CN102586892A - 筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法，尤其是针对单一个体的小量血样构建二代测序用Small RNA-Seq库的方法，本方法通过血浆分离、总RNA提取、RT-PCR及PAGE电泳回收目的片段，构建出能够适用于靶标筛选和目标诊断的Small RNA-Seq库。

Description

筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法

技术领域

本发明涉及一种由血液样本构建核酸靶标数据库的方法，尤其是针对单一个体的小量血样构建二代测序用Small RNA-Seq库的方法。 

背景技术

microRNA(miRNA)是细胞内由18-25个核苷酸组成的非编码小RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR(untranslated region)不完全互补结合，抑制靶基因的翻译。日益增多的研究显示多种miRNA可作为致癌基因和抑癌基因参与细胞的增殖，并可调控肿瘤干细胞的分化及肿瘤的迁移过程。miRNA在多种癌症的起始和发生发展过程中发挥着重要作用。对miRNA在癌症发生发展的作用机制的研究已成为近年生物医学领域的前沿热点课题。 

目前绝大多数与癌症相关的microRNA(miRNA)的研究是利用肿瘤组织和相邻组织，通过比较两者miRNA的表达水平，寻找与癌症相关的miRNA，并进一步揭示miRNA的功能。但是这种研究方法取材不方便，对病人的创伤较大，不适于早期诊断。此外，由于取材范围小，代表性和重复性有限。因此，需要开发新的诊断方法。已有研究显示血液中的某些miRNA可作为多种癌症(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、淋巴癌、乳腺癌等)诊断的潜在生物学标记。目前关于血液中miRNA的研究方法可分为三类： 

1.在血液(血清或血浆)中通过qRT-PCR技术检测已报道的肿瘤组织中异常表达的miRNA表达是否也异常。这种方法的局限是：a.在血液中不确定能检测到肿瘤组织中异常表达的miRNA。b.血液和肿瘤组织中的miRNA异常表达的趋势不一定一致。已有研究发现，肿瘤细胞从血液中获得对肿瘤生长有利的miRNA，从而使肿瘤组织内此miRNA的含量上调，血液中反而下调。 

2.利用miRNA芯片技术，在血液(血清或血浆)中检测已知miRNA的表达水平。这种方法的局限性是：a.仅能检测已知的miRNA的表达水平。b.此方法对表达量过低或过高基因的区分度较差。 

3.利用RNA-Seq技术，在血液(血清或血浆)中寻找可作为癌症早期诊断标记物的miRNA。这种方法的优点是：a.不仅可以检测已知miRNA的表达。还可分析未知miRNA的表达。b.RNA-Seq技术对基因表达量的分析比较准确，对表达量高或低的基因均有区分度。但是就目前建库的方法，需要的血液量较多，大约需要100ml血液，因此需要将相同癌症类型的多个个体的血液混台在一起建库、测序。因此这种方法的缺点是某个个体的异常表达可能导致平均值的上升或者下降，造成假阳性或假阴性，从而增加了后期验证的工作量。 

发明内容

基于上述现有技术的不足，也为了进一步提高在血液中寻找生物学标记物的准确性，本实验室通过对经典RNA-Seq建库技术多方面的改进，最终仅使用少量血液(4-10ml)即可完成建库工作的目的。这种技术突破让使用单一个体少量血液进行RNA-Seq成为可能，不仅可以更快速直接地寻找相同癌症患者发生共性变化的miRNA，还可以通过分析不同个体间表达的差异，避免由于某个具体的个体发生显著变化而引入的假阳性和假阴性，因此大大提高寻找到的生物学标记物的准确性，减少对生物学标记物后期验证的工作量。 

本发明提供一种针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法，所获得的核酸数据库能够适用于靶标筛选和目标物(特别是小片段的RNA目标物)的诊断。 

本发明还涉及所述的建库方法用于制备针对特异性疾病的诊断试剂盒的应用。 

本发明还涉及使用所述的建库方法获得的针对特异性疾病的诊断试剂盒。 

本发明所述的特异性疾病可以是肝癌、结直肠癌肝转移、乳腺癌和结直肠癌等。 

本发明所述的针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法包括如下步骤： 

1.血浆分离操作 

取新鲜血液样本，利用冷冻离心机，4℃分两步从血液内分离血浆，400g～600g离心8～15分钟，收集上清以去除血细胞；第二：1500g～2000g离心8～15分钟以充分去除细胞碎片，收集上清。 

由于血装内含有大量的RNase(RNA核酸酶)，因此，及时分离血浆后，-80℃低温保存，可降低RNase对RNA的降解。从而减少rRNA和mRNA的降解片段对small RNA分析的影响。 

2.总RNA提取 

对步骤1所获得的血浆样本，使用TRIZOL抽提3-4次以去除蛋白，抽提步骤为：对血浆样本加入相应体积的TRIZOL，混匀后静置，然后加入氯仿，混匀后静置，离心分离上清。抽提完成后加入异丙醇和肝糖，-80℃沉淀过夜。离心后弃上清并加入75％乙醇洗涤  再次离心去除75％乙醇并用无核酸酶污染的双蒸水重悬沉淀。 

已有报道表明，血浆或者血清中的miRNA/small RNA可能存在于exosome(分泌型囊泡)或者micro-vesicle(微体)中，从而避免RNA核酸酶的降解。因此，为达到本发明的技术效果，第二步的离心速度不能过高，否则存在于exosome或者micro vesicle的miRNA/small RNA可能被沉降下来，从而减少了建库的起始材料。 

由于血浆中含有较多的蛋白，若是按常规提取忘RNA的方法，会使蛋白去除不充分，因此，为保证减少蛋白质污染物对后期实验的影响的同时，尽量减少操作带来的损失，本发明用TRIZOL抽提3-4次。 

总RNA提取时，延长沉淀时间至过夜(12个小时以上)、降低沉淀温度至-80℃，同时使用共沉淀剂肝糖(glycogen，Fermentas)，以上改进均能增加沉淀效率和总RNA的得率。其中共沉淀剂肝糖能够在起到共沉淀作用的同时，既不影响后续的连接等酶学反应，也不影响通过电泳区分片段大小等后续实验。 

3.3’adapter和5’adapter连接 

3’adapter连接：总RNA中加入3’Adapter(Bioo Scientific)，混匀，70℃热激2min，并迅速放在冰上。依次加入如下试剂：AIRTM Ligase，10×AIRTM Ligase Buffer，50％PEG(Bioo Scientific)。50％PEG在加入混匀前恢复至室温，以增加连接效率。将溶液混匀，置于PCR仪上，22℃孵育2h。在连接反应溶液中加入RT primer(Bioo Scientific)，混匀后，置于PCR仪上，70℃孵育5min，37℃孵育30min，25℃孵育15min。 

5’adapter连接：浓度为0.25nM的5’Adapter(Bico Scientific)，在70℃热激2min，并迅速放在冰上。依次加入如下试剂：与3’Adapter连接的RNA(来自上述步骤中)，ATP(Bioo Scientific)，5’Adapter(Bioo Scientific)，T4RNA Ligase l(Bioo Scientific)；将溶液混匀，置于PCR仪上，20℃孵育1h。 

利用RNA浓缩试剂盒去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子等。用无核酸酶污染的双蒸水将RNA溶解，得到与5’和3’Adapter连接的RNA。 

与常规的SmallRNA-Seq建库步骤不同，本发明与3’adapter连接前，不从总RNA中分离片段较小的RNA。这是由于血浆与组织的RNA的种类不同，片段大小主要集中在10nt-100nt之间。不分离小片段，可以最大限度的减少样品损失。 

此外，通过相应的实验优化，发现在与3’adapter连接后、5’adapter连接前，加入反转引物，能够有效减少adapter的自连，增加目的片段的连接效率。同时，适当降低adapter的浓度，减少adapter的使用量，也能够有效的减少adapter自连的几率，增加目的片段的连接效率。 

4.反转录合成cDNA与PCR扩增 

反转录：在PCR管中依次加入与5’和3’Adapter连接的RNA(来自步骤3)，10×M-Mμl buffer，dNT P，M-MμlReverseTranscriptase，混匀，置于PCR仪上，44℃孵育1h。 

PCR扩增：上述反转得到的cDNA中依次加入无核酸酶污染的双蒸水，DuroTaq 5×PCR Master Mix(Bioo Scientific)，NEXTflexTMBarcode Primer(Bioo Scienific)，NEXTfiexTM Universal Primer(Bioo Scientific)，混匀，置于预热的PCR仪上。 

PCR循环设置如下： 

首先95℃，5min； 

然后95℃，10s、60℃，30s、72℃，30s循环13次 

72℃，10min。 

本发明所涉及的PCR循环数可以由常规方法的12-15个循环增加至18个循环，由于本发明仅涉及目的miRNA/small RNA的表达量，所以，由PCR引入的突变不会影响测序得到的reads比对到miRNA上，此外， miRNA/small RNA仅有22nt左右，因此增加循环数不会影响目的miRNA表达量的分析，而综合考虑增加循环数的效果以及平衡由PCR引入突变的几率，得出18个循环的最优选方案。而将第一步的变性时间由30s延长至5min，这样使DNA模板充分变性、DNA双链解开，有利于PCR程序的进行。 

5.电泳及胶回收 

使用TBE-PAGE胶电泳上述步骤4获得的DNA片段，将片段大小在140bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于目的样本中的small RNA的建库与进一步的检测分析。 

由于以上方法的改进，可以使用单一个体4-10ml血液建库，减少将多个个体血液混在一起测序导致的假阳性和假阴性。此外，还可以检测miRNA之外的其他非编码小RNA的表达，例如Y RNA等。已有研究发现Y RNA在肿瘤中的表达上调，Y RNA与细胞的增殖调控有关。与芯片技术相比，RNA-Seq不仅可以检测未知的miRNA的表达量，还可检测其他的非编码小RNA的表达，从而拓展候选生物学标记的范围。 

附图说明

图1：本发明所述针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法获得的反转录DNA电泳图谱。 

图2：使用Agilent Bioanalyzer分析本发明所述方法获得的二代测序Small RNA-Seq库中核酸的片段大小的分析结果。 

具体实施方式

以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。 

实施例1.血浆的分离 

1)对加了抗凝剂(K3EDTA)的新鲜血液，在收取血液后两小时内分离血浆。分离前，血液一直保存在冰上。 

2)利用冷冻离心机(Centrifuge 5804R，Eppendorf)，4℃分两步从血液内分离血浆：500g离心10分钟，将上清(约4ml)转移至新的15ml离心管内；1800g离心10分钟，得到的上清(约4ml)即为用于建库的血浆。 

3)每8ml 血液得到约4ml血浆，分离得到的血浆-80℃保存。 

实施例2.血浆中总RNA的提取 

1)冷冻保存的血浆(来自实施例1)在冰上融化，并轻轻颠倒混匀。 

2)将血浆分至1.5ml的无核酸酶污染的离心管中，每管600μl。 

3)每管加入等体积(600μl)的TRIZOL(Invitrogen)，充分震荡混匀。 

4)室温下静置3min后，每管加入1/5体积(120μl)的氯仿(北京化工厂)，充分震荡混匀，室温下静置3min。 

5)4℃16,000g(Centrifuge 5417R，Eppendorf)离心15min。 

6)转移上清至1.5ml无核酸酶污染的离心管中，每管加入500μl TRIZOL，充分震荡混匀。 

7)室温下静置3min后，每管加入1/5体积(100μl)的氯仿，充分震荡混匀，室温下静置3min。 

8)4℃16,000g离心15min。 

9)转移上清至1.ml无核酸酶污染的离心管中，每管加入400μl TRIZOL，充分震荡混匀。 

10)室温下静置3min后，每管加入1/5体积(80μl)的氯仿，充分震荡混匀，室温下静置3min。 

11)4℃16,000g离心15min。 

12)转移上清至1.5ml无核酸酶污染的离心管中，每管加入300μl氯仿，以充分去除TRIZOL中的苯酚。 

13)4℃16,000g离心15min。 

14)转移上清至1.5ml无核酸酶污染的离心管中，每管700μl上清。 

15)每管加入等体积的异丙醇(700μl)和0.5μl肝糖，轻轻颠倒混匀。 

16)在-80℃冰箱内沉淀过夜。 

17)4℃16,000g离心30min。 

18)去除溶液，每管加入750μl 75％酒精 上下颠倒，充分洗沉淀。 

19)4℃16,000g离心10min。 

20)充分去除溶液，在室温下干燥沉淀至沉淀刚好变成透明。 

21)每管加入10μl无核酸酶污染的双蒸水，室温下溶解15min，并充分混匀。 

22)将所有管的总RNA合并，并用nano-drop 1000(Thermo Scientific)测定总RNA的量。 

实施例3.总RNA的浓缩 

1)利用RNA浓缩试剂盒(RNA Clean and Concentrator-5，Zymo)将总RNA(来自实施例2)浓缩至约7μl。 

2)为保证反应体系，需进一步浓缩总RNA的体积。利用PCR仪，在37℃将总RNA浓缩至4.6μl。 

实施例4.3’Adapter的连接 

1)4.6μl总RNA(来自实施例3)中加入1μl稀释后浓度为0.25nM的3’Adapter(Bioo Scientific)，混匀，70℃热激2min，并迅速放在冰上。 

2)在200μl薄壁PCR管中依次加入如下试剂：1μl AIR^TM Ligase，1μl 10×AIR^TM Ligase Buffer， 2.4μl 50％PEG(Bioo Scientific)。 

3)将溶液混匀，置于PCR仪上，22℃孵育2h。 

4)为了减少adapter二聚体的产生，在连接反应溶液中加入1μl RT primer(Bioo Scientific)，混匀后，70℃5min，37℃30min，25℃15min。 

实施例5.5’Adapter的连接 

1)取1μl稀释后浓度为0.25nM的5’Adapter(Bioo Scientific)，在70℃热激2min，并迅速放在冰上。 

2)在200μl薄壁PCR管中依次加入如下式剂： 

11μl 与3’Adapter连接的RNA(来自实施例4 

1μl ATP(Bioo Scientific) 

1μl 5’Adapter(Bioo Scientific) 

1μl T4RNA Ligase1(Bioo Scientific) 

3)将溶液混匀，置于PCR仪上，20℃孵育1h。 

4)利用RNA浓缩试剂盒(RNA Clean and Concentrator-5 Zymo)去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子等。用7.5μl无核酸酶污染的双蒸水将RNA溶解下来，得到约7μl 与5’和3’Adapter连接的RNA。 

实施例6.反转录合成cDNA 

1)在200μl薄壁PCR管中依次加入如下式剂： 

7μl与5’和3’Adapter连接的RNA(来自实施例4) 

1μl 10×M-Mμl buffer 

1μl dNTP 

1μl M-Mμl Reverse Transcriptase 

2)将溶液混匀，置于PCR仪上，44℃孵育1h。 

实施例7.PCR扩增 

1)在经实施例6反转录步骤后获得的装有相应cDNA样本的200μl薄壁PCR管中依次加入如下试剂： 

28μl无核酸酶污染的双蒸水 

10μlDuroTaq 5×PCR Master Mix(Bioo Scientific) 

1μl NEXTflex^TM Barcode Primer(Bioo Scientific) 

1μl NEXTflex^TM Universal Primer(Bioo Scientifc) 

2)将以上溶液混匀，置于PCR仪上。在样品放置前，PCR仪预热至65℃以上。PCR循环设置如下： 

95℃5min； 

95℃10s、60℃30s、72℃30s三步共重复13次； 

72℃10min。 

实施例8.电泳及胶回收 

1)在100V预跑15％TBE-PAGE胶15min。 

2)每管PCR产物中加入10μl 6×Gel Loading Dye，混匀。 

3)每个样品点连续的三个点样孔中，每个空中加入20μl样品。样品与Low MW Ladder(Bioo Scientific)有至少一个点样空的间距。 

4)在200V跑约50min，至下面的浅蓝色染料刚好跑出。 

5)用SYBR Gold(Invitrogen)在室温下杂胶15min，之后在紫外灯下，将片段大小在140bp左右的胶切下(如图所示)。 

6)使用200μl薄壁PCR管和1.5ml离心管做的嵌套管，利用离心机，将胶块变成小的颗粒，以利于核酸的回收。 

7)每个样品得到的小胶颗粒中加入300μElution Buffer，利用垂直混合仪，在室温下溶解过夜。 

8)在室温下16,000g离心2min。 

9)将上清转移至离心柱中(Ambion)，在室温下16,000g离心2min，以充分除去胶颗粒。 

10)将过滤液转移至新的无核酸污染的1.5ml离心管中，每管加入750μl无水乙醇(北京化工厂)、30μl 3MNaOAc(北京化工厂)、1μl Co-orecipitant(Bioo Scientific)。 

11)-20℃沉淀两小时。 

12)4℃16,000g离心30min。 

13)轻轻去除上清，用800μl75％乙醇洗沉淀。 

14)4℃16,000g离心10min。去除上清，并在室温下干燥沉淀至沉淀刚好变成透明。 

15)每管加入10μl无核酸酶污染的双蒸水，室温下溶解15min，并充分混匀。 

实施例9.库的质量检测 

1)使用Agilent Bioanalyzer分析库中核酸的片段大小在140bp左右(如图2)。 

2)使用qRT-PCR检测库中含有adapter序列的核酸量。因为qRT-PCR的引物是根据adapter的核酸序列设计的，因此，只有与双端adapter连接上的核酸可以被检测到。检测结果显示核酸量均大于3.5nmol/L，可用于二代测序。 

通过AT克隆检则显示，随机挑取的约30个克隆中有大于25％的序列可以比对到miRNA，由此证明使用这种方法建立起来的小RNA库，可进行miRNA表达量的分析。 

Claims (7)

1.一种针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA-Seq库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤1).血浆分离操作：

对新鲜血液样本，利用冷冻离心机，4℃从血液内分两步分离血浆，第一步：400g～600g离心8～15分钟，收集上清以去除血细胞；第二步：1500g～2000g离心8～15分钟，收集上清以充分去除细胞碎片；

步骤2).总RNA提取取；

对步骤1所获得的血浆样本，使用TRIZOL抽提3-4次以去除蛋白，抽提完成后加入异丙醇和肝糖，-80℃沉淀过夜，乙醇洗涤沉淀后用无核酸酶污染的双蒸水重悬沉淀，并进一步浓缩该RNA溶液；

步骤3).3’adapter和5’adapter连接：

3’adapter连接：在步骤2)获得的总RNA中加入热激后的3’Adapter和连接试剂，于PCR仪上孵育连接；

在连按反应获得的溶液中加入RTprimer，于PCR仪上孵育；

5’adapter连接：热激后的5’Adapter与上步反应获得的溶液混匀加入相应的连接试剂，置于PCR仪上，孵育连接；

利用RNA浓缩法去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子等，得到与5’和3’Adapter连接的RNA；

步骤4).反转录合成cDNA与PCR扩增：

反转录：在PCR管中加入来自步骤3)与5和3’Adapter连接的RNA和相应的反转录试剂，混匀，置于PCR仪上，孵育获得cDNA片段，并用PCR扩增所获得的DNA片段

步骤5).电泳及胶回收：

使用TBE-PAGE胶电泳上述步骤4)获得的DNA片段，将片段大小在140bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于目的样本中的samll RNA的建库与进一步的检测分析。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的血液样本为来源于单一个体的8ml新鲜血液样本，每8ml样本可分离的血浆量为4ml。

3.根所权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的TRIZOL抽提步骤为：对血浆样本加入相应体积的TRIZOL，混匀后静置，然后加入氯仿，混匀后静置，离心分离上清；经浓缩后，每4ml步骤1)所获得的血浆最终浓缩为4.6μl RNA溶液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述3’Adapter连接时，来自步骤2)的4.6μl总RNA中加入1μl浓度为0.25nM的3’Adapter，使用PCR仪孵育，温度22℃，时间2h；步骤3)所述加入RT primer后的孵育步骤是：70℃5min，37℃30min，25℃15min；步骤3)所述的5’Adapter连接时，向之前获得的连接溶液中加入1μl浓度为0.25nM的5Adapter，使用PCR仪孵育，温度20℃，时间1h。

5.根所权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的PCR反应步骤是：PCR仪首先预热至65℃以上，首先95℃，5min；然后95℃10s、60℃30s、72℃30s循环18次；最后72℃孵育10min。

6.权利要求1-5任一所述的建库方法用于制备针对特异性疾病的诊断试剂盒的应用。

7.由权利要求1-5任一所述的建库方法获得的针对特异性疾病的诊断试剂盒。

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