BRPI0814118B1

BRPI0814118B1 - Método para a regeneração da coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse e método para obter uma eritropoietina

Info

Publication number: BRPI0814118B1
Application number: BRPI0814118-5A
Authority: BR
Inventors: Josef Burg; Klaus Reichert; Axel Schroth; Hartmut Schurig; Axel Wessner
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2007-07-17
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2019-04-09
Also published as: CN101754789A; KR101164734B1; AR067536A1; ES2704013T3; JP2010533845A; CL2008002054A1; CA2692726A1; CN101754789B; PL2173450T3; US7846336B2; CA2692726C; US8795533B2; SI2173450T1; BRPI0814118A2; AR110693A2; US20090101585A1; AU2008277888B2; KR20100037145A; HRP20182171T1; RU2464066C2

Abstract

"método para a regeneração da coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse e método para obter uma eritropoietina". a presente invenção refere-se ao campo dos métodos de separação cromatográfica, úteis para a purificação de polipeptídeos, especialmente de polipeptídeos peguilados, mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para a regeneração de uma coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse e um método para obtenção de uma eritropoitina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA A REGENERAÇÃO DA COLUNA DE CROMATOGRAFIA DE TROCA DE CÁTION DEPOIS DA ELUIÇÃO DE COMPOSTOS DE INTERESSE E MÉTODO PARA OBTER UMA ERITROPOIETINA.

[001] A presente invenção refere-se ao campo dos métodos de separação cromatográfica, úteis para a purificação de polipeptídeos, especialmente de polipeptídeos PEGuilados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] As proteínas desempenham um papel importante no portfólio médico de hoje. Para aplicação em ser humano toda proteína terapêutica tem que atender critérios distintos. Para garantir a segurança de agentes biofarmacêuticos a seres humanos, os subprodutos que se acumulam durante o processo de produção têm que ser especialmente removidos. Para satisfazer as especificações reguladoras, uma ou mais etapas de purificação têm de seguir o processo de preparação. Entre outras coisas pureza, produtividade operacional e rendimento desempenham um papel importante na determinação de um processo de purificação apropriado.

[003] Métodos diferentes são bem estabelecidos e largamente usados para a purificação da proteína, tal como cromatografia por afinidade com proteínas microbianas (por exemplo, cromatografia por afinidade com proteína A ou proteína G), cromatografia de troca iônica (por exemplo troca catiônica (resinas de sulfopropila ou carboximetila), troca de ânion (resinas de amino etila) e troca iônica de modo misturado), adsorção tiofílica (por exemplo com beta-mercaptoetanol e outros ligantes de SH), interação hidrofóbica ou cromatografia de adsorção aromática (por exemplo com resinas de fenil-sefarose, azaarenofílicas, ou ácido m-aminofenilborônico), cromatografia de afinidade de quelato de metal (por exemplo com material de afinidade

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Ni(II)- e Cu(II)-), cromatografia de exclusão de tamanho, e métodos eletroforéticos (tais como eletroforese de gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

[004] São reportadas conjugações, por exemplo, para polietileno glicol (PEG) e Interleucina-6 (EP 0 442 724), para PEG e eritropoietina (WO 01/02017), para moléculas quiméricas compreendendo Endostatina e imunoglobulinas (US 2005/008649), para proteínas de fusão baseadas em anticorpo secretado (US 2002/147311), por polipeptídeos de fusão compreendendo albumina (US 2005/0100991; albumina de soro de ser humano US 5.876.969), por polipeptídeos PEGuilados (US 2005/0114037), e por fusão de interferona.

[005] Necina, R., et al. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) reportaram a captura de anticorpos monoclonais de ser humano diretamente de sobrenadantes de cultura de células por meio de troca iônica exibindo densidade de carga alta. Em WO 89/05157 um método é reportado para a purificação de imunoglobulinas de produtos submetendo diretamente o meio de cultura das células a um tratamento de troca catiônica. Uma purificação de uma etapa de anticorpos IgG monoclonais de ascite de camundongo é descrita por Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88. Um método para purificar um polipeptídeo por cromatografia de troca iônica é reportado em WO 2004/024866, em que uma lavagem gradiente é usada para transformar um polipeptídeo de interesse, de um ou mais contaminantes. Em EP 0 530 447 um processo para purificar anticorpos IgG monoclonais, através de uma combinação de três etapas cromatográficas, é reportado. Uma purificação fácil de antagonista de receptor de interleucina-1 mono-PEGuilado é reportada por Yu, G., et al., em Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. Wang et al. (Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218) reportam a purificação de hTFF3 expresso em E.coli através de uma etapa de

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3/30 cromatografia de troca de cátion. Yun et al. (Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) reportam a purificação de rhG-CSF PEGuilada através de duas etapas de cromatografia de troca iônica consecutivas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Um aspecto da atual invenção é um método para a regeneração de uma coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse compreendendo as etapas a seguir, nesta ordem:

- eluir polipeptídeos adsorvidos da coluna com uma solução tamponada aquosa compreendendo cloreto de sódio em uma concentração de pelo menos 500 mM,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução compreendendo di-hidrogenofosfato de sódio a 0,5 M e ácido fosfórico à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna por pelo menos 4 horas, e regenerar a coluna de troca de cátion lavando a coluna com água purificada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [007] A atual invenção compreende como primeiro aspecto um método para a regeneração de uma coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse compreendendo as etapas a seguir:

- remover polipeptídeos de ligação residual da coluna de troca de cátion com uma solução tamponada aquosa compreendendo cloreto de sódio,

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- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução compreendendo di-hidrogenofosfato de sódio e ácido fosfórico à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna por pelo menos 4 horas, e

- regenerar a coluna de troca de cátion lavando a coluna com água purificada.

[008] O termo água purificada como usado dentro desse pedido denota água para injeção, de acordo com a Farmacopeia Norte Americana.

[009] O termo material de troca de íon como usado dentro deste pedido denota uma matriz de peso molecular alto imóvel que transporta substituintes carregados, ligados covalentemente, usados como fase estacionária em cromatografia de troca de íon. Para total neutralidade da carga de contraíons ligados não covalentemente são ligados para esse fim. O material de troca de íon tem a capacidade de trocar seus contraíons não covalentemente ligados a íons similarmente carregados da solução circundante. Dependendo da carga de seus contraíons trocáveis, a resina de troca de íons é referida como resina de troca de cátions ou resina de troca de ânions. Dependendo da natureza do grupo carregado (substituinte), a resina de troca de íons é referida como, por exemplo, no caso de resinas de troca de cátions, resina de ácido sulfônico (S), ou resina de sulfopropila (SP), ou resina de carboximetila (CM). Dependendo da natureza química do grupo/substituinte carregado, a resina de troca de íons pode adicionalmente ser classificada como resina de troca de íons forte ou fraca, dependendo da resistência do substituinte

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5/30 covalentemente ligado. Por exemplo, resinas de troca de cátion fortes têm um grupo de ácido sulfônico, preferivelmente um grupo sulfopropila, como substituinte carregado, resinas de troca de cátion fracas têm um grupo carboxílico, preferivelmente um grupo carboximetila, como substituinte carregado, resinas de troca de ânions fracas têm um grupo dietilaminoetila como substituinte carregado. Em uma modalidade, a cromatografia de coluna de troca de cátions contém uma resina de troca de cátions, isto é, uma coluna de cromatografia de troca de cátions de sulfopropila.

[0010] Tipos diferentes de material de troca de íons, isto é fases estacionárias, estão disponíveis sob nomes diferentes e de um grande número de companhias tais como, por exemplo, materiais de troca de íons Bio-Rex® (por exemplo tipo 70), Chelex® (por exemplo tipo 100), Macro-Prep® (por exemplo tipo CM, High S, 25 S), AG® (por exemplo tipo 50W, MP) todos disponíveis de BioRad Laboratories, WCX 2 disponível de Ciphergen, Dowex^® MAC-3 disponível de Dow Chemical Company, Mustang C e Mustang S disponíveis de Pall Corporation, Cellulose CM (por exemplo tipo 23, 52), hiper-D, PartiSfera^® disponível de Whatman plc, Amberlite® IRC (por exemplo tipo 76, 747, 748), Amberlite^® GT 73, Toyopearl^® (por exemplo tipo SP, CM, 650M) todos disponíveis de Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 e CM 3000 disponível de BioChrom Labs, SP-Sepharose^®, CM-Sepharose^®disponível de GE Healthcare, resinas de Poros disponíveis de PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (por exemplo tipo 502C), CXpak P, IEC CM (por exemplo tipo 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (por exemplo tipo 420N, 825), IEC QA (por exemplo tipo LG, 825) disponível de Shoko America Inc., resina de troca de cátion 50W disponível de Eichrom Technologies Inc. Em uma modalidade, o material de troca de cátions é um material de troca de cátions forte tal como Macro-Prep^® High S ou 25S, ou MacroCap SP, ou Toyopearl^®

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SP 650M, ou Source S, ou SP Sepharose, ou POLICAT A. Materiais de troca de ânion exemplares são Dowex® 1 disponível de Dow chemical company, AG® (por exemplo tipo 1, 2, 4), Bio-Rex® 5, DEAE Bio-Gel 1, Macro-Prep^® DEAE todos disponíveis de BioRad Laboratories, resina de troca de ânion tipo 1 disponível de Eichrom Technologies Inc., Source Q, ANX Sepharose 4, DEAE Sepharose (por exemplo tipo CL-6B, FF), Q Sepharose, Capto Q, Capto S todos disponíveis de GE Healthcare, AX-300 disponível de PerkinElmer, Asahipak ES-502C, AXpak WA (por exemplo tipo 624, 35 G), IEC DEAE todos disponíveis de Shoko America Inc., Amberlite® IRA-96, Toyopearl^® DEAE, TSKgel DEAE todos disponíveis de Tosoh Bioscience GmbH, Mustang Q disponível de Pall Corporation.

[0011] O termo lavando como usado dentro desse pedido denota a lavagem de uma coluna com dois ou mais volumes de volume de colunas de uma solução especificada.

[0012] O termo mesmo tipo de material de troca de cátion denota duas etapas de cromatografia de troca de íons consecutivas, que são realizadas empregando um material de troca de cátion idêntico. Isso significa que as etapas de cromatografia de troca de cátions consecutivas são realizadas usando, ou uma primeira porção do material de troca de cátion para a primeira etapa de cromatografia de troca cátion, e usando a segunda porção do mesmo material de troca de cátion para a segunda cromatografia de troca de cátion, ou usando o mesmo material de troca de cátion para ambas as etapas de cromatografia de troca de cátion.

[0013] Os termos eluição da etapa e método de eluição da etapa, que são usados intercambiavelmente dentro deste pedido, denotam um método em que, por exemplo, a concentração de uma substância que causa eluição, isto é a dissolução de um composto ligado de um material, é elevada ou diminuída imediatamente, isto é,

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7/30 diretamente de um valor/nível para o valor/nível a seguir. Nessa eluição da etapa uma ou mais condições, por exemplo, o pH, a resistência iônica, a concentração de um sal, e/ou o fluxo de uma cromatografia, é/são trocado(s) todos imediatamente desde o primeiro, por exemplo valor de partida, até um segundo, por exemplo valor final, isto é as condições são trocadas de maneira incrementada, isto é por etapa, ao contrário de uma mudança linear. No método de eluição da etapa depois de cada aumento na resistência iônica uma nova fração é coletada. Essa fração contém os compostos recuperados do material de troca de íon com o aumento correspondente na resistência iônica. Depois de cada aumento, as condições são mantidas até a etapa a seguir, no método de eluição.

[0014] Os termos eluição contínua e método de eluição contínua, que são usados intercambiavelmente dentro desse pedido, denotam um método em que, por exemplo, a concentração de uma substância que causa eluição, isto é a dissolução de um composto ligado a partir de um material, é elevada ou diminuída continuamente, isto é a concentração é mudada por uma sequência de pequenas etapas, cada uma não maior do que uma troca de 2%, preferivelmente de 1% da concentração da substância que causa a eluição. Nessa eluição contínua, uma ou mais condições, por exemplo, o pH, a resistência iônica, a concentração de um sal, e/ou o fluxo de uma cromatografia podem ser trocadas linear ou exponencialmente ou podem ser trocadas assintoticamente. Preferivelmente a troca é linear. [0015] O termo aplicando a e equivalentes gramaticais do mesmo, como usado dentro desse pedido, denota uma etapa parcial de um método de purificação em que uma solução, por exemplo, contendo uma substância de interesse para ser purificada, é colocada em contato com uma fase estacionária. Isso denota que a) a solução é adicionada a um aparelho de cromatografia em que a fase estacionária

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8/30 é localizada, ou b) que uma fase estacionária é adicionada à solução. No caso de a) a solução, por exemplo contendo a substância de interesse para ser purificada, passa através da fase estacionária permitindo uma interação entre a fase estacionária e as substâncias na solução. Dependendo das condições tais como, por exemplo, pH, condutividade, concentração de sal, temperatura, e/ou taxa de fluxo, algumas substâncias da solução são ligadas à fase estacionária e, dessa maneira, são removidas da solução. Outras substâncias permanecem na solução ou são removidas da fase estacionária. As substâncias na solução podem ser encontradas no fluxo contínuo (flow-through). O fluxo contínuo denota a solução obtida depois da passagem do dispositivo cromatográfico, que pode ser uma solução aplicada contendo a substância de interesse ou o tampão, que é usado para lavar a coluna ou para causar eluição de uma ou mais substâncias ligadas à fase estacionária. Em uma modalidade, o dispositivo cromatográfico é uma coluna, ou um cassete. A substância de interesse pode ser recuperada da solução depois da etapa de purificação através dos métodos conhecidos da pessoa versada na técnica, tais como por exemplo precipitação, retirada do sal, ultrafiltração, diafiltração, liofilização, cromatografia de afinidade, ou redução do volume do solvente para obter a substância de interesse em forma substancialmente homogênea. No caso b) a fase estacionária é adicionada, por exemplo como um sólido, para a solução, por exemplo contendo a substância de interesse a ser purificada, permitindo uma interação entre a fase estacionária e as substâncias na solução. Após a interação, a fase estacionária é removida, por exemplo, por filtração, através da qual, por exemplo, a substância de interesse é ligada à fase estacionária e removida com essa da solução ou não ligada à fase estacionária e permanece na solução.

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9/30 [0016] O termo sob condições apropriadas para ligação e equivalentes gramaticais do mesmo, como usado dentro desse pedido, denota que uma substância de interesse, por exemplo eritropoietina PEGuilada, se liga a uma fase estacionária quando em contato com ela, por exemplo um material de troca de íon. Isso não necessariamente denota que 100% da substância de interesse são ligados, mas essencialmente 100% da substância de interesse são ligados, isto é pelo menos 50% da substância de interesse são ligados, preferivelmente pelo menos 75% da substância de interesse são ligados, preferivelmente pelo menos 85% da substância de interesse são ligados, mais preferivelmente mais do que 95% da substância de interesse são ligados à fase estacionária.

[0017] O termo tamponado como usado dentro desse pedido denota uma solução em que mudanças de pH devido à adição ou liberação de substâncias acídicas ou básicas são niveladas por uma substância de tampão. Qualquer substância de tampão que resulte em tal efeito pode ser usada. Em uma modalidade farmaceuticamente aceitável são usadas substâncias de tampão, tais como por exemplo ácido fosfórico ou sais do mesmo, ácido acético ou sais do mesmo, ácido cítrico ou sais do mesmo, morfolina, ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico ou sais do mesmo, histidina ou sais da mesma, glicina ou sais da mesma, ou tri (hidroximetil) aminometano (TRIS) ou sais do mesmo. Em uma modalidade preferida, ácido fosfórico ou sais do mesmo, ou ácido acético ou sais do mesmo, ou ácido cítrico ou sais do mesmo, ou histidina ou sais do mesmo são usados. Opcionalmente, a solução tamponada pode compreender um sal adicional, tal como por exemplo cloreto de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, citrato de sódio ou citrato de potássio.

[0018] Métodos cromatográficos gerais e seu uso são conhecidos de uma pessoa versada na técnica. Vide por exemplo,

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Chromatography, 5^a edição, Parte A: Fundamentais and Techniques, Heftmann (ed) Elsevier Science Publishing Company 1992 Chromatography 5a ed 51A 1992; Advanced Chromatography and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., e Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; ou Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley 8c Sons, Inc., New York.

[0019] A PEGuilação de eritropoietina normalmente resulta em uma mistura de compostos diferentes, tais como eritropoietina poliPEGuilada, eritropoietina mono-PEGuilada, eritropoietina nãoPEGuilada, produtos de hidrólise do éster de PEG ativado, como também produtos de hidrólise da própria eritropoietina. A fim de obter uma eritropoietina mono-PEGuilada, em forma substancialmente homogênea, essas substâncias têm que ser separadas e o composto de interesse tem que ser purificado.

[0020] Dessa maneira, é um segundo aspecto da atual invenção prover um método para obter uma eritropoietina mono-PEGuilada em forma substancialmente homogênea compreendendo as etapas a seguir:

a) PEGuilar a eritropoietina usando um reagente de PEGuilação ativado de um peso molecular de 20 kDa a 40 kDa,

b) purificar a eritropoietina PEGuilada obtida na etapa a) com duas etapas de cromatografia de troca de cátion consecutivas, em que as primeira e segunda etapas de cromatografia de troca de cátion empregam o mesmo tipo de material de troca de cátion,

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c) recuperar a eritropoietina mono-PEGuilada da segunda coluna de cromatografia de troca de cátion em uma forma substancialmente homogênea,

d) regenerar a coluna de cromatografia de troca de cátion através de um método de acordo com a invenção.

[0021] Esse método é especialmente útil para a purificação de polipeptídeos recombinantes PEGuilados, que são glicosilados, isto é que foram produzidos por uma célula de mamífero, preferivelmente uma célula de CHO, célula de HEK293, célula de BHK, célula de Per.C6®, ou célula de HeLa, e são depois quimicamente PEGuilados. Em uma modalidade, a regeneração da coluna de cromatografia de troca de cátions compreende as etapas a seguir:

- remover os polipeptídeos ligados da coluna de troca de cátion com uma solução tamponada aquosa compreendendo cloreto de sódio,

- lavar a coluna com água purificada, preferivelmente com pelo menos dois volumes de coluna,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio à coluna, preferivelmente pelo menos dois volumes de coluna,

- aplicar à coluna uma solução compreendendo dihidrogenofosfato de sódio e ácido fosfórico, preferivelmente pelo menos três volumes de coluna,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M para a coluna por pelo menos 4 horas, preferivelmente por 4 horas, e

- regenerar a coluna de troca de cátion lavando a coluna com água purificada, preferivelmente com pelo menos dois volumes de

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12/30 coluna.

[0022] Na primeira etapa do método é a eritropoietina PEGuilada. As moléculas de polímero de poli (etileno glicol) (PEG) usadas na reação de PEGuilação têm um peso molecular de cerca de 20 kDa a 40 kDa (por peso molecular como usado aqui, deve ser compreendido o peso molecular médio de PEG porque PEG, como composto polimérico, não é obtido com um peso molecular definido mas de fato tem uma distribuição de peso molecular; o termo cerca de indica que nas ditas preparações de PEG, algumas moléculas vão pesar mais e outras menos do que o peso molecular indicado, isto é, o termo cerca de refere-se a uma distribuição de peso molecular em que 95% das moléculas de PEG têm um peso molecular dentro de +/- 10% do peso molecular indicado. Por exemplo, um peso molecular de 30 kDa denota uma faixa de 27 kDa a 33 kDa).

[0023] O termo eritropoietina refere-se a uma proteína que tem a sequência SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou uma proteína ou polipeptídeo substancialmente homólogos para esse fim, cujas propriedades biológicas são relacionadas à estimulação de produção de células sanguíneas vermelhas e à estimulação da divisão e diferenciação de progenitores eritroides comprometidos na medula óssea. A eritropoietina recombinante pode ser preparada através da expressão em células eucarióticas, por exemplo em células CHO ou células BHK, ou células HeLa através de tecnologia de DNA recombinante ou através de ativação de gene endógeno, isto é a glicoproteína eritropoietina é expressa pela ativação de genes endógenos, vide por exemplo US 5.733.761, US 5.641.670, US 5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667, e WO 91/09955. Em uma modalidade, a eritropoietina de acordo com a invenção é baseada na sequência de EPO de ser humano. Em uma modalidade preferida, a eritropoietina de

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13/30 ser humano tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente a eritropoietina de ser humano tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 1. O termo eritropoietina também denota variantes da proteína de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram trocados, deletados, ou inseridos, e que têm a mesma atividade biológica da proteína não modificada, tal como por exemplo reportado em EP 1 064 951, ou US 6.583.272. Uma variante pode ter a sequência de aminoácidos de eritropoietina de ser humano tendo de 1 a 6 sítios adicionais para glicosilação. A atividade específica de eritropoietina PEGuilada pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica da eritropoietina PEGuilada purificada desta invenção é de tal maneira que a administração da proteína através de injeção em pacientes humanos resulta em células da medula óssea, aumentando a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas em comparação aos grupos não injetados ou de controle de sujeitos. A atividade biológica da eritropoeitina PEGuilada obtida e purificada de acordo com essa invenção pode ser testada pelos métodos de acordo com Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997)31-48.

[0024] PEG ou grupo PEG de acordo com a invenção significa um resíduo contendo poli (etileno glicol) como uma parte essencial. Tal PEG pode conter ainda grupos químicos, que são necessários para reações de ligação, que resultam da síntese química da molécula, ou que são espaçadores para a distância ideal de partes da molécula. Esses grupos químicos adicionais não são usados para o cálculo do peso molecular da molécula de polímero do PEG. Em adição, tal PEG pode consistir em uma ou mais cadeias laterais de PEG que são ligadas juntas. PEGs com mais do que uma cadeia de PEG são

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14/30 chamados PEGs multiarmados ou ramificados. PEGs ramificados podem ser preparados, por exemplo, pela adição de óxido de polietileno a vários polióis, incluindo glicerol, pentaeritriol e sorbitol. PEGs ramificados são descritos em, por exemplo, EP 0 473 084, US 5.932.462. Como PEG com um peso molecular de 20 a 35 kDa, moléculas de PEG linear são usadas em uma modalidade e como polímeros de PEG com um peso molecular de mais do que 35 kDa, especialmente com 40 kDa, os PEGs ramificados são usados em outra modalidade. Como PEG 40 kDa, um PEG de dois ramos é particularmente preferido.

[0025] O termo PEGuilação significa uma ligação covalente de um resíduo de poli (etileno glicol) no N-terminal do polipeptídeo e/ou um resíduo de lisina interna. A PEGuilação de proteínas é amplamente conhecida na técnica e revista por, por exemplo, Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. O PEG pode ser ligado usando grupos funcionais diferentes e poli (etileno glicóis) com peso molecular diferente, PEGs lineares e ramificados como também grupos de ligação diferentes (vide também Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). A PEGuilação de eritropoietina pode ser realizada em solução aquosa com reagentes de PEGuilação como descrito, por exemplo, em WO 00/44785, em uma modalidade usando moléculas de PEG NHS-ativadas lineares ou ramificadas de um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa. A PEGuilação pode também ser realizada na fase sólida, de acordo com Lu, Y., et al., Reactive Polimers 22 (1994) 221-229. Não aleatoriamente, o polipeptídeo Nterminalmente PEGuilado pode também ser produzido de acordo com WO 94/01451.

[0026] Tais métodos resultam em uma eritropoietina que é

PEGuilada, em um ou mais grupos ε-amino de resíduos de lisina e/ou

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15/30 no grupo amino N terminal. A PEGuilação seletiva em um aminoácido N terminal pode ser realizada de acordo com Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poli(etileno glicol)) (1997) 218-238. A PEGuilação Nterminal seletiva pode ser realizada durante a síntese da fase sólida através do acoplamento de um derivado de aminoácido N^a-PEGuilado ao aminoácido N-1 terminal da cadeia de peptídeo. A PEGuilação de cadeia lateral pode ser realizada durante a síntese da fase sólida através do acoplamento de derivados de lisina N^£-PEGuilados à cadeia em crescimento. A PEGuilação N terminal e de cadeia lateral combinada é exequível como descrito acima, dentro da síntese de fase sólida, ou através da fase de solução aplicando reagentes de PEG ativados a um peptídeo de amino desprotegido.

[0027] Derivados de PEG apropriados são moléculas de PEG ativadas dentro de uma modalidade em peso molecular médio de cerca de 5 a cerca de 40 kDa, em uma modalidade preferida de cerca de 20 a cerca de 40 kDa, e em uma modalidade mais preferida de cerca de 30 kDa a cerca de 35 kDa. Os derivados de PEG podem ser PEGs lineares ou ramificados. Uma ampla variedade de derivados de PEG apropriados para uso na preparação de proteína de PEG e conjugados de peptídeo de PEG pode ser obtida de Shearwater Polimers (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com).

[0028] Derivados de PEG ativados são conhecidos na técnica e estão descritos em, por exemplo, Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, para PEG-vinilsulfona. Espécies de PEG de cadeia linear e de cadeia ramificada são apropriadas para a preparação dos fragmentos PEGuilados. Exemplos de reagentes de PEG reativos são iodo-acetil-metóxi-PEG, ou metóxi-PEG-vinilsulfona (m em uma modalidade é um número inteiro de cerca de 450 a cerca de 900, e R é alquila inferior, linear ou ramificada, tendo um a seis átomos de carbono tais como metila, etila, isopropila, etc. dos quais

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16/30 metila é preferida):

O

[0029] O uso dessas substâncias ativadas por iodo é conhecido na técnica e descrito, por exemplo, por Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p.147-148.

[0030] Em uma modalidade, as espécies de PEG em um éster de PEG ativado, por exemplo, propionato de N-hidroxissuccinimidila, ou butanoato de N-hidroxissuccinimidila ou N-hidroxissuccinimidas tais como PEG-NHS (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Em uma modalidade o PEG é ativado por éster de Nhidroxissuccinimida

[0031] usando alcóxi-PEG-N-hidroxissuccinimida, tal como metóxiPEG-N-hidroxissuccinimida (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.), em que R e m são como definido acima. Em uma modalidade, a espécie de PEG é o éster de N-hidroxissuccinimidila de ácido metóxi poli (etileno glicol)-butírico. O termo alcóxi refere-se a um grupo éter de alquila em que o termo 'alquila' significa um grupo alquila de cadeia reta ou cadeia ramificada contendo um máximo de quatro átomos de carbono, tais como metóxi, etóxi, n-propóxi e similares, preferivelmente metóxi.

[0032] O termo forma substancialmente homogênea, como

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17/30 usado dentro dessa aplicação, denota que a eritropoietina PEGuilada obtida, contida, ou usada é aquela que tem um número definido de grupos PEG acoplados. Em uma modalidade, a eritropoietina PEGuilada é uma eritropoietina mono-PEGuilada. A preparação pode conter eritropoietina não reagida (isto é, faltando o grupo PEG), eritropoietina poli-PEGuilada, como também fragmentos do polipeptídeo gerado durante a reação de PEGuilação. O termo forma substancialmente homogênea denota que uma preparação de uma monoeritropoietina PEGuilada contém pelo menos 50% (peso/peso) da eritropoietina mono-PEGuilada, pelo menos 75% da eritropoietina mono-PEGuilada, pelo menos 90% da eritropoietina mono-PEGuilada, ou mais do que 95% da eritropoietina mono-PEGuilada. Os valores percentuais são baseados no % da área do cromatograma correspondente à cromatografia de troca de cátions da qual a eritropoietina mono-PEGuilada é obtida.

[0033] A atual invenção reporta um método para a purificação de uma eritropoietina mono-PEGuilada, a fim de obter uma forma substancialmente homogênea de uma eritropoietina mono-PEGuilada. Supreendentemente, foi descoberto que a combinação de duas etapas de cromatografia de troca de cátions consecutivas, ambas empregando o mesmo tipo de material de troca de cátions, provê uma forma substancialmente homogênea de uma eritropoietina monoPEGuilada. Dessa maneira, a atual invenção provê um método para a purificação de uma eritropoietina mono-PEGuilada compreendendo as etapas de prover uma solução compreendendo eritropoietina mono-, poli-, e não PEGuilada, realizando duas etapas de cromatografia de troca de cátions consecutivas, recuperando a eritropoietina monoPEGuilada purificada na segunda etapa de cromatografia de troca de cátion, em que o mesmo tipo material de troca de cátion é usado em ambas as etapas de cromatografia de troca de cátion, e regenerando a

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18/30 cromatografia de troca de cátion através de um método de acordo com o primeiro aspecto da atual invenção.

[0034] A recuperação da eritropoietina mono-PEGuilada purificada na segunda etapa da cromatografia de troca de cátion é através da eluição de eritropoietina mono-PEGuilada a partir do segundo material de cromatografia de troca de cátion. Em uma modalidade do método de acordo com a invenção diferem as duas etapas da cromatografia de troca de cátion no método de eluição empregado. A primeira etapa de cromatografia de troca de cátion é em uma modalidade realizada como uma etapa de método de eluição, isto é, a resistência iônica do tampão usado é aumentada por etapa, isto é, imediatamente, de um valor de resistência iônica para o próximo valor de resistência iônica. O método de eluição da etapa é em uma modalidade realizado com um método de eluição de três etapas. Na primeira etapa, principalmente, a eritropoietina poli-PEGuilada é eluída a partir da coluna de cromatografia de troca de cátion. O segundo aumento em resistência iônica basicamente elui a eritropoietina mono-PEGuilada com uma pureza de mais de 60% com base na área do cromatograma de exclusão de tamanho correspondente (área-%). O terceiro aumento em resistência iônica elui principalmente a eritropoietina não PEGuilada da coluna.

[0035] A segunda etapa de cromatografia de troca de cátion é realizada em uma modalidade como um método de eluição contínuo, isto é, a resistência iônica do tampão é aumentada continuamente. As frações depuradas contendo a eritropoietina mono-PEGuilada são combinadas a fim de obter uma eritropoietina mono-PEGuilada em forma substancialmente homogênea, contendo em uma modalidade menos do que 0,5% em formas de peso molecular baixo com base na área do cromatograma correspondente. O tampão está em uma modalidade presente em uma concentração de 10 mM a 250 mM,

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19/30 preferivelmente de 50 mM a 150 mM, mais preferivelmente em cerca de 100 mM.

[0036] Dessa maneira, no método de acordo com a invenção as duas etapas consecutivas de cromatografia de troca de cátion são as etapas a seguir:

a) aplicar uma solução aquosa, tamponada compreendendo uma mistura de eritropoietina mono-, poli-, e não PEGuilada à primeira coluna de cromatografia de troca de cátion sob condições apropriadas para a ligação da dita eritropoietina mono-PEGuilada ao material de troca de cátion contido na dita primeira coluna,

b) recuperar uma eritropoietina mono-PEGuilada da primeira coluna de cromatografia de troca de cátion através de um método de eluição de etapa com um aumento em etapas da resistência iônica de tampão de eluição, em que o conteúdo relativo de eritropoietina mono-PEGuilada é aumentado em comparação à mistura aplicada da etapa a),

c) aplicar a eritropoietina mono-PEGuilada recuperada da etapa b) a uma segunda coluna de cromatografia de troca de cátion sob condições apropriadas para ligação da dita eritropoietina ao material de troca de cátion contido na dita segunda coluna, em que o material de troca de cátion contido na dita segunda coluna é do mesmo tipo que o material de troca de cátion da primeira coluna,

d) recuperar a eritropoietina mono-PEGuilada purificada em uma forma substancialmente homogênea, a partir da dita coluna de cromatografia de troca de cátion através de um método de eluição contínua com um aumento contínuo da resistência iônica do tampão de fluxo contínuo.

[0037] A PEGuilação de um polipeptídeo normalmente não provê o produto de PEGuilação em forma homogênea. Ele é além do mais obtido como uma mistura de produto mono-PEGuilado, poliPetição 870180128068, de 10/09/2018, pág. 23/43

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PEGuilado, e não PEGuilado. Dessa maneira, a solução da eritropoietina PEGuilada aplicada na etapa a) do método é uma mistura de eritropoietina mono-, poli-, e não PEGuilada e formas de peso molecular baixo ou fragmentos em um tampão aquoso. O conteúdo relativo das substâncias diferentes é determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (SE-HPLC). A soma da área dos picos correlacionados, isto é, a área sob os picos, no cromatograma de exclusão de tamanho é a área total do cromatograma de exclusão de tamanho. A fração de um pico único é dada como % em área, isto é, como fração de área relativa da área total do cromatograma.

[0038] Métodos cromatográficos gerais, seu uso, e termos relacionados são conhecidos da pessoa versada na técnica. Vide por exemplo, Chromatography, 5^a edição, Parte A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed.), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5a ed., 51 A (1992) e outros livros didáticos relacionados. Durante a cromatografia, um tampão está fluindo através da coluna de cromatografia de troca de cátion. Esse tampão de eluição é ajustado de acordo com os requisitos das etapas do método de cromatografia. Ele transporta a substância de interesse para (aplicar) e do (eluir) o material cromatográfico.

[0039] Na primeira etapa da cromatografia de troca de cátion, uma mistura de eritropoietina mono-PEGuilada, poli-PEGuilada, e não PEGuilada é aplicada a uma concentração de proteína de cerca de 1 mg/ml para a primeira coluna de cromatografia de troca de cátion em uma solução aquosa tamponada com fosfato de potássio a cerca de 100 mM em cerca de pH 3,0. O termo cerca de como usado dentro do atual pedido denota uma faixa de 10% em torno do valor dado, isto é ± 10%. Antes e depois da aplicação, a primeira coluna é lavada com a mesma solução de tampão. Para a primeira etapa, no método de

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21/30 eluição de etapa, o tampão é trocado por um tampão de fosfato de potássio com cerca de 100 mM, de cloreto de sódio com cerca de 90 mM em cerca de pH 3,0. Com esse tampão de reagente de PEG hidrolisado, isto é, o ácido carbônico PEGuilado correspondente, reagente de acoplamento não reagido, e eritropoietina poli-PEGuilada são depurados a partir da coluna de cromatografia de troca de cátion. Para a segunda etapa, no método de eluição de três etapas, o tampão é trocado por um tampão de fosfato de potássio a cerca de 100 mM, de cloreto de sódio a cerca de 250 mM em cerca de pH 3,0. Nessa etapa a eritropoietina mono-PEGuilada é recuperada da primeira coluna de cromatografia de troca de cátion. O tampão de eluição coletado dessa etapa de eluição é diluído aproximadamente 1:5 a 1:8 com água purificada. Após a primeira etapa de cromatografia de troca de cátion, a eritropoietina mono-PEGuilada recuperada é livre de PEG livre.

[0040] O tampão de eluição coletado da segunda etapa da primeira cromatografia de troca de cátion está contendo a eritropoietina mono-PEGuilada em um conteúdo relativo aumentado, isto é, a fração em peso ou por % em área (no cromatograma de uma cromatografia de exclusão de tamanho do tampão de circulação direta coletado da segunda etapa) da eritropoietina mono-PEGuilada aumentou quando comparado ao anterior à primeira etapa de cromatografia de troca de cátion. Em uma modalidade o conteúdo relativo da eritropoietina mono-PEGuilada é pelo menos 60 % em área. Em uma modalidade preferida, o conteúdo relativo de eritropoietina mono-PEGuilada é pelo menos 80% em área.

[0041] Para purificação adicional da eritropoietina monoPEGuilada, uma segunda etapa de cromatografia de troca de cátion é realizada. Para a segunda cromatografia de troca de cátion, o tampão de fluxo contínuo coletado e diluído da segunda etapa de eluição, é

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22/30 ajustado para uma concentração de fosfato de potássio de cerca de 100 mM e para um pH de cerca de pH 3,0 aplicado a uma segunda coluna de cromatografia de troca de cátion contendo um material de troca de cátion do mesmo tipo da coluna de cromatografia de troca de cátion. Em uma modalidade, a segunda coluna de troca de cátion e o material de troca de cátion contido para esse fim são os mesmos que na primeira etapa de cromatografia de troca de cátion. A eritropoietina mono-PEGuilada é recuperada da segunda coluna de cromatografia de troca de cátion aplicando um gradiente linear começando com um tampão de fosfato de potássio de uma concentração de cerca de 100 mM com cerca de 50 mM de cloreto de sódio a cerca de pH 3,0, e terminando com um tampão de fosfato de potássio de uma concentração de cerca de 100 mM com cerca de 500 mM de cloreto de sódio a cerca de pH 3,0. A troca na concentração de cloreto de sódio é linear sobre dez volumes de coluna. O tampão de fluidez direta é fracionado e cada fração é diluída com hidrogenofosfato de dipotássio a 1M para aumentar o valor do pH para cerca de pH 6 a 8.

[0042] Depois da segunda etapa de cromatografia de troca de cátion, a eritropoietina mono-PEGuilada é obtida em forma substancialmente homogênea, preferivelmente com uma pureza de pelo menos 95% por área.

[0043] Uma pessoa versada na técnica está familiarizada com a tecnologia da cromatografia de troca de íon. Na etapa de recuperação da ligação de recuperação da ligação de polipeptídeo para o material de troca de cátion, a resistência iônica, isto é, a condutividade da passagem do tampão/solução através da coluna de troca de íon é aumentada. Isso pode ser realizado por uma concentração de sal de tampão aumentada, ou pela adição de sais, dos assim chamados sais de eluição, para a solução de tampão. Dependendo do método de eluição, a concentração de tampão/sal é aumentada imediatamente

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23/30 (método de eluição da etapa) ou continuamente (método de eluição contínua) pela adição fracional de um tampão concentrado ou solução de sal de eluição. Em uma modalidade, o sal de eluição é citrato de sódio, cloreto de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, fosfato de potássio, ou outros sais de ácido cítrico ou ácido fosfórico, ou qualquer mistura desses componentes. Em uma modalidade preferida, o sal de eluição é citrato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou misturas dos mesmos.

[0044] Em uma modalidade do método atual, o material de troca de cátion é um material de troca de cátion resistente, em uma modalidade preferida Toyopearl® SP 650 M, em outra modalidade preferida um material de troca de cátion de sulfopropila. A concentração do sal, que causa a eluição, é em uma modalidade na faixa de 5 mM a 500 mM, em uma modalidade preferida, de 5 mM a 400 mM, e em uma modalidade especialmente preferida, de 5 mM a 250 mM. Em outra modalidade da invenção, o sal que causa a eluição é ao mesmo tempo usado como substância de tampão, por exemplo ácido cítrico ou sais do mesmo, ou ácido fosfórico ou sais do mesmo.

[0045] A eritropoietina mono-PEGuilada pode ser usada em composições farmacêuticas apropriadas para injeção com um carreador ou veículo farmacêutico aceitável, através dos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, composições apropriadas foram descritas em WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660, e WO 99/07401. Dentre os carreadores farmaceuticamente aceitáveis proferidos para a formulação de produtos da invenção, estão albumina de soro humano, proteínas de plasma humano etc. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em 10 mM de tampão de fosfato de sódio/ potássio em pH 7 contendo um agente de tonicidade, por exemplo cloreto de sódio a 132 mM. Opcionalmente, a composição

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24/30 farmacêutica pode conter um conservante. A composição farmacêutica pode conter quantidades diferentes de eritropoietina mono-PEGuilada, por exemplo 10 - 1000 ug/ml, por exemplo 50 ug ou 400 ug.

[0046] A administração dos produtos de glicoproteína eritropoietina da presente invenção resulta na necessidade de formação de células de sangue em seres humanos. Dessa maneira, a administração do produto de glicoproteína de eritropoietina mono-PEGuilada reabastece essa proteína de eritropoietina que é importante na produção de células sanguíneas vermelhas. As composições farmacêuticas contendo produtos de glicoproteína de eritropoietina mono-PEGuilada podem ser formuladas em uma resistência eficaz para administração através de vários meios para um paciente humano que está experimentando distúrbios do sangue caracterizados por produção baixa ou defeituosa de células sanguíneas vermelhas, sozinha ou como parte da condição ou doença. As composições farmacêuticas podem ser administradas por injeção, tal como por injeção subcutânea ou intravenosa. As quantidades médias de produto de gliproteína de eritropoietina mono-PEGuilada podem variar. A quantidade exata do conjugado é uma questão de preferência sujeita a tais fatores como o tipo exato da condição que está sendo tratada, a condição do paciente que está sendo tratado como também os outros ingredientes na composição. Por exemplo, 0,01 a 10 pg por kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 a 1 pg por kg de peso corporal, podem, por exemplo, ser administrados uma vez por semana.

[0047] Foi surpreendentemente descoberto que uma coluna de cromatografia de troca de cátion pode ser regenerada, com um método de acordo com a invenção, sem um declínio considerável na eficiência da separação. Foi mostrado que com um método de regeneração, de acordo com a invenção, uma coluna de cromatografia de troca de cátion pode ser usada por pelo menos 40 ciclos de

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25/30 separação, em uma modalidade por pelo menos 50 ciclos de separação, e uma modalidade adicional por pelo menos 60 ciclos de separação, sem um declínio considerável na eficiência da separação (vide a Figura 1) e rendimento (vide a Figura 2). O termo ciclo de separação como usado dentro deste pedido denota a sequência de i) equilíbrio da coluna, ii) aplicação da solução a ser separada na coluna, iii) lavagem da coluna, iv) recuperação dos compostos adsorvidos da coluna, v) lavagem da coluna, vi) regeneração da coluna. Descobriu-se também que com o método de regeneração de acordo com a invenção não só um declínio na eficiência da separação pode ser evitado, mas também um declínio na capacidade de carregamento pode ser prevenido (vide a Figura 2).

[0048] O termo eficiência da separação como usado dentro deste pedido denota a capacidade de uma coluna de cromatografia de troca de cátion separar os compostos de uma solução. O termo sem um declínio considerável como usado dentro desse pedido denota que a coluna de cromatografia de troca de cátion provê a mesma, isto é, dentro de uma variação de +/- 5%, em uma modalidade dentro de uma variação de +/- 2,5%, separação de composto em cromatografias consecutivas de uma solução contendo os mesmos compostos. O termo capacidade de carregamento como usado dentro desse pedido denota a quantidade de um composto de interesse que é recuperado de uma coluna de cromatografia de troca de cátion.

[0049] Os exemplos a seguir, a listagem de sequência e figuras são providos para ajudar a compreensão da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações em anexo.

Entende-se que as modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0050] Figura 1 Pureza de eritropoietina mono-PEGuilada no

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26/30 conjunto de tampão de eluição da primeira cromatografia durante a validação do número do ciclo do processo de regeneração.

[0051] Figura 2 Rendimento de eritropoietina mono-PEGuilada no conjunto de tampão de eluição da primeira cromatografia durante a validação do número do ciclo do processo de regeneração. MATERIAIS E MÉTODOS

SE-HPLC [0052] SE-HPLC separa proteínas de acordo com seu peso molecular aparente. Dessa maneira, o método é capaz de detectar a presença de eritropoietina mono-PEGuilada, formas e fragmentos de peso molecular baixo, formas poli-PEGuiladas e agregados de eritropoietina mais altos. A HPLC é equipada com um detector de 220nm e uma coluna de 6 HR Superose (dimensões 10 x 300 mm, Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01) ou uma coluna Superose 6 10/300 GL (Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01). A coluna é operada sob condições isocráticas à temperatura ambiente, usando uma taxa de fluxo de cerca de 0,4 ml/min. O tampão de fase móvel é um tampão de fosfato de sódio de 50 mM com cloreto de sódio a 300 mM em pH 6,8. Dependendo do sistema de HPLC usado, o método pode ser realizado com um volume de aplicação de amostra de 100 pL ou 500 pL. As amostras são diluídas com o tampão da fase móvel para uma concentração de proteína de cerca de 0,5 mg/mL (carga de 100 pL) ou 0,1 mg/mL (carga de 500 pL). Amostras com uma concentração de proteína de menos do que 0,1 mg/mL podem ser usadas não diluídas. As proteínas eluídas são detectadas em um detector de comprimento de 220 nm.

RP-HPLC:

[0053] A pureza é analisada por RP-HPLC, que separa a eritropoietina mono- PEGuilada das formas oligo e substâncias relacionadas. O ensaio é realizado em uma coluna Poroshell usando

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27/30 um gradiente de TFA de acetonitrila/aquoso. O perfil de eluição é monitorado como absorvância UV a 220 nm. A percentagem de eritropoietina mono- PEGuilada e as substâncias relacionadas ou formas oligo são calculadas com base na área total de pico das proteínas eluídas.

EXEMPLO 1

PURIFICAÇÃO DE ERITROPOIETINA MONO-PEGUILADA [0054] A eritropoietina pode ser produzida, por exemplo, de acordo com WO 01/87329, e purificada como reportado em WO 96/135718. A eritropoietina PEGuilada pode ser produzida, por exemplo, de acordo com WO 03/029291.

a) Primeira cromatografia em SP Toyopearl 650 M [0055] A primeira etapa de cromatografia é realizada em uma coluna de sulfopropila (SP) embalada com SP Toyopearl^® 650M. A coluna foi operada em RT. A capacidade máxima de carregamento da primeira coluna é definida como 1,5 g de proteína por volume de coluna em litro (CV). A coluna foi equilibrada com um tampão de fosfato de potássio a 100 mM com pH 2,9 a 3,1 (tampão de SP-A). Após a etapa de carregamento, a coluna foi lavada e eluída com uma série de tampões de fosfato de potássio contendo quantidades aumentadas de NaCl. O ácido carbônico PEGuilado livre, isto é reagente de PEG hidrolisado, e formas poli-PEGuiladas foram removidas no fluxo-direto e a etapa de lavagem subsequente com tampão SP-A e tampão de fosfato de potássio a 100 mM, pH 2,9 a

3.1, contendo cloreto de sódio a 90 mM (tampão SP-B), respectivamente. A eritropoietina mono-PEGuilada foi depurada pela aplicação de um tampão de fosfato de potássio a 100 mM, pH 2,9 a

3.1, contendo cloreto de sódio a 250 mM (tampão SP-C), coletado em um frasco e diluído diretamente 1:5 com água purificada. Esse eluído coletado é denominado ”conjunto de eluído SP I. A coluna foi

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28/30 subsequentemente lavada com tampão de fosfato de potássio a 100 mM, pH 2,9 a 3,1, contendo cloreto de sódio a 750 mM (tampão SP-D) para remover a eritropoietina não reagida e a coluna foi regenerada.

b) Segunda cromatografia em SP Toyopearl 650 M [0056] A segunda coluna foi operada em temperatura ambiente (RT). Depois de equilibrar com o tampão SP-A, o conjunto de eluído SP I foi aplicada à coluna e a coluna foi depois disso lavada com tampão SP-A. A eritropoietina mono- PEGuilada foi eluída aplicando um gradiente linear com uma inclinação de cloreto de sódio a 50 a 500 mM sobre dez volumes de coluna tamponados com tampão de fosfato de potássio a 100 mM em pH 2,9 a 3,1. O pico do produto foi fracionado em até 8 frações únicas e cada fração foi diluída diretamente com hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M para aumentar o pH para 6 a 8. Depois de completar a eluição de eritropoietina monoPEGuilada, a inclinação do gradiente pode ser aumentada levando a uma imediata lavagem de coluna com fosfato de potássio a 100 mM pH 2,9 a 3,1 contendo cloreto de sódio a 500 mM.

c) Regeneração das colunas de SP Toyopearl 650 M [0057] As resinas de ambas as colunas foram regeneradas em uma sequência de sete etapas. As colunas foram inundadas com água purificada seguida por uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M. A solução alcalina foi deslocada com água purificada seguida por uma lavagem com ácido (hidrogenofosfato de sódio a 0,5 M, ácido fosfórico a 1 M). Depois de outra etapa de água purificada, as colunas foram depirogenadas com hidróxido de sódio a 0,5 M por > 4 horas. Depois da regeneração cáustica, as colunas foram lavadas com água purificada outra vez. A água purificada (PW III) foi produzida por ultrafiltração. A qualidade de PW III é equivalente àquela da água para injeção, de acordo com a Farmacopeia Norte Americana. O teste é realizado de acordo com Ph. Eur. e USP. Durante as execuções de

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29/30 controle realizadas de acordo com a primeira etapa de cromatografia esboçada acima nenhuma proteína residual ou porções de PEG puderam ser detectadas nos respectivos tampões de eluição. A análise de SDS-PAGE da resina depois de 60 ciclos não mostrou nenhuma proteína residual ou porção de PEG sobre o gel. Com base nesses dados, uma passagem batelada-para-batelada e proteínas residuais e porção de PEG podem ser excluídas e, dessa maneira, a regeneração da coluna é muito eficaz (vide também a Figura 1). A determinação do rendimento obtido em cada cromatografia não mostrou declínio (vide também a Figura 2).

TABELA 1: Sumário dos parâmetros para a regeneração da coluna.

Parâmetros da Coluna

Etapa	Solução de Tampão	Volume de coluna	Taxa de Fluxo [L/min]
Enxágue	PW III	>2	1,6-2,1
Cáustica Regeneração da coluna cáustica 1	0,5 mol/L de NaOH	>2	1,6-2,1
Enxágue	PW III	>2	1,6-2,1
Regeneração da Coluna de Ácido	1 mol/L de ácido fosfórico 0,5 mol/L de dihidrogenofosfato de sódio	>3	1,6-2,1
Enxágue	PW III	>2	1,6-2,1
Regeneração da coluna cáustica	0,5 mol/L de NaOH	>3	n. a.
Enxágue	PW III	>2	1,6-2,1

[0058] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, a pureza e o rendimento de eritropoietina mono- PEGuilada no conjunto de tampão de eluição de passagem para a primeira etapa de cromatografia para todos os ciclos está claramente dentro da faixa de pelo menos 80% em pureza e pelo menos 35% em rendimento. Além disso, nenhuma tendência

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30/30 em pureza de eritropoietina mono-PEGuilada durante o tempo de vida da coluna pode ser observada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a regeneração da coluna de cromatografia de troca de cátion depois da eluição de compostos de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir nesta ordem:

- eluir os polipeptídeos adsorvidos da coluna com uma solução tamponada aquosa compreendendo cloreto de sódio a uma concentração de pelo menos 500 mM,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução compreendendo di-hidrogenofosfato de sódio a 0,5 M e ácido fosfórico a 1 M à coluna,

- lavar a coluna com água purificada,

- aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna por pelo menos 4 horas, e

- regenerar a coluna de cromatografia de troca de cátion inundando a coluna com água purificada.
2. Método para obter uma eritropoietina pela qual um resíduo de poli (etileno glicol) é covalentemente ligado ao N-terminal da eritropoietina e/ou um resíduo de lisina interno em forma substancialmente homogênea, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir:

a) covalentemente ligar um resíduo de poli (etileno glicol) no N-terminal de eritropoietina e/ou um resíduo de lisina interno de eritropoietina usando um reagente ativado para covalentemente ligar um resíduo de poli (etileno glicol) no N-terminal da eritropoietina e/ou um resíduo de lisina interno de um peso molecular de 20 kDa a 40 kDa;

b) purificar a eritropoietina por meio da qual um resíduo de

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2/3 poli (etileno glicol) é covalentemente ligado ao N-terminal da eritropoietina e/ou um resíduo de lisina interno obtido na etapa a) com duas etapas de cromatografia de troca de cátion consecutivas, em que as primeira e segunda etapas de cromatografia de troca de cátion empregam o mesmo tipo de material de troca de cátion; c) recuperar a eritropoietina por meio da qual um resíduo de poli (etileno glicol) é covalentemente ligado ao N-terminal da eritropoietina e/ou um resíduo de lisina interno na segunda etapa de cromatografia de troca de cátion em uma forma substancialmente homogênea;

d) regenerar a coluna de cromatografia de troca de cátion através das etapas a seguir na seguinte ordem:

i) remover os polipeptídeos ligados da coluna de troca de cátion com uma solução tamponada aquosa compreendendo cloreto de sódio de pelo menos 500 mM, ii) lavar a coluna com água purificada, iii) aplicar uma solução de hidróxido de sódio 0,5 M à coluna, iv) lavar a coluna com água purificada,

v) aplicar uma solução compreendendo di-hidrogenofosfato de sódio 0,5 M e ácido fosfórico 1M à coluna, vi) lavar a coluna com água purificada, vii) aplicar uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M à coluna por pelo menos 4 horas, e viii) regenerar a coluna de cromatografia de troca de cátion lavando a coluna com água purificada.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita coluna de cromatografia de troca de cátion é uma coluna de cromatografia de troca de cátion resistente.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita coluna de cromatografia de troca de cátion é

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3/3 uma coluna de cromatografia de troca de cátion de sulfopropila.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito tampão é ácido fosfórico ou sais do mesmo, ou ácido acético ou sais do mesmo, ou ácido cítrico ou sais do mesmo, ou histidina ou sais da mesma.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita eritropoietina é eritropoietina humana com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2.
7. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito poli (etileno glicol) tem um peso molecular de 20 a 35 kDa e é linear.
8. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito poli (etileno glicol) tem um peso molecular de 40 kDa e é ramificado.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

2 e 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a dita primeira etapa de cromatografia de troca de cátion é realizada como uma eluição em etapas e a dita segunda etapa de cromatografia de troca de cátion é realizada como uma eluição linear.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a dita coluna de cromatografia de troca de cátion pode ser usada pelo menos por 40 ciclos de separação.