JP2015511637A5

JP2015511637A5 -

Info

Publication number: JP2015511637A5
Application number: JP2015503160A
Authority: JP
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2017-06-08
Anticipated expiration: 2033-03-26

Description

変異は、本明細書では、交換位置の番号の前に野生型又は非変異アミノ酸を表示し、番号の後に変異アミノ酸を表示することによって定義される。例えば、位置１８のヒスチジン（Ｈ）からグルタミン酸（Ｅ）への変異はＨ１８Ｅと表示される。欠失変異は、欠失した位置の番号の前に野生型又は突然変異してないアミノ酸を表示し、番号の後に「ｄｅｌ」を表示することにより定義される。例えば、位置１８におけるヒスチジンの欠失はＨ１８ｄｅｌと表示される。

第１の局面において、本発明は、ブドウ球菌プロテインＡの１以上の変異免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性ドメイン（単量体ともいわれる）（すなわちＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及び／又はＣドメイン）又はプロテインＺ若しくは配列番号７又は配列番号８で定義される変異体のようなこれらの機能性変異体を含む免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性タンパク質を開示する。１以上の変異単量体の少なくとも１つにおいて、プロテインＡのＢドメイン（配列番号４）又はプロテインＺ（配列番号６）のＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンは、プロリンでもアスパラギンでもない第１のアミノ酸残基で置換されている。さらに、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＰ５７に対応する位置のアミノ酸残基がプロリンであってかつプロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＮ２８に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギンである場合には、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアミノ酸残基はセリン、スレオニン又はリシンのいずれでもない。この変異タンパク質の利点は、Ｈ１８変異をもたない免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性タンパク質より高いｐＨレベルで、その変異タンパク質が免疫グロブリン及びＦｃ含有タンパク質と結合し、またそれらを放出するということである。プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の変異は、免疫グロブリン及びＦｃ含有タンパク質、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の溶出ｐＨを予想外に増大する。好ましくは、溶出ｐＨは０．２〜１．０超のｐＨだけ増大する。より好ましくは、溶出ｐＨは少なくとも０．３ｐＨ増大し、最も好ましくは溶出ｐＨは少なくとも０．４ｐＨ増大する。或いは、溶出ｐＨは＞４．０、好ましくはｐＨ＞４．２に増大し、一方標的分子の収率は少なくとも８０％、又は好ましくは＞９５％である。免疫グロブリン及びその他のＦｃ含有タンパク質は低いｐＨレベルで凝集する傾向があるので、バイオプロセシングにおけるタンパク質の使用にとって重要である。これらの凝集体は潜在的に免疫原性であり、免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の医薬使用の前に除去する必要がある。このため、プロセスのコストが大きく上昇する。

Claims

ブドウ球菌プロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）若しくはプロテインＺの１以上の突然変異した免疫グロブリン結合性ドメイン（単量体）又はその機能性変異体を含む免疫グロブリン結合性タンパク質であって、１以上の突然変異した単量体の少なくとも１つにおいて、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンがプロリン又はアスパラギンではない第１のアミノ酸残基で置換されており、位置５７のアミノ酸残基がプロリンであり、位置２８のアミノ酸残基がアスパラギンである場合、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアミノ酸残基がセリン、スレオニン又はリシンではない、タンパク質。
さらに、位置５７のプロリン及び位置２８のアスパラギンの少なくとも１つが第２のアミノ酸残基で置換されているか、或いは位置５７及び２８のアミノ酸残基のいずれもプロリン又はアスパラギンではない、請求項１記載のタンパク質。
位置１８のアミノ酸残基がセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、スレオニン及びリシンからなる群から選択され、及び／又は位置５７及び２８のアミノ酸残基の少なくとも１つがアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載のタンパク質。
タンパク質が、配列番号５、６、７又は８で定義される親の分子から誘導された１以上の突然変異した単量体を含み、突然変異がＨ１８Ｅ、Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ、Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ、Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉ及びＨ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉからなる群から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のタンパク質。
少なくとも２つの突然変異した単量体、例えば３、４、５又は６つの単量体を含み、及び／又はＣ末端のシステインをさらに含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のタンパク質。
支持体に例えばチオエーテル架橋又はＣ末端システインを介してカップリングした、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のタンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスであって、任意には支持体にカップリングしたタンパク質を５〜１５ｍｇ／ｍｌ、例えば６〜１１ｍｇ／ｍｌ含んでいる、アフィニティー分離マトリックス。
Ｆｃ含有タンパク質を他の物質から分離する方法であって、
ｇ）請求項６記載のアフィニティー分離マトリックスを準備する工程と、
ｈ）Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液を準備する工程と、
ｉ）溶液を分離マトリックスと接触させる工程と、
ｊ）場合により、分離マトリックスを少なくとも１種の洗浄用緩衝液で洗浄する工程と、
ｋ）分離マトリックスを、溶出バッファー、又はｐＨが低下する溶出バッファー勾配で溶出して、Ｆｃ含有タンパク質を含む溶出液を得る工程と、
ｌ）溶出液を回収する工程と
を含み、溶出バッファーが４．０〜６．０のｐＨを有するか、又は溶出バッファー勾配の少なくとも一部が６．０〜４．０のｐＨ範囲内であり、溶液が任意には宿主細胞タンパク質、例えばＣＨＯ細胞又は大腸菌タンパク質を含む、方法。
さらに、溶出バッファーのｐＨ又は工程ｅ）の終了時の溶出バッファー勾配のｐＨより少なくとも０．１ｐＨ単位低いｐＨを有するストリッピングバッファーを用いて分離マトリックスをストリッピングする工程ｇ）を含んでおり、任意には宿主細胞タンパク質が工程ｇ）中に脱着される、請求項７記載の方法。
さらに、場合により工程ｇ）の後に実施される、ｐＨ１３〜１４のアルカリ性溶液、例えば０．１Ｍ〜０．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む溶液の適用によりマトリックスを清浄化する工程ｈ）を含む、請求項７又は請求項８記載の方法。
さらに、溶出液又はプールのｐＨを調節することなく溶出液又はプールをカチオン交換樹脂に適用する工程ｉ）を含む、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。