの試験管
内での立体構造再生操作は必要なくなるという利点もあ
る。これ故、本発明を用いれば、極めて大量のＴＧの供
給が可能となるばかりか、ひいては産業上のＴＧの利用
範囲も大きく広げるものと考えられる。
【００５５】
【配列表】
配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTTGATGAC GTGGTTTACG
【００５６】 配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTTCGCCCG TGTCAGTATA
【００５７】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGATGGAAT TCGCCCAGCA
【００５８】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＡＧＡＧＧＡ ＡＴＴＣＡＴＣＧＧＣ
【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACGTCGATA GCAGGCCAAT
【００６０】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACGCACTCG CGTCGTCCGT
【００６１】配列番号：7 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGGATCCC GTGGTTTACG ACCCCATTTA GTAGTC
【００６２】配列番号：８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACCTGCA GGTTAAATCA TATCAGGCGT AATAC
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの解析図である。レーン
１はpTTG2-22とpSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株の
全画分である。レーン２はpTTG2-22とpSTV28を保持する
大腸菌ＨＢ１０１株の遠心上清画分である。レーン３は
pTTG2-22とpDnaJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ
13097、FERM P-14913）の全画分である。レーン４はpTT
G2-22とpDnaJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ130
97、FERM P-14913）の遠心上清画分である。レーン５は
pTTG2-22とpDnaKJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（A
J13096、FERM P-14912）の全画分である。レーン６はpT
TG2-22とpDnaKJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株(AJ13
096、 FERM P-14912）の遠心上清画分である。ま
た、左側の数字は、同時に電気泳動されたタンパク質マ
ーカーの分子量(×1000)を示す。更に、右側の矢印
（→）は真鯛ＴＧの分子量を示す。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 熱ショック蛋白質のＤｎａＪが過剰産生
    されている大腸菌を宿主としたトランスグルタミナーゼ
    の製造法。
  2. 【請求項２】 熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードす
    る遺伝子を含有するベクター及びトランスグルタミナー
    ゼをコードする遺伝子を含有するベクターを保持する大
    腸菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグルタ
    ミナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタミナ
    ーゼの製造法。
  3. 【請求項３】 熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードす
    る遺伝子及びトランスグルタミナーゼをコードする遺伝
    子が同一ベクター上に存在するベクターを保持する大腸
    菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグルタミ
    ナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタミナー
    ゼの製造法。
  4. 【請求項４】 熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードす
    る遺伝子の発現が増強された、又は、そのｄｎａＪ遺伝
    子量が増幅された染色体を有し、かつトランスグルタミ
    ナーゼをコードする遺伝子を含有するベクターを保持す
    る大腸菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグ
    ルタミナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタ
    ミナーゼの製造法。
  5. 【請求項５】 熱ショック蛋白質であるＤｎａＫをコー
    ドする遺伝子を更に、ＤｎａＪをコードする遺伝子と共
    に用いることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載
    のトランスグルタミナーゼの製造法。
  6. 【請求項６】 トランスグルタミナーゼが魚類由来トラ
    ンスグルタミナーゼである請求項１、２、３、４又は５
    記載のトランスグルタミナーゼの製造法。
  7. 【請求項７】 トランスグルタミナーゼが真鯛由来トラ
    ンスグルタミナーゼである請求項６記載のトランスグル
    タミナーゼの製造法。
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