CN113081957A - 一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法，涉及外泌体制剂制备技术领域。其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白和基础溶剂，脐带间充质干细胞外泌体制剂中人血白蛋白的质量浓度为5％‑10％，基础溶剂为生理盐水，生理盐水的浓度为0.85％‑0.9％。该制剂基于生理盐水的渗透压与血浆的渗透压相等或接近，使得该外泌体制剂更符合注射剂的要求。而人血白蛋白是血浆中的主要蛋白质，加入人血白蛋白后使得脐带间充质干细胞外泌体处于一个蛋白质溶液环境，有利于维持生物大分子的稳定性。本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体制剂在长期保存过程中可以保持外泌体的结构和生物活性，可用于制备注射剂。

Description

一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及外泌体制剂制备技术领域，具体而言，涉及一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是动物组织细胞形成并释放到外周血液和体液中的大小为40～150nm的扁盘状细胞外囊泡。其中，脐带间充质干细胞的外泌体在实际应用中具有来源易得、脐带间充质干细胞分离培养技术成熟等优势，且脐带间充质干细胞的外泌体具有抗衰老、美容的有益功效。
目前，尚无报道将脐带间充质干细胞的外泌体配制为制剂。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白和基础溶剂，脐带间充质干细胞外泌体制剂中人血白蛋白的质量浓度为5％-10％，基础溶剂为生理盐水，生理盐水的质量浓度为0.85％-0.9％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述每毫升脐带间充质干细胞外泌体制剂中脐带间充质干细胞外泌体的含量为107-109个。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述脐带间充质干细胞外泌体制剂还包括稳定剂，稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.05％-0.06％谷氨酰胺。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述脐带间充质干细胞外泌体制剂的pH为7.0-8.0。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，该制备方法包括将基础溶剂、脐带间充质干细胞外泌体和人血白蛋白混合制得混合液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括调节混合液的pH至7.0-8.0。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括调节pH后对混合液进行除菌过滤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述除菌过滤是指采用220nm滤膜进行过滤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括向混合液中加入质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
一种脐带间充质干细胞外泌体制剂在制备注射剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，该制剂以生理盐水为基础溶剂，基于生理盐水的渗透压与血浆的渗透压相等或接近，使得该外泌体制剂更符合注射剂的要求，满足人体的注射，避免引起疼痛等不适。而人血白蛋白是血浆中的主要蛋白质，加入人血白蛋白后使得脐带间充质干细胞外泌体处于一个蛋白质溶液环境，有利于维持生物大分子的稳定性。本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体制剂易于长期保存，在长期保存过程中可以保持外泌体的结构和生物活性，可用于制备注射剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为外泌体的荧光电子显微镜观察图；
图2为FGF高精度ELISA定量检测散点图(标准曲线图)。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白和基础溶剂，脐带间充质干细胞外泌体制剂中人血白蛋白的质量浓度为5％-10％，基础溶剂为生理盐水，生理盐水的浓度为0.85％-0.9％。
生理盐水具有良好的等渗作用，同时也是良好的溶剂，发明人选择生物盐水作为基础溶剂，基于生理盐水的渗透压与血浆的渗透压相等或接近，使得该外泌体制剂更符合注射剂的要求，满足人体的注射，避免引起疼痛等不适。
人血白蛋白是血浆中的主要蛋白质，加入人血白蛋白后使得脐带间充质干细胞外泌体处于一个蛋白质溶液环境，有利于维持生物大分子的稳定性。
基于人血白蛋白和生理盐水的配合作用，本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体制剂得以长期保存，在长期保存过程中可以保持外泌体的结构和生物活性，可用于制备注射剂，成品符合无菌、无热原、安全性、稳定性等注射剂要求。
发明人研究发现，当基础溶剂选自磷酸盐缓冲液时，可能引起血管疼痛反应，当基础溶剂选自葡萄糖注射液可能升高血糖引起不适，而以生理盐水为基础溶剂最为合适。
当添加的人血白蛋白浓度低于5％时，保存的外泌体的生物活性低于90％，因此，发明人选择5％-10％的人血白蛋白浓度。优选为5％，更高浓度的人血白蛋白浓度有利于使得外泌体的生物活性超过95％，但成本更高。当将人血白蛋白替换为复合氨基酸保存外泌体时，外泌体的活性较差。
需要说明的是，本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体制剂可以在37℃下保存10天以上，外泌体仍可保持90％以上的生物活性。即在2-8℃存放，订立12月有效期。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述每毫升脐带间充质干细胞外泌体制剂中脐带间充质干细胞外泌体的含量为107-109个。
优选地，每毫升脐带间充质干细胞外泌体制剂中脐带间充质干细胞外泌体的含量为108个。发明人研究发现当外泌体的含量在这个浓度下，无论是局部皮下使用或静脉注射全身使用，直接注射都不会由于浓度太高引起不适，也不会由于外泌体太稀功效不足。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述脐带间充质干细胞外泌体制剂还包括稳定剂，稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
脐带间充质干细胞外泌体是大约40～150nm的细胞外囊泡，具有磷脂双分子膜，外泌体膜上和囊泡内包含一些具有生物活性的蛋白质、细胞因子及RNA等能够起到一定生物功效的物质。加入丙酮酸钠、谷氨酰胺起到稳定外泌体磷脂双分子膜作用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.05％-0.06％谷氨酰胺。
此外，在其他实施方式中，也可以根据保存的需要加入其他的保护剂，例如若有冻干保存的需求，可以加入冻干保护剂，冻干保护剂可以选自甘露醇、乳糖、蔗糖或海藻糖。
例如先将外泌体制剂预先进行冷冻干燥，并随后重悬于水溶液中；任选地，在冻干之前将外泌体制剂与1％～6％的甘露醇，乳糖，蔗糖或海藻糖的冻干保护剂混合。
外泌体偏碱性(pH为7.2-8.0)相对稳定，因此，按照一般注射剂要求pH 4～9，发明人提供的述脐带间充质干细胞外泌体制剂的pH为7.0-8.0。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，该制备方法包括将基础溶剂、脐带间充质干细胞外泌体和人血白蛋白混合制得混合液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括调节混合液的pH至7.0-8.0。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括调节pH后对混合液进行除菌过滤；上述除菌过滤是指采用220nm滤膜进行过滤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括向混合液中加入质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
一种脐带间充质干细胞外泌体制剂在制备注射剂中的应用。该注射剂可以局部皮下使用或静脉注射全身使用。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白和基础溶剂，脐带间充质干细胞外泌体制剂中人血白蛋白的质量浓度为5％，基础溶剂为生理盐水，生理盐水的浓度为0.9％。每毫升脐带间充质干细胞外泌体制剂中脐带间充质干细胞外泌体的含量为108个。
实施例2
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白、基础溶剂和稳定剂，脐带间充质干细胞外泌体制剂中人血白蛋白的质量浓度为5％，基础溶剂为生理盐水，生理盐水的浓度为0.9％。每毫升脐带间充质干细胞外泌体制剂中脐带间充质干细胞外泌体的含量为108个。稳定剂包括质量浓度为0.01％的丙酮酸钠和质量浓度为0.05％谷氨酰胺。
脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法包括：
以0.9％的生理盐水作为基础溶剂，加入人血白蛋白，检测外泌体浓缩液外泌体浓度，确定最终制剂中外泌体含量为1亿个/ml，再加入稳定剂，丙酮酸钠和谷氨酰胺。检测pH值，使用稀盐酸或稀氢氧化钠调pH值为7.2，然后使用220nm滤膜过滤器除菌过滤后分装为5ml、10ml、20ml西林瓶压盖密封，置2-8℃冷柜贮藏。
实施例3
与实施例2相比，区别仅在于人血白蛋白的浓度，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体制剂含人血白蛋白的浓度为8％，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
实施例4
与实施例2相比，区别仅在于人血白蛋白的浓度，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体制剂含人血白蛋白的浓度为10％，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
实施例5
与实施例2相比，区别仅在于生理盐水的浓度，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体制剂生理盐水的浓度为0.85％，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
实施例6
与实施例2相比，区别仅在于脐带间充质干细胞外泌体的含量为107个，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
对比例1
与实施例2相比，区别仅在于人血白蛋白的浓度，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体制剂含人血白蛋白的浓度为1％，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
对比例2
与实施例2相比，区别仅在于人血白蛋白的浓度，本实施例中的脐带间充质干细胞外泌体制剂含人血白蛋白的浓度为3％，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
对比例3
与实施例2相比，区别仅在于：本对比例中不加人血白蛋白，用质量浓度为5％复合氨基酸替换，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。复合氨基酸为250m1的17AA，总氨基酸为19.133。
对比例4
与实施例2相比，区别仅在于：本对比例中将生理盐水替换为磷酸盐缓冲液(PBS：浓度为5％，pH值7.4)，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
对比例5
与实施例2相比，区别仅在于：本对比例中将生理盐水替换为葡萄糖注射液(质量浓度为5％)，外泌体制剂中的其余组分与实施例2相同，制备方法与实施例2相同。
实验例1
实验目的：证实实施例2提供的脐带间充质干细胞外泌体制剂能否保持12个月的生物活性。
实验方法：参照药典有关生物制品加速试验方法，即成品正常保存是存放在2-8℃下，现在存放37℃，进行加速试验。也即常规的存放37℃3天相当于2-8℃存放6个月，存放37℃7天相当于2-8℃存放12个月，本试验以存放更长时间来限定6个月或12个月的有效期。试验是以存放37℃4天相当于2-8℃存放6个月，存放37℃10天相当于2-8℃存放12个月。
试验品制备：按照脐带间充质干细胞外泌体制剂制备与检定标准(自定试行)制备和检定。
检定：取50支实施例2制备的成品，存放于37℃恒温箱内保存，存放2天取出5支按照脐带间充质干细胞外泌体制剂制备与检定标准(自定试行)进行检测。
检测项目：外观检查，无菌检定，外泌体完整性检查(透射电子显微镜观察外泌体完整性)，生物活性大分子(以检查成纤维细胞生长因子活性质量作为特定活性因子检测)活性检查(检查FGF的活性含量，采用加拿大YES公司的高精度ELISA定量检测试剂盒)。
检验结果如下：
本实验例选择取5支样品分别进行检测，检测结果按平均值记录。
Figure BDA0003035462500000091
上述检测结果显示，加速试验37℃存放10天，仍保持90％生物活性，按照有关规定，2-8℃存放，订立12月有效期。
荧光电子显微镜观察图参照图1所示，由图可知，37℃存放10天后，外泌体的完整性高。
图2所示为标准品检测结果曲线，将各个样品检测结果(OD450的吸光度)代入曲线得到样品的FGF的浓度值。
实验例2
本实验例的实验目的在于：不同蛋白质浓度以及人血白蛋白对成品保持效果分析。
实验方法：将实施例2-4以及对比例1-3制备的脐带间充质干细胞外泌体制剂进行加速试验，在加速试验的条件下(在37℃存放10天)，然后比较生物活性和外泌体完整性。
检定：取50支上述制备的各种浓度的成品，存放于37℃恒温箱内保存，存放10天取出5支按照脐带间充质干细胞外泌体制剂制备与检定标准(自定试行)进行检测。检测项目：外观检查，无菌检定，外泌体完整性检查(透射电子显微镜观察外泌体完整性)，生物活性大分子(以检查成纤维细胞生长因子活性质量作为特定活性因子检测)活性检查(检查FGF的活性含量，采用加拿大YES公司的高精度ELISA定量检测试剂盒)。
检验结果如下：
说明：取5支样品分别进行检测，检测结果按平均值记录。
Figure BDA0003035462500000101
由上述检测结果可知，加速试验37℃存放10天，复合氨基酸保存活性较人血白蛋白为差，5％人血白蛋白浓度仍保持90％以上的生物活性，虽然更高的人血白蛋白浓度具有更好的生物活性但相差不大，但成本更高，所以优选采用5％人血白蛋白浓度。
实验例3
实验目的：最终产品—脐带间充质外泌体制剂成品是可用于人体注射的，所以必须选用可用于注射的基础溶剂。用实验用家兔作为实验动物进行动物试验比较三种溶剂的动物注射反应。
实验方法：分别用实施例2、对比例4-5制备的脐带间充质干细胞外泌体制剂成品，注射家兔观察家兔生理变化。
试验品制备：按照脐带间充质干细胞外泌体制剂制备与检定标准(自定试行)制备和检定。
试验结果如下：
说明：取5支样品分别进行注射试验，监测家兔反应。
检查项目 生理盐水 磷酸盐缓冲液 葡萄糖注射液
体温变化 正常 正常 有轻微升高
疼痛反应 无 有轻微 无
饮水量 正常 正常 增多
尿量 正常 正常 增多
结果显示，磷酸盐缓冲液可能引起血管疼痛反应，葡萄糖注射液可能升高血糖引起不适，生理盐水为基础溶剂最为合适。
实验例4
本实验例按注射剂要求分别进行相关实验验证(针对本申请实施例1-6制备的脐带间充质干细胞外泌体制剂)。
(1)无菌实验：采用检测细菌的血平板培养基和真菌平板培养基，将样品(成品)接种培养，无菌长出为阴性(无菌)为合格。
经过大量(不下100批次)采样接种培养，均为阴性(无菌长出)，证实本发明的间充质干细胞外泌体制剂成品达到无菌要求。
(2)无热原实验：采样家兔法和鲎试剂法进行热原试验.结果显示：采样家兔法注射本发明的间充质干细胞外泌体制剂成品均正常，无热原反应。采用鲎试剂法，不下50批次的样品实验，均为阴性(鲎试剂不凝固)。证明本发明多做成的间充质干细胞外泌体制剂成品符合无热原要求。
(3)澄明度检查实验：取成品50批次进行澄明度检查，均合格。按照澄明度检查的规定，符合规定要求。
(4)pH值检查：外泌体适宜偏碱性(7.2-8.0)相对稳定，因此，按照一般注射剂要求pH4～9，本发明制成的间充质干细胞外泌体制剂成品pH值，经过取成品50批次进行pH值检测，pH值均在范围7.4-8.0之内。符合pH值的要求。
(5)渗透压：由于本发明的间充质干细胞外泌体制剂成品基础溶剂采用生理盐水，其渗透压与血浆渗透压相等或接近。
结果结论：经过不下50批次的样品渗透压试验都合格。
(6)安全性试验：我们按照注射剂要求进行安全性试验，用实验动物进行安全试验包括刺激性试验、溶血试验、过敏试验、急性毒性试验、长期毒性试验。
结果结论：各个试验均无毒性反应，证明本发明的间充质干细胞外泌体制剂成品安全性合格。
(7)稳定性试验：采用生物制品加速试验方法，进行长期稳定测试，本发明的间充质干细胞外泌体制剂成品加速试验证明在2-8℃、避光贮藏，可保存12月的有效期。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脐带间充质干细胞外泌体制剂，其特征在于，其包括脐带间充质干细胞外泌体、人血白蛋白和基础溶剂，所述脐带间充质干细胞外泌体制剂中所述人血白蛋白的质量浓度为5％-10％，所述基础溶剂为生理盐水，所述生理盐水的质量浓度为0.85％-0.9％。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂，其特征在于，每毫升所述脐带间充质干细胞外泌体制剂中所述脐带间充质干细胞外泌体的含量为107-109个。
3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体制剂还包括稳定剂，所述稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂，其特征在于，所述稳定剂包括质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.05％-0.06％谷氨酰胺。
5.根据权利要求1-4任一项所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体制剂的pH为7.0-8.0。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述基础溶剂、所述脐带间充质干细胞外泌体和所述人血白蛋白混合制得混合液。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括调节所述混合液的pH至7.0-8.0。
8.根据权利要求7所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括调节pH后对混合液进行除菌过滤；优选地，所述除菌过滤是指采用220nm滤膜进行过滤。
9.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括向所述混合液中加入质量浓度为0.01％-0.02％的丙酮酸钠和质量浓度为0.04％-0.06％谷氨酰胺。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的脐带间充质干细胞外泌体制剂在制备注射剂中的应用。
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