CN111826345A - 一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，包括以下原料:Lonza UltraCULTURE无血清培养基，PALL UltroserG血清替代物，L‑Glutamine，灵芝多糖。将所培养的细胞消化下来用氯化钠注射液洗涤后加入培养上清液中。上清液放入超低温冰箱中冷冻。将培养上清液取出解冻，高速离心后取上清液用超滤膜浓缩，然后加入透明质酸钠、人血白蛋白、海藻糖制备人脐带间充质干细胞外泌体制剂。该人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法使用无血清培养体系品质稳定、批间差异小，避免引入外源致病因子；添加灵芝多糖能促进脐带间充质干细胞的增殖和促进脐带间充质干细胞分泌外泌体；完全培养基和条件培养基用来获得外泌体，提高产量；细胞冷冻裂解后内容物混入培养上清中，增加活性物质浓度，是一种效果很好的美容抗衰生物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞技术领域，具体为一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，目前在临床应用也较多，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。由于人脐带间充质干细胞个体较大，人体应用中存在血气屏障阻隔，能到达作用部位的数量较少，且保存和运输过程中维持细胞活性需要繁琐的工艺和大量的成本。外泌体是由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成，并主动分泌至胞外的大小均一，分子直径为40～100nm的亚细胞双层膜囊泡，其内含有与细胞来源相关的蛋白质、miRNA及mRNA等物质。外泌体既可以通过质膜受体直接激活受体细胞，也可以转运蛋白质、miRNA及mRNA甚至细胞器进入受体细胞内，同时也可以携带处于不同病例状态下的细胞所含有的特异性物质，从而在生理学和病理学上都发挥着重要的作用。外泌体在临床诊断、抗肿瘤和美容抗衰方面的应用比活细胞具有更广泛的前景。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法，具备安全稳定和高效省时等优点，在相同的培养时间里能获得更多的外泌体活性单位。且本方法制备的外泌体制剂外泌体浓度高，便于保存和运输。
(二)技术方案
为实现上述安全稳定和高效省时目的，本发明提供如下技术方案：一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，包括以下原料：Lonza UltraCULTURE无血清培养基，0.9％氯化钠注射液，75％酒精，PALL UltroserG血清替代物、L-Glutamine、灵芝多糖、Gibco0.05％Trypsin-EDTA。
一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)用UltraCULTURE完全培养基重悬细胞，按3000-8000/cm2密度接种于培养容器中，补加UltraCULTURE完全培养基至0.15-0.2ml/cm2，放入二氧化碳培养箱中培养48-72h。
(2)待细胞数量足够并生长到70-90％融合度时收获上清液，换上等量UltraCULTURE无血清基础培养基继续培养。
(3)换液培养72小时后，收获上清液，将两次收获的上清液混合。将细胞消化下来，用0.9％氯化钠注射液重悬后加入混合上清液中。
(4)将混合上清液放入-20℃低温冰箱中保存。
(5)从低温冰箱中取出上清液解冻，1500-2000g离心力离心15-20min，去除细胞碎片和细胞器等沉淀。
(6)将离心后的上清液用vivaflow 200切向流膜包超滤浓缩，使用截留分子量大于5KD的超滤膜。
(7)向浓缩后的外泌体溶液中加入透明质酸钠、人血白蛋白、海藻糖，即制成人间充质干细胞外泌体制剂。
优选的，所述步骤(1)中使用的UltraCULTURE无血清完全培养基中添加了2-4mM/L的L-Glutamine,2-5％的UltroserG血清替代物，20-60mg/L的灵芝多糖。
优选的，所述步骤(1)中使用的培养容器为康宁CellSTACK10层细胞工厂。
优选的，所述步骤(4)中所述的细胞消化，具体步骤如下，待细胞融合度达到80％-90％时，将培养容器内旧培养液转移至离心管中，加入氯化钠注射液轻轻冲洗细胞培养容器1遍，加入胰酶溶液消化细胞，轻轻摇动培养容器，消化时间为2～3min，加入氯化钠注射液终止消化过程，细胞悬液移入离心管中，用氯化钠注射液定容，500g，离心5min，去除上清液。
优选的，所述步骤(7)中需要对混合上清液进行浓缩的倍数为10-20倍。
优选的，所述步骤(8)添加透明质酸钠浓度为1-3％，人血白蛋白浓度为 1-3％，海藻糖浓度为0.1-0.2mol/L。
附图说明
图1为本发明白细胞分化抗原检测数据值示意图；
图2为本发明脐带间充质干细胞培养数据示意图。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法，具备以下有益效果：
1、添加灵芝多糖促进脐带间充质干细胞的增殖和促进脐带间充质干细胞分泌外泌体。
2、使用无血清培养体系，品质稳定批间差异小，避免引入外源致病因子。
3、完全培养基和条件培养基用来获得外泌体，提高产量。
4、将细胞加入混合上清中冷冻裂解，增加了上清液中活性物质浓度。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，包括以下原料：Lonza UltraCULTURE无血清培养基，0.9％氯化钠注射液，75％酒精，PALL UltroserG 血清替代物，L-Glutamine,灵芝多糖，Gibco0.05％Trypsin-EDTA。
(2)一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂的制备方法，包括如下步骤： (1)用UltraCULTURE完全培养基重悬细胞，按5000/cm2密度接种于培养容器中，补加UltraCULTURE完全培养基至0.15/cm2，放入二氧化碳培养箱中培养72h。
(3)待细胞数量足够并生长到80％融合度时收获上清液，换上等量 UltraCULTURE无血清基础培养基继续培养。
(4)换液培养72小时后，收获上清液，将两次收获的上清液混合，细胞工厂中加入氯化钠注射液300ml轻轻冲洗细胞培养容器1遍，加入 0.5％Trypsin-EDTA溶液消化细胞3min，加入氯化钠注射液终止消化过程，细胞悬液移入离心管中，用氯化钠注射液定容，500g，离心5min，去除上清液。用 0.9％氯化钠注射液重悬后加入混合上清液中。
(5)将混合上清液放入-20℃低温冰箱中保存。
(6)从低温冰箱中取出上清液解冻，2000g离心力离心15，去除细胞碎片和细胞器等沉淀。
(7)将离心后的上清液用vivaflow 200切向流膜包超滤浓缩20倍，使用截留分子量大于5KD的超滤膜。
(8)向浓缩后的外泌体溶液中加入1％透明质酸钠、1％人血白蛋白、0.2mol/L 海藻糖，即制成人间充质干细胞外泌体制剂。
此方法在实施时，通过对添加灵芝多糖促进脐带间充质干细胞的增殖和促进脐带间充质干细胞分泌外泌体，然后使用无血清培养体系，品质稳定批间差异小，避免引入外源致病因子，完全培养基和条件培养基用来获得外泌体，提高产量，将细胞加入混合上清中冷冻裂解，增加了上清液中活性物质浓度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用UltraCULTURE无血清完全培养基培养人脐带间充质干细胞；
(2)待步骤(1)中细胞数量足够并生长到70-90％融合度时收获培养上清液，换上UltraCULTURE无血清基础培养基培养72h，收获上清液；
(3)将步骤(2)两次收获的上清液混合，细胞消化下来洗涤后加入混合上清液中
(4)将步骤(3)得到的混合上清液放入低温冷冻冰箱中冷冻保存。
(5)将步骤(4)上清液取出解冻后高速离心弃去沉淀。
(6)将步骤(5)得到的上清液用用切向流膜包超滤浓缩。
(7)将步骤(6)得到浓缩液中加入透明质酸钠、人血白蛋白、海藻糖制成人脐带间充质干细胞外泌体制剂。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，其特征在于步骤(1)中使用的UltraCULTURE无血清完全培养基中添加了2-4mM/L的L-Glutamine,2-5％的UltroserG血清替代物，20-60mg/L的灵芝多糖。
3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，其特征在于步骤(5)中离心力为1500-2000g，离心时间为15-20min。
4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，其特征在于步骤六使用的超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为10-20倍。
5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂，其特征在于，所述步骤(7)添加透明质酸钠浓度为1-3％，人血白蛋白浓度为1-3％，海藻糖浓度为0.1-0.2mol/L。
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