FI107702B - Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI107702B FI107702B FI914819A FI914819A FI107702B FI 107702 B FI107702 B FI 107702B FI 914819 A FI914819 A FI 914819A FI 914819 A FI914819 A FI 914819A FI 107702 B FI107702 B FI 107702B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- platelet
- platelets
- preparation
- membrane
- fraction
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 23
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 193
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 31
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 30
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 30
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 108010000020 Platelet Factor 3 Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 108010035030 Platelet Membrane Glycoprotein IIb Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 206010060935 Alloimmunisation Diseases 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000000025 haemostatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 phospho Chemical class 0.000 description 3
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 3
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000006390 HLA-B Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 2
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229960002918 doxorubicin hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229940035756 doxorubicin injection Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101100536354 Drosophila melanogaster tant gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 235000019463 artificial additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- HCTVWSOKIJULET-LQDWTQKMSA-M phenoxymethylpenicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 HCTVWSOKIJULET-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
107702
Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi Förfarande för att framställa en blodplattsmembranfrak-tion 5 Tämä keksintö koskee yleisesti lääketieteen alaa ja erityisemmin menetelmää verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi.
Normaali ihmiskeho sisältää 4,0 - 5,5 litraa verta, joka 10 koostuu suunnilleen 60 %:sta nestettä (plasma) ja 40 %:sta järjestyneitä elementtejä (punasolut, valkosolut, ja verihiutaleet). Verihiutaleiden päätehtävä normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa on hemorragian ('verenvuodon) estäminen.
15
Verihiutaleita muodostuu luuytimessä prekursorisoluista, joita nimitetään megakaryosyyteiksi, ja niiden elinikä on 8-10 päivää verenkierrossa. Tämän lyhyen eliniän seurauksena verihiutalepuutosta esiintyy nopeasti, kun luuytimen 20 kyky tuottaa verihiutaleita on lamaantunut, kuten syöpäpotilaissa, jotka ovat kemoterapiassa. Verihiutalepuutosta voi esiintyä myös erilaisten tautien seurauksena, esimerkiksi kun vasta-aineita muodostuu In vivo verihiutaleiden pintaglykoproteiineja vastaan, tai muita verihiu- ··« : 25 taleiden pinta-antigeenejä vastaan. Sellaisesta verihiu- *:**: taleiden poistumisesta tai hajoamisesta on seurauksena riittämätön määrä veressä kiertäviä verihiutaleita (tila, • · •j. jota nimitetään trombosytopeniaksi (trombosyyttikadoksi), • · · » ....: ja se voi aiheuttaa hallitsematonta vuotoa. Verihiutale- • · 30 kato voi olla seurausta myös kirurgisesta toimenpiteestä, • · f joka käsittää esimerkiksi ruumiin ulkopuolisen verenkier- . ron, jolla on taipumusta vahingoittaa tai tuhota kiertä- . viä verihiutaleita. Trombosytopenian kliiniseen hoitoon .··' on tyypillisesti kuulunut tuoreiden, ehjien verihiutalei- :*·.· 35 den siirto.
• · • « · • · • ·· • · ·
Enimmäkseen ollaan siinä käsityksessä, että vain metabo- • · · :m ·\ lisesti aktiiviset, ehjät verihiutaleet voivat toimia in • · · • · · • · 2 107702 vivo verenvuodon tyrehdyttämiseksi. Verensiirtoterapia on sen vuoksi ollut riippuvaista korkealaatuisten, tuoreiden, elinkykyisten verihiutaleiden toimittamisesta. Verihiutaleita valmistetaan verensiirtoa varten tavallisesti: 5 (a) vasta luovutetuista veriyksiköistä, joita nimitetään satunnaisluovuttajaverihiutaleiksi tai (b) yhdestä luovuttajasta selektiivisen erottamisen avulla, joita nimitetään yksiluovuttajaverihiutaleiksi. Nämä verensiirto-tuotteet ovat plasmasuspensioita, jotka sisältävät tuo-10 reita, väkevöityjä, ehjiä verihiutaleita.
Pääasiallinen haittatekijä tämänhetkisessä verihiuta-lesiirtokäytännössä on ehjien verihiutaleiden lyhyt käyttöikä, kolmesta viiteen päivään. Monet sairaaloiden, ve-15 ripankkien ja vastaavien laitosten keräämät verihiuta- leyksiköt hävitetään valitettavasti vanhentumisesta johtuen. Lyhyestä säilymisajasta johtuen on hyvin vaikeata ylläpitää suuria verihiutaleyksikkövarastoja. Tämä ongelma on erityisen monimuotoinen hajautettujen toimintojen 20 yhteydessä kuten sotilas-, siviilipuolustus- ja katastrofitoiminnoissa.
Useita korvikkeita on kokeiltu ehjille, elinkykyisille i · » verihiutaleille koskien verensiirtoa sekä kliinisesti [ / 25 että eläinmalleissa. Vuonna 1956 (1) raportoitiin, että • · * *·’·* hemostaasi saatiin aikaan lyofilisoitujen verihiutaleiden ...: kliinisen antamisen seurauksena, mikä viittasi siihen, että verihiutaleiden morfologinen ehjyys ei ehkä ole ··· : .· : välttämätön ehjien verihiutaleiden ainakaan joidenkin in 30 vivo-toimintojen säilyttämisen kannalta. Pääasiallinen sivuvaikutus lyofilisoidun verihiutalevalmisteen laski-.···. monsisäisestä antamisesta oli, että potilaalla esiintyi *· ankaraa kipua infuusiokohdassa, johtuen luultavasti suo- t i i *! nikouristuksesta, jonka lyof ilisoidun valmisteen suuri • I» ·...* 35 serotoniinipitoisuus aiheutti. Päinvastaisesti edellisen :·.·. tuloksen kanssa, vuonna 1959 raportoitiin (2) , että tuo- φ « .·. : reillä, ultraäänihajotetuilla kokonaisilla verihiutale- • · · • · 3 107702 valmisteilla ei onnistuttu alentamaan erytrosyyttien lukumäärää trombosytopenisten koirien imunesteessä. McGill fit ai. (3) raportoi äskettäin, että verihiutaleiden mem-braanikonsentraattien siirtäminen lyhensi vuotoaikoja 5 trombosytopenisillä kaneilla. Konsentraatti sisälsi suunnilleen normaalin verihiutaleen kokoisia verihiutalehaa-muja, jotka sisälsivät mitokondrioita ja pintayhteysjärjestelmän jäänteitä. McGill'in konsentraatti valmistettiin: (1) sentrifugoimalla kanien kokoverta tuoreiden 10 verihiutaleiden pelletoimiseksi; (2) jäädyttämällä pelletti -65°C:ssa; (3) sulattamalla ja sen jälkeen kahdesti jäädytyssulattamalla pelletti; ja (4) huuhtelemalla ja suspendoimalla pelletti verihiutalevapaaseen plasmaan.
15 Valmistettaessa edellä mainittuja verihiutalemembraani- fraktioita, ylläpidettiin noin 4°C tai vähemmän lämpötila-olosuhteita. Sellaiset lämpötilat ovat yleisesti käytettyjä työskenneltäessä biologisten kohteiden kanssa, koska aktiivisuus menetetään tavallisesti hyvin lyhyillä aika-20 väleillä, kun biologiset kohteet saatetaan alttiiksi korkeammille lämpötiloille. Esimerkiksi proteiinit kuten entsyymit voidaan inaktivoida kuumentamalla noin 60°C:- ·:·. seen. Aktiivisuus voidaan menettää jopa 4°C:ssa. On rapor- • · · [ toitu esimerkiksi, että osittain puhdistettu verihiutale- ! 25 tekijä-3 (PF-3) menettää suuren osan hyytymisaktiivisuu- • · · '·*·* desta viiden säilytyspäivän jälkeen 4°C:ssa (4). (PF-3 .··: näyttää liittyvän verihiutalemembraanikompleksiin, joka t toimii katalyyttisenä pintana trombiinimuodostuksen edis- * ♦ · ·* tämiseksi). Sellaisella aktiivisuuden menetyksellä on 30 suuri merkitys, kun ajatellaan verihiutalefraktion käyt- ·:··· töä farmaseuttisena valmisteena.
y · · · • · .· . Valmistettaessa verihiutalefraktiota ihmiskäyttöä varten, • « · ' *· ” on tietenkin välttämätöntä käyttää steriilejä olosuhtei- • · · *...: 35 ta. Kokoveriverensiirtojen tavoin, luovutetut verihiuta- ·’·*; leyksiköt altistavat vastaanottajat taudinsiirtymisris- « · : kiin kuten AIDS'in, hepatiitin ja muiden verensiirron • · 4 107702 välityksellä siirtyviin tauteihin. Toinen riski on se, että monen verensiirron jälkeen vastaanottaja/potilaissa voi kehittyä vasta-aineita luovutettuja verihiutaleita vastaan (tila, joka tunnetaan nimellä alloimmunisaatio).
5 Sellaiset vasta-aineet voivat aiheuttaa siirrettyjen verihiutaleiden tuhoutumisen. Verensiirtojen yhteydessä on merkittävänä vaaratekijänä lisäksi varastoitujen verihiutaleiden bakteerikontaminaatio.
10 Keksintö koskee menetelmää verihiutalemembraaniperäisten farmaseuttisten ja diagnostisten tuotteiden valmistamiseksi. Näitä tuotteita ovat verihiutalemembraanivalmis-teet, joissa on prokoagulanttiaktiivisuutta, ja joita voidaan käyttää kokonaisten verihiutaleiden korvikkeina 15 verensiirrossa verenvuodon hallitsemiseksi, ja joita voidaan käyttää paikallisesti haavojen parantumisen edistämiseksi, tai voidaan käyttää diagnostisena aineena in vitro tai in vivo.
20 Verihiutalefragmenttivalmiste ei saa sisältää aktiivista virusta. Keksinnön mukainen edullinen menetelmä tällaisen valmisteen valmistamiseksi käsittää verihiutalemembraani- ...# fragmenttivalmisteen lämpökäsittelyn viruskontaminaation, * · · * . samoin kuin bakteerikontaminaation, vähentämiseksi tai 25 eliminoimiseksi. Vaikka valmistetta lämpökäsitellään, on I · » *·’·* yllättävää, että se säilyttää pro-koagulanttiset ja hemo- staattiset ominaisuudet. Lämpökäsitelty membraanifrag-mentti on lisäksi paljon odotettua pysyvämpi. Valmistetta • · · ‘ : : voidaan varastoida liuoksessa 4°C:ssa vähintään kahdeksan 30 viikkoa ilman merkittävää prokoagulanttiaktiivuuden mene-·;··j tystä vähintään kuuden kuukauden aikana (enemmän kuin 90 .···. % säilynyt) . Siinä säilyy tämä aktiivisuus (enemmän kuin 90 %) jopa lyofilisoinnin jälkeen. Lisäksi proteiini- ja • · · *· ” fosfolipidipitoisuus ei muutu lyofilisoinnin ja kuuden • · · 35 kuukauden säilytyksen jälkeen.
• · · • · · • · • · .·. : Keksinnön mukaisesti valmistettu valmiste ei ole immuno- * · · • · 5 107702 geeninen eikä erityisesti antigeeninen ryhmän I HLA-anti-geenideterminanttien suhteen. Valmisteen sopivuus tietylle vastaanottajalle ei siten ole rajoitettu luovuttajan geneettisten ominaisuuksien mukaan.
5
Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistettu verihiutalemem-braanifragmenttivalmiste, jossa on prokoagulanttiaktii-visuutta ja joka kykenee hillitsemään verenvuotoa, ei sisällä olennaisesti lainkaan GP Ilb/IIIa-kompleksia. Tämä 10 on yllättävää siinä mielessä, että yleisesti otaksutaan, että GP Ilb/IIIa-kompleksi ottaa osaa ja on välttämätön hemostaasissa.
Verihiutalemembraanifragmenttivalmiste ei sisällä olen-15 naisesti lainkaan haamuverihiutaleita, ja sisältää suhteellisen homogeenisia mikropartikkeleita. Vähintään 80 % mikropartikkeleista on läpimitaltaan edullisesti alle 600 nanometriä, ja vähintään 95 % on läpimitaltaan alle yhden mikronin. Edullisimmin mikrorakkulat ovat läpimitaltaan 20 keskimäärin välillä noin 300 - 400 nanometriä. Sellaisten mikropartikkelien koko on noin 1/5 - 1/7 tyypillisen haa-muverihiutaleen koosta.
• · · • m
Edullinen valmiste ei sisällä käytännöllisesti katsoen • · . . 25 lainkaan serotoniinia (alle 0,02 % verihiutalelysaateista » · · *·*;* todetusta määrästä), mikä siten eliminoi hengitys- ja ve- • · · ···! risuoniongelmat, jotka olivat tunnusomaisia, kun käyte- tään tiettyjä aikaisempia valmisteita verensiirrossa.
··« ; Valmiste ei lisäksi sisällä ilmaistavissa olevaa puriini- 30 nukleosidifosforylaasiaktiivisuutta, joka on sytoplasmi-*:··: nen entsyymimarkkeri, ja on olennaisesti vapaa tekijöistä • ***; V, VIII, IX ja X. Mikropartikkelifraktio voi sisältää 3 % • · · .· . hiilihydraattia, 30 % fosfolipidiä, 58 % proteiinia ja 9 • · · ‘ *·./ % kolesterolia painon mukaan, ja proteiinin suhde fosfo- • · '···* 35 lipidiin on 1,97 ± 0,10 (keskiarvo ±keskipoikkeama, n=7) .
• · · • · · • · • · :*·.· Verihiutalemembraanifragmenttivalmiste voidaan yllättäen • · 6 107702 valmistaa vanhoista verihiutaleista. Sairaalat ja vastaavat laitokset varastoivat tyypillisesti verihiutaleita verensiirtoa varten huoneen lämpötilassa kolmesta viiteen päivään. Tämän jälkeen verihiutaleita pidetään käyttöön 5 sopimattomina ja ne hylätään "vanhentuneina verihiutaleina". On keksitty, että farmaseuttisia ja diagnostisia valmisteita voidaan valmistaa sellaisista vanhentuneista verihiutaleista. Keksintö sisältää siten edun, jonka mukaan verihiutalemembraanifraktio voidaan toimittaa veren-10 siirtoa varten, valmistettuna kokonaan tai osaksi vanhentuneista verihiutaleista, mikä siten hyödyntää huomattavien verihiutalemäärien käytön, jotka tätä ennen on heitetty pois käyttökelvottomina.
15 Keksintö koskee menetelmiä verihiutaleperäisten tuotteiden valmistamiseksi. Yhdessä keksinnön mukaisessa näkökohdassa, valmistetta, joka sisältää verihiutaleita tai verihiutalemembraanifragmentteja, joissa on protrombinaa-siaktiivisuutta, lämpökäsitellään olosuhteissa, jotka 20 riittävät inaktivoimaan kaikki valmisteen sisältämät virukset. Sellainen valmiste voidaan myös homogenoida, edullisesti sonikoimalla, verihiutalemembraanimikropar- ·:·. tikkelien muodostamiseksi, jotka ovat olennaisesti vapai- • · · ta verihiutalehaamuista. Valmistetta voidaan käsitellä • · . . 25 myös olennaisesti kaiken GP IIb/IIIa:n poistamiseksi, • · · ***** joka on pintaglykoproteiinikompleksi.
··· • · · · * * Keksintö koskee myös menetelmää verihiutaleperäisen tuot- • · · ; teen valmistamiseksi käyttäen vanhentuneita verihiutalei- 30 ta tai niiden membraaniosia lähtöaineena. Vanhentuneet *:**: verihiutaleet voivat olla lähtöisin yhdestä luovuttajasta ·***; tai ne voidaan koota moninaisista lähteistä. Myös tähän • · · .* . menetelmään sisältyy lämpökäsittely viruksen inaktivoimi- • « · seksi, käsittely mikropartikkeleiden muodostamiseksi ja • » **;·* 35 mahdollisesti GP IIa/IIIa:n eliminoimiseksi olennaisilta :*·*: osiltaan.
• · • · • · · • · · • · 7 107702
Edullisin menetelmä keksinnön mukaisten tuotteiden valmistamiseksi käsittää verihiutaleiden toistuvan jäädytys-sulatuksen ja pesun pääasiassa verihiutalehaamujen ja lysaatin saamiseksi. Verihiutalehaamut erotetaan sen jäl-5 keen lysaatista ja suspendoidaan liuokseen suspension muodostamiseksi. Sen jälkeen verihiutalehaamuja sisältävä suspensio kuumennetaan vähintään 60°C:seen vähintään kahden tunnin ajaksi viruskontaminanttien inaktivoimiseksi. Lämpökäsittely aiheuttaa myös saostuman muodostumisen.
10 Saostumaa ei kuitenkaan poisteta tässä kohdassa, koska se sisältää merkittävän määrän haluttua aktiivisuutta. Saostuman sisältävä suspensio sen sijaan homogenoidaan ensin edullisesti sonikoimalla ja sen jälkeen saostuma erotetaan suspensiosta. Suspensio voidaan sen jälkeen varas-15 toida tai käyttää verensiirtoon.
Verihiutalemembraanifragmenttivalmistetta voidaan käyttää farmaseuttisesti tehokkaina määrinä eläinten tai ihmisten käsittelemiseksi verenvuodon estämiseksi. Kun farmaseut- 20 tista valmistetta käytetään verensiirtoihin, steriili valmiste voidaan suspendoida mihin tahansa fysiologisesti yhteensopivaan liuokseen kuten saliiniin tai plasmaan* ♦:*. sitä voidaan käyttää yksin tai muiden aineiden kanssa, • · · mukaanlukien kokonaiset verihiutaleet. Valmiste on ihan- • · . . 25 teellinen lisäaine keinotekoiseen vereen. Valmistetta • · · • f voidaan käyttää myös paikallisesti verenvuodon lopettami- • · · seksi ja haavojen hoitamiseksi. Tässä suhteessa valmiste :**: voidaan suspendoida farmaseuttisesti hyväksyttävään kan- • · · : ta jaan kuten geeliin tai voiteeseen, tai se voidaan kyl- 30 lästää kantajaan kuten harsoon. Valmistetta voidaan käyt- ·:·*: tää myös kantajana lääkkeen antamisessa, tai se voidaan ·***: leimata ja käyttää diagnostisesta esimerkiksi kuvanta- • · · .* . misaineena hyytymän sijainnin jäljittämiseksi.
• · · • · · * · · • ·· • · *···* 35 Kuvio 1 on graafinen esitys, joka esittää standardikäyrää :*·*: koskien trombiinin hyytymisaikaa; • · « · « • · · • · 107702 δ
Kuvio 2 on graafinen esitys, joka osoittaa lämpökäsittelyn vaikutuksen PF-3:n spesifiseen aktiivisuuteen;
Kuvio 3 on graafinen esitys, joka osoittaa verihiutale-5 määrän ja vuotoajan normaaleissa trombosyyttisissä ja trombosytopenisissä kaneissa;
Kuvio 4 on graafinen esitys, joka osoittaa siirrettyjen verihiutalemembraanimikropartikkeleiden vaikutuksen vuo-10 toaikaan doksorubiinihydrokloridilla indusoituihin trom-bosytopenisiin eläimiin;
Kuvio 5 on graafinen esitys, joka osoittaa siirrettyjen verihiutalemembraanimikropartikkeleiden vaikutuksen vas-15 ta-aineindusoituihin trombosytopenisiin eläimiin; ja
Kuvio 6 on graafinen esitys, joka osoittaa siirrettyjen verihiutalemembraanimikropartikkeleiden annoksesta riippuvaisen vaikutuksen vuotoaikaan busulfaanilla indusoi-20 tuihin voimakkaasti trombosytopenisiin eläimiin.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut tuotteet *:1. valmistetaan kokonaisista verihiutaleista tai kokonaisten * · · 1“ verihiutaleiden membraanijohdannaisista. Kokonaiset veri- • · . ^ 25 hiutaleet voivat olla juuri kerättyjä verihiutaleita tai ne voivat olla vanhentuneita verihiutaleita. Vanhentu- • · · neilla verihiutaleilla tarkoitetaan verihiutaleita, jotka * 1 on varastoitu lämpötilassa, joka on välillä noin 4°C ja • · · v 2 huoneen lämpötila vähintään kolmen päivän ajaksi. Vanhen- 30 tuneita verihiutaleita ovat sellaiset, jotka hyväksytyn *:2: käytännön mukaisesti heitetään pois, koska ne eivät enää ·1“: ole sopivia käytettäväksi verensiirtomateriaalina. Veri- ··· . hiutaleiden johdannaisilla tarkoitetaan hajoitettuja ve- • · · rihiutaleita kuten haamuverihiutaleita tai verihiutale- • « *·;·1 35 membraanifragmentteja, mukaanlukien verihiutalemembraani- :1·1: mikrorakkulat.
♦ · · • · · • · · 2 • · 9 107702
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja tuotteita annetaan kohteille tehokkaina määrinä. Ilmaukseen "kohde" on tarkoitettu sisältymään eläviä organismeja, joilla on hemostaattinen kyky, jossa välittäjinä ainakin osaksi 5 ovat verihiutaleet, esim. ihmiset, koirat, kissat, hevoset ja muita sellaisia. "Tehokas määrä" on se määrä, jolla on mahdollista saavuttaa tietty terapeuttinen tai diagnostinen päämäärä, jota varten tuote annetaan. Yleisessä verensiirtotapauksessa tehokas määrä on se, joka 10 toimii hemostaattisen funktion palauttajana olennaisesti samalle tasolle, joka olisi saavutettu, jos kokonaisia verihiutaleita olisi siirretty. Tapauksessa, jossa kohde kärsii trombosytopeniasta, tehokas määrä on se määrä, jolla kyetään alentamaan vuotoaikaa kohteessa, edullises-15 ti vaarattomille tasoille, ja edullisimmin tasoille, jotka vastaavat normaaleja yksilöitä. Tehokas määrä voidaan määrittää yksilökohtaisesti, ja se perustuu ainakin osaksi kohteen kokoon, hoidettavien oireiden vakavuuteen ja etsittäviin tuloksiin. Tehokkaan määrän voi siten määrit-20 tää alaa tunteva, käyttäen sellaisia tekijöitä ja käyttäen vain rutiinikoejärjestelyjä.
*:*. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja tuotteita on käsitelty siten, että ne ovat vapaita aktiivisista vi- « « 25 ruksista. Vapaa aktiivisista viruksista tarkoittaa, että * ; tuote on saatettu olosuhteisiin, jotka riittävät inakti- • · · ····’ voimaan tai tuhoamaan kaikki läsnä olevat virukset, kuten * ‘ esimerkiksi HBV:n, NANBHV:n, CMV:n tai HIV:in. Sellaisiin ··· V· olosuhteisiin kuuluvat sellaiset käsittelyt, jotka käsit- 30 tävät vasta-aineet, etanolin, ultraviolettivalon, orgaa-*:*·: nisen liuotin-pesuaineen ja kelatoivat fenantroliiniai- ·“*: neet. (Katso "Virus Inactivation in Plasma Products", ed.
• · · .* . J.-J. Morgenthaler, Current Studies in Hematology and • · » [,/ Blood Transfusion, n:o 56, Karger, N.Y. 1989, varta vas- • · *··/' 35 ten sisällytetty tähän viitteenä.) Keksinnön mukainen me- Γ·|: netelmä virusten inakt ivo imi seksi sisältää lämpökäsitte- lyn, kestoltaan ja voimakkuudeltaan viruksia inaktivoivan • · 10 107702 tai tuhoavan.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja tuotteita on käsitelty myös niiden immunogeenisyyden alentamiseksi 5 tai eliminoimiseksi verensiirtoa ajatellen. Näitä tuotteita valmistetaan edullisesti yhteenkootuista verihiutaleista, jotka normaalisti indusoisivat vasta-ainereaktion tullessaan siirretyiksi useimpiin yksilöihin. Tällä hetkellä alloimmunisaatio on vaikea ongelma trombosytopenis-10 ten potilaiden hoidossa, jotka tarvitsevat toistuvia ve-rihiutalesiirtoja. Verihiutaleilla on HLA-A- ja HLA-B-antigeenejä, jotka ovat joko osa verihiutalemembraania tai absorboituvat plasmasta. Vasta-aineiden kehittyminen HLA-A- tai HLA-B-antigeenejä vastaan (mikä on tärkein syy 15 verihiutalealloimmunisaatiolle) aiheuttaa siirrettyjen verihiutaleiden tuhoutumisen, mikä siten vähentää veri-hiutalesiirron tehoa hemostaasiin. Valkosolukontaminaatio (jotka solut ovat HLA-antigeenien luoksepäästävä lähde) verihiutalekonsentraateissa voi myös edesauttaa alloim-20 munisaation kehittymiseen.
Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut tuotteet eivät ole immunogeenisiä, alloimmunogeenisiä ja immuno-geenisiä, HLA-determinanteille (erityisesti ryhmän I HLA-25 determinanteille) . Ei-immunogeeninen tässä yhteydessä c « « *^ tarkoittaa, että kohde, usean verensiirron jälkeen, ei *·**, kehitä immunologista reaktiota, joka riittää häiritsemään |#<* siirretyn tuotteen terapeuttista vaikutusta. Ei-alloim- • · · '·* * munogeeninen tässä yhteydessä tarkoittaa, että kohteella, 30 alloimmunogeenisistä lähteistä valmistetun materiaalin *!’*ϊ usean siirron jälkeen, ei ole ilmaistavissa olevaa immu- ·*"; nologista reaktiota alloantigeenejä vastaan. Ilmaistaval- . la tarkoitetaan, että seerumin vasta-ainetta alloantigee- I..* nejä vastaan ei voi ilmaista käyttäen tavanomaista tek- • « *·;*’ 35 nilkkaa, kuten pistemäärityksiä (dot-) , tai immunologinen ·· ♦ i reaktio jollekin alloantigeenille ei ole riittävä häirit- :*·.· semään siirretyn tuotteen terapeuttista vaikutusta.
• · 11 107702
Edullinen menetelmä edullisen tuotteen valmistamiseksi on seuraavanlainen. Vastakerättyjä, varastoituja (yhdestä viiteen päivään 20-25°C:ssa) tai vanhentuneita (yli viisi päivää 4°C:ssa) verihiutalekonsentraatteja (50-60 ml/kon-5 sentraatti) koottiin 600 ml:n veripusseihin (Fenwall siirtopussiyksikkö, 4R2023, Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois) steriilien plasmansiirtovälineiden kautta (Fenwall 4C2243, Fenwall Laboratories, supra). Kukin pussi sisälsi kaikkiaan 500-600 ml verihiutalekonsent-10 raatteja (tämän jälkeen, 600 ml:n yksikkö). 600 ml:n yksiköt sentrifugoitiin nopeudella 1000 rpm 11 minuuttia 22°C:ssa kontaminoivien puna- ja valkosolujen poistamiseksi (PR7000, International Equipment Company, Needham Heights, Massachusetts). Supernatantit, jotka sisälsivät 15 verihiutaleet, siirrettiin sen jälkeen uusiin 600 ml:n veripusseihin ja sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 25 minuutin ajan 22°C:ssa verihiutaleiden erottamiseksi plasmasta. Niukasti verihiutaleita sisältävä plasma poistettiin, ja kukin tuloksena olevista verihiutalepelleteistä 20 suspendoitiin kevyesti 20 ml:aan 0,9 %:ista NaCl-liuosta (fysiologinen saliini), laimennettiin 100 ml:n lopputila-vuuteen vielä saliinilla, ja koottiin sen jälkeen 300 ml:n veripusseihin (kolme 100 ml:n näytettä pussia kohti, mikä vastasi kolmea alkuperäistä 600 ml:n yksikköä) . Re-25 suspendoidut verihiutaleet pelletoitiin uudelleen sentri- • · · fugoimalla 3000 rpm 20 minuutin ajan 22°C:ssa. Superna-***. tantti poistettiin ja verihiutalepelletti pestiin kahdes- ti fysiologisella saliinilla toistamalla suspendointi ja • · · *·* ’ sentrifugointi.
30
Pestyt verihiutaleet suspendoitiin lopuksi fysiologiseen
Mt saliiniin (25 ml kutakin 600 ml:n yksikköä kohti) ja ri- ; kottiin toistamalla jäädytystä (-80°C vähintään kuuden • ·» I./ tunnin ajan) ja sulatusta (25°C:ssa vähintään kuuden tun- • · *;* 35 nin ajan) kolme kertaa. Jäädytetty ja sulatettu suspensio • · · • V laimennettiin fysiologisen saliinin avulla (100 ml kuta- kin 600 ml:n yksikköä kohti) ja sentrifugoitiin nopeudel- 12 107702 la 3000 rpm 30 minuutin ajan verihiutalehaamupelletin keräämiseksi. Tämä verihiutalehaamupelletti suspendoitiin uudelleen fysiologiseen saliiniin (100 ml kutakin 600 ml:n yksikköä kohti) ja pestiin kahdesti toistaen resus-5 pendointia ja sentrifugointia.
Muita menetelmiä voidaan käyttää verihiutalemembraanien rikkomiseksi ja verihiutalehaamufraktion eristämiseksi. Verihiutaleet voidaan esimerkiksi tasapainottaa glysero-10 Iin avulla ja rikkoa sen jälkeen hypotonisesti solun ulkopuolella olevan glyserolipitoisuuden nopealla laimentamisella. Tämä saa aikaan osmoottisen painegradientin verihiutaleiden ulkomembraanin läpi, mikä johtaa solumem-braanin rikkoontumiseen. Monia muita kemiallisia aineita 15 (esim. NaCl) voidaan lisäksi käyttää samalla tavoin osmoottisen shokin indusoimiseksi ja verihiutaleiden rikkomiseksi. Toistuvaa jäädytystä ja sulatusta käytettiin edullisen suoritusmuodon mukaisesti. Pesty haamupelletti suspendoitiin uudelleen fysiologiseen saliiniin (40 - 50 20 ml kutakin 600 ml:n yksikköä kohti) ja kuumennettiin 60°C:ssa 20 tunnin ajan vesihauteessa. Verihiutalehaa-mususpensio voidaan vaihtoehtoisesti kuumentaa 100°C:seen viiden minuutin kuluessa. Nämä olosuhteet ovat riittäviä • · « kaikkien viruskontaminanttien inaktivoimiseksi. Selvästi • · 25 näkyvä saostuma kehittyi kuumennuskäsittelyn aikana. Tämä • · · * ! lämpökäsitelty verihiutalehaamususpensio homogenoitiin • · · *··\ sen jälkeen sonikaattorissa (ultraäänilaite Model W-385,
Heat Systems, Inc., Farmingdale, New York) käyttäen 1/2 *·* ; tuuman värähtelykärkeä virtauskammiossa (Model 800B, Heat 30 Systems). Sonikaattorisysteemiä huuhdeltiin ensin typellä ennen verihiutalehaamususpension injisoimista. Suspen- ·*[*: siota sonikoitiin antamalla virtasykäyksiä 20 kHz:n koh- . dalla 5 minuutin ja 43 sekunnin ajan (2 sekunnin jakso, • · · 1,4 sekuntia päällä, 0,6 sekuntia pois) ulostulosäätöase- • · *·"* 35 tuksen ollessa •U", 48 mikrometrin kaksoisamplitudin • · t j tuottamiseksi. Sonikoitua preparaattia sentrifugoitiin seuraavaksi nopeudella 3000 rpm 30 minuutin ajan 22°C:ssa, • · 13 107702 saostuneen aineksen erottamiseksi muodostuneista veri-hiutalemembraanimikropartikkeleista, jotka jäävät super-natanttiin. Supernatantti poistettiin ja varastoitiin tiiviisti suljetuissa astioissa joko 4°C:ssa, -20°C:ssa 5 tai -80°C:ssa typen alla, tai sitä säilytettiin lyofi- lisoituna typen alla. Ellei toisin ole osoitettu, 4°C:ssa säilytettyjä mikropartikkeleja käytettiin seuraavissa toimenpiteissä.
10 Edellä kuvaillulla tavalla valmistettu verihiutalemikro-partikkelifraktio oli vapaa aktiivisista viruksista. Se oli myös olennaisesti vapaa verihiutalehaamuista, mikro-partikkeleista suuremman osan kuin 80 % ollessa läpimitaltaan keskimäärin alle 600 nanometriä, ja enemmän kuin 15 95 % oli läpimitaltaan keskimäärin alle 1000 nanometriä.
Äskettäin vanhentuneista verihiutaleista (kahden viikon sisällä vanhenemisesta) valmistetut mikropartikkelit olivat läpimitaltaan välillä 300 - 40Ö nanometriä 7 eri valmisteen osalta. Keskihalkaisija 7 valmisteen osalta oli 20 341 nanometriä.
Verihiutalemikropartikkelifraktio oli olennaisesti vapaa .*·*: myös serotoniinista, GP IIb/IIIa:sta (pintaglykoproteii- ....: ni), puriininukleosidifosforylaasista, hyytymistekijöistä • · 25 V, VIII, IX ja X ja trombospondiinista (alfagranulakom-ponentti). Toisaalta, GPIb:tä (toinen pintaglykoproteii- m ’***. ni) oli läsnä, ja beeta-glukuronidaasia (lysosomimarkke- ri) oli myös detektoitavissa (noin 25 % prosenttiosuutena • · · *·* * lysaatista). GP IIb/IIIa:n puuttuminen oli yllättävää, 30 koska otaksutaan, että GP Ilb/IIIa on välttämätön hemos- ”;**ί taasissa.
• » · * · • · · .·! ; Verihiutalemikropartikkelifraktion koostumus määritettiin
• »I
I./ kahdessa eri koesarjassa tiettyjen komponenttien osalta '.** 35 ja esitetään taulukossa I: • · · • · · • » • · · · • · · • · 14 107702
Taulukko X
Prosenttia yhteispainosta (paino/paino) 5 Koe Hiilihydraattia Fosfolipidiä Proteiinia Kolesterolia N=4 3,3±0,14 30±0,9 57,8±0,9 9 (arvio) N=8 2,6±0,3 30,1±2,5 53,2±1,7 9,9±0,9 10
Vasta vanhentuneista verihiutaleista valmistetun edullisen verihiutalemikropartikkelifraktion prokoagulanttiak-15 tiivisuus määritettiin käyttäen Russel'in kyymyrkkyaikaa, 5, jota käytetään PF-3-aktiivisuuden mittaamiseksi. Russel'in määritys on trombiinin muodostumista koskeva testi, jossa loppupiste voidaan määrittää fibrinogeenin hyytymisenä. Spesifinen aktiivisuus määritettiin vertaamalla 20 trombiinin standardikäyrään, ja se voidaan ilmaista yksikköinä (U) muodostunutta trombiinia per mg verihiutale-proteiinia, tai per mg verihiutaleen fosfolipidiä. PF-3;n ·:·. spesifinen aktiivisuus per mg proteiinia (U/mg) määritet- • · · tiin ensimmäisessä koesarjassa olevaksi 148,1±13,4 (n = ♦ « . . 25 7). Toisessa koesarjassa se oli 175±8 (n = 8). PF-3:n • · · spesifinen aktiivisuus per mg fosfolipidiä (U/mg) ensim- • « · *···* maisessa koesarjassa oli 291,3±40,0. Toisessa koesarjassa '·*’* se oli 310±23. Nämä spesifiset aktiivisuudet ylittävät • · · ; selvästi tuoreiden, ehjien kokonaisten verihiutaleiden 30 vastaavat arvot. Otaksutaan, että tämä johtuu prokoagu- *:··· lanttimembraanifraktioiden vapautumisesta, jotka tavalli- .***. sesti ovat saavuttamattomissa ehjissä verihiutaleissa.
• · · • · • · ·
Spesifistä aktiivisuutta oli jäljellä myös lyofilisoinnin • · *··♦' 35 jälkeen, vaikka oli välttämätöntä lisätä suojaavaa ainet- *·*: ta valmisteeseen, jotta säilytettäisiin enemmän kuin 60 % • · spesifisestä aktiivisuudesta (sakkaroosia 0,4 g/dl, > 90 • · 15 107702 % aktiivisuudesta jäljellä).
Valmisteen fosfolipidiosan koostumus määritettiin kahdessa eri koesarjassa ja esitetään taulukossa II: 5
Taulukko II
Prosenttia kokonaisfosfolipidistä (paino/paino)
10 Koe PI PS PE PC SP
N=4 5,811,0 10,1±0,9 22,511,5 45,814,0 15,4±0,7 N=8 6,8±0,5 12,2±0,7 23,8±2,1 40,6±2,3 16,611,5 15 PI: fosfatidyyli-inositoli PS: fosfatidyyliseriini PE: fosfatidyylietanoliamiini 20 PC: fosfatidyylikoliini SP: sfingomyeliini
Verihiutalemikropartikkelifraktioista testattiin niiden « ....: prokoagulanttiaktiivisuus ja kyky hillitä verenvuotoa 25 trombosytopenisissä eläimissä. Vasta valmistetuista veri- • · · hiutaleista valmistetun mikropartikkelifraktion prokoagu-***. lanttiaktiivisuus todettiin vertailukelpoiseksi tuoreista verihiutaleista valmistetun fraktion vastaavan aktiivi- • · · • · · *·1 2 suuden kanssa. Tuoreista ja vasta vanhentuneista verihiu- 30 taleista valmistetuilla fraktioilla oli vastaava prokoa- *·"· gulanttiaktiivisuus verrattuna kokonaisiin verihiutalei- ·3: siin. Tämän fraktion siirtäminen lyhensi vuotoaikaa kai- • · · / . kiila saajaeläimillä.
• M • · · · 2 • · 3 *·;·1 35 Lämpökäsittelyn vaikutus ja sonikoinnin vaikutus proko- j agulanttiaktiivisuuteen testattiin myös. Vasta vanhentu- neista verihiutaleista valmistetun mikropartikkelifrak- 16 107702 tion todettiin olevan suhteellisen pysyvä lämpökäsittelylle. Edelleen todettiin, että tämän verihiutalemikro-partikkelifraktion prokoagulanttiaktiivisuus oli suuresti alentunut, kun lämpökäsiyttelyä edelsi homogenointi. Nämä 5 ja muut mikropartikkelifraktioiden ominaisuudet esitetään täydellisemmin esimerkeissä jäljempänä.
Edellä identifioidun menetelmän mukaisesti valmistetut tuotteet, samoin kuin erilaiset välituotteet, testattiin 10 immunologisissa pistemäärityksissä (dot-) GP lIb/IIIa:n läsnäolon osalta. GP Hb/lila:a oli läsnä ehjissä veri-hiutalevalmisteissa, verihiutalelysaatissa, verihiutale-lysaatin supernatantissa ja verihiutalehaamumembraanival-misteissa. Detektoitavaa GP IIb/IIIa:a ei ollut läsnä 15 kuumennetussa verihiutalehaamumembraanifraktiossa tai lopputuotteessa.
Lopputuote ja välituotteet testattiin myös immunologisissa pistemäärityksissä, koskien HLA-antigeenien läsnäoloa 20 (ryhmä I). HLA-antigeenejä oli läsnä pestyissä ehjissä verihiutalevalmisteissa, verihiutalelysaatissa, veri-hiutalelysaatin supernatantissa ja verihiutalehaamumem- *:·. braanifraktiossa. HLA-antigeenejä ei ollut detektoitavis- • · * ..... sa kuumennetussa verihiutalehaamumembraanifraktiossa tai • · . . 25 lopputuotteessa.
• · · ♦ · · • ·
Lopputuote ja erilaiset välituotteet testattiin lisäksi * * immunologisissa pistemäärityksissä GPIb:n läsnäolon osal- • · · ·.* * ta. Kaikissa testatuissa näytteissä, mukaanlukien lämpö- 30 käsitellyt näytteet, esiintyi GPIb:tä.
• » ·***; Edellä oleva kuvaus koskee edullista suoritusmuotoa. Kek- ··· / . sintö ei kuitenkaan laajimmassa mielessä ole niin rajoi- *./ tettu. Yksi keksinnön mukainen näkökohta koskee veri- • · *·♦·* 35 hiutaleiden tai verihiutalemembraanifraktion tuottamista, :*·*: jotka on lämpökäsitelty viruskontaminanttien eliminoimi- :*·.· seksi. Vaikka sellaisen lämpökäsittelyn tiedetään inakti- • · 17 107702 voivan viruskontaminantteja yleisesti, sitä ei ole koskaan käytetty verihiutalevalmisteen yhteydessä. Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetaan sen vuoksi ensimmäistä kertaa virusinaktivoitua verihiutalefraktiota, joka on 5 käyttökelpoinen verensiirtoon.
Keksinnön avulla tehdään myös aivan ensimmäisen kerran suuret määrät vanhentuneita verihiutaleita, jotka tavallisesti on hylätty, käyttökelpoisiksi verensiirtoon. Si-10 täpaitsi, koska on olemassa kasvava potentiaali vanhentuneiden verihiutaleiden viruskontaminaatiolle varastoinnin aikana, keksinnön mukainen lämpökäsittelyvaihe edesauttaa tekemään vanhentuneista verihiutaleista käyttökelpoisia varmistamalla, että ne ovat virusten osalta inaktivoitu-15 ja.
Keksinnön mukaisesti yhdistetään myös lämpöinaktivointi homogenointivaiheen kanssa, valmistettaessa verihiutale-mikropartikkelifraktiota, joka on olennaisesti vapaa ve-20 rihiutalehaamuista. Valmiste sisältää kooltaan homogeenisia ja ei-toivotusta sytoplasma-aineesta olennaisesti vapaita mikropartikkeleita. Keksinnön mukaisen edullisen menetelmän mukaisesti homogenointi (sonikointi) seuraa ·...: lämpökäsittelyvaihetta, mikä johtaa sekä siihen, että 25 muodostuu kooltaan homogeenisia mikropartikkeleita, että • · · * · siihen, että estetään olennaisen aktiivisuusmäärän sitou- * · · · tuminen lämpöinaktivointivaiheen aikana muodostuneeseen I,.* saostumaan.
• · · • · · 30 Kuten edellä on kuvailtu, mikropartikkelifraktio voidaan valmistaa vaiheittain. Ensiksi, verihiutalemembraani ri- \,.ί kottiin osittain verihiutalehaamufraktion ja sytoplasma- : aineita sisältävän lysaatin muodostamiseksi. Kun veri- • · · hiutalehaamut on erotettu tästä sytoplasma-aineesta, sen • · V 35 jälkeen verihiutalehaamut homogenoidaan fraktion muodos- • · ♦ • V tamiseksi, joka on olennaisesti vapaa verihiutalehaamuis- :/·; ta, ja joka sisältää pääasiallisesti tasakokoisia mikro- 18 107702 partikkeleita. Tulee kuitenkin ymmärtää, että osittain rikkomisen käsittävä esivaihe voidaan eliminoida kokonaan. Verihiutaleet voidaan siten sonikoida ja muodostuneet mikropartikkelit voidaan eristää lysaatista.
5
Otaksutaan, että keksinnön mukainen verihiutalemembraani-mikropartikkelifraktio ei ole olennaisesti immunogeeninen verrattuna kokonaisiin verihiutaleisiin, ja sen vuoksi sitä voidaan valmistaa yhteenkootuista verihiutaleista, 10 jotka on kerätty eri luovuttajilta, joiden veriryhmät sopivat yhteen. Perusteellinen pesu, joka tehokkaasti poistaa kaikki valkoiset verisolut, voi myös edesauttaa valmisteen ei-immunogeenisyyteen.
15 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla edullisilla tuotteilla on siis prokoagulanttiaktiivisuutta, ne ovat virusvapaita, ne eivät ole alloimmunogeenisiä ja ovat pysyviä siten, että niitä voidaan valmistaa, lyofi-lisoida ja varastoida kaupallisina määrinä sopivissa as-20 tioissa.
Fsimerkki 1 ·♦· • · • · · ....: PF-3 (verihiutaletekijä-3) prokoagulanttiaktiivisuus mää- 25 ritettiin Russel'in kyymyrkkyaikamäärityksellä, joka on * · · \\ trombiinin muodostumista kuvaava testi. Testin loppupiste « "*\ määritetään visuaalisesti fibrinogeenin hyytymisen avul- la, jota on läsnä ihmisen kootussa plasmanäytteessä.
♦ · ♦ ♦ ♦ ♦
30 CaCl2:n kantaliuosta (0,025 M imidatsolipuskurissa, pH
♦ 7,3) säilytettiin 37°C:ssa. Yhteenkoottua ihmisen plasmaa ja verihiutalemembraanimikropartikkelifraktioita liuok- X : sessa (25 /Ltg/ml saliinissa) säilytettiin huoneen lämpöti- ♦ · · lassa. Russel'in kyymyrkkyä (RW; 10 Mg/ml saliinissa; • « *1* 35 Wellcome Diagnostics, Dartford, Englanti) pidettiin jäi- ; V den päällä.
ψ · • · · • · · • · 19 107702 Määritys aloitettiin sekoittamalla ja inkuboimalla 0,1 ml kutakin koottua plasmaa ja verihiutalemembraanimikropar-tikkeleita sisältävää liuosta borosilikaattilasiputkessa (12x75 mm) 37°C:ssa 5-10 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin 5 RW-liuosta (0,1 ml) ja inkuboitiin vielä 30 sekunnin ajan 37°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 0,1 ml CaCl2-liuos-ta. Aika CaCl2-liuoksen lisäämisen ja fibriinin hyytymisen välillä määritettiin. Määrityssysteemin avulla muodostetun trombiinin yksikkö laskettiin trombiinin hyytymisajan 10 standardikäyrältä (kuvio 1), käyttäen puhdasta naudan trombiinia (Sigma 850-1; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja koottua ihmisen plasmaa.
Lämpökäsittelyn vaikutus ja sonikoinnin vaikutus pro- 15 koagulanttiaktiivisuuteen (PF-3), käyttäen Russel'in kyy- myrkkyaikaa, 5, testattiin. Kuten kuviossa 2 on kuvattu, lämpökäsittelystä, jota seurasi sonikointi, oli tuloksena verihiutalemembraanimikropartikkelifraktio, jossa säilyi olennainen määrä sen prokoagulanttiaktiivisuutta. Kuiten- 20 kin, kun sonikointi edelsi lämpökäsittelyä (ei esillä), verihiuta 1 emembraanimikropartikke 1 ifraktion prokoagulant- tiaktiivisuus muuttui voimakkaasti, prokoagulanttiaktii- ···. visuuden vähetessä 50 %.
• · · »···» . , 25 Esimerkki 2 • · · • · · • · • · ··.! Verihiutalemikropartikkeleista testattiin niiden kyky hillitä verenvuotoa vasta-aineindusoiduissa trombosyto- M· V· penisissä eläimissä. Anti-kani verihiutaleantiseerumia 30 käytettiin trombosytopenian indusoimiseksi kaneissa. Ve- ·;··· rihiutaleiden lukumäärät ja vuotoaika määritettiin ensin 10:ssä normaalissa kanissa (ruumiinpaino 3,53±0,41 kg; .· . verihiutalemäärä, 548 000±97 000/μ1; vuotoaika, 153±47 * · « • '· sek; keskiarvo±SP). Anti-kani verihiutaleantiseerumia • · *·..* 35 saatiin kaupallisesta lähteestä, annettiin sen jälkeen ·*·*: laskimonsisäisesti 10:een kaniin annoksena 0,2-0,4 ml • € antiseerumia ruumiinpainokiloa kohti. Kahden tunnin koh- • · 20 107702 dalla antiseerumi-injektion jälkeen, eriasteista trom-bosytopeniaa oli läsnä kaikissa eläimissä. Tulokset ryhmitettiin "indusoidun trombosytopenia"-asteen perusteella: RYHMÄ lf verihiutalemäärä alle 80 OOO/μΙ; RYHMÄ 2 f 5 verihiutalemäärä välillä 100 000 - 200 000/μ1 ja RYHMÄ 3 r verihiutalemäärä yli 200 000/μ1 (kuvio 3).
Vuotoajan pidentäminen indusoitiin myös kaikissa 10:ssä antiseerumilla käsitellyssä kanissa (mitattu kahden tun-10 nin kohdalla antiseerumi-injektion jälkeen). Selvä pidentyminen tapahtui vain ryhmä-l:n eläimissä (voimakas trom-bosytopenia, < 75 000/μ1), ja kohtalainen pidentyminen havaittiin sekä ryhmä-2:n että ryhmä-3:n eläimissä (kuvio 3) .
15
Vasta vanhentuneista verihiutaleista valmistettuja veri-hiutalemikropartikkelifraktioita siirrettiin (2 mg prote-iinia/ruumiinpainokilo) ryhmä-l:n eläimiin, joissa oli voimakas trombosytopenia. Viitaten kuvioon 4, verihiuta-20 lemäärät, jotka oli saatu kahden tunnin kohdalla antiseerumi-injektion jälkeen, olivat 41 000, 73 000 ja 56 000/μ1 eläimille 1, 2 ja vastaavasti 3. Samalla aikaväli’: Iillä vuotoaika oli selvästi pidentynyt jokaisessa kol- ·;··· messa kanissa, erityisesti kanissa numero 2, jossa run- 25 sasta vuotoa koekohdasta jatkui 20 minuutin kohdalla ai- • 1 .:. kuviillon jälkeen, ja edellytti paikallispuristeen käyt- töä vuodon lopettamiseksi. Verihiutalemikropartikkelien • · saannin jälkeen, eläimissä 1 ja 3 esiintyi enenevää vuo- * toajan lyhenemistä, samalla kun spontaania vuodon esty-30 mistä esiintyi 20 minuutin sisällä kanissa numero 2, tar- * 1 vitsematta paikallispuristetta. Yleinen vuotoajan ly- * · · ’...· henemispyrkimys, keksinnön mukaisten verihiutalemikropar- tikkelien siirron jälkeen, osoitettiin siten kaikissa • · .···. saajaeläimissä.
• · • · · • 35 • I · • · · • · • · · • · · • · · ♦ · 21 107702
Esimerkki 3
Verihiutalemikropartikkeleista testattiin niiden kyky hillitä verenvuotoa doksorubisiinihydrokloridilla in-5 dusoiduissa trombosytopenisissä eläimissä. Doksoru- bisiinihydrokloridia (Adriamycin; 2 mg/kg ruumiinpainoa) annettiin laskimonsisäisesti yhdeksälle kanille trom-bosytopenian indusoimiseksi. Verihiutalemäärän perustaso (ennen doksorubisiinin injisoimista) oli 488 000194 10 000/μ1. Vuotoajan perustaso oli 128±21 sek. Yksi viikko doksorubisiini-injektion jälkeen verihiutalemäärä oli pudonnut tasoon 130 000±31 OOO/μΙ (p<0,01), vuotoajan kasvun ollessa 2,4-kertainen (311±89 sek; n=9) verrattuna trombosytopenisiin kontrolleihin (p<0,01).
15
Verihiutalemikropartikkelifraktioita (2 mg membraanipro-teiinia/kg ruumiinpainoa), jotka oli valmistettu vasta vanhentuneista verihiutaleista, tai saliinivalmisteita, siirrettiin doksorubisiinilla indusoituihin trombosyto-20 penisiin kaneihin. Hemostaattinen teho osoitettiin kaikissa eläimissä, jotka saivat prokoagulanttimembraaneja. Vuotoajan toistomittaukset 15 minuutin kohdalla, kahden ·:·. ja neljän tunnin kohdalla siirron jälkeen, osoittivat • · · [ merkittävää vuotoajan lyhenemistä trombosytopenisistä • · .. 25 kontrolleista (<0,01) (kuvio 5). Päinvastaisesti, merkit- • · * seviä eroavuuksia ei havaittu mittausten välillä, jotka • · · oli saatu ennen ja jälkeen saliini-infuusion trombosyto- * ' penisille kaneille.
• · · • · · • · · 30 Esimerkki Λ • · • ·’*·. Verihiutalemikropartikkelien tehokkuus verenvuodon hil- • · · .* . litsemisessä varmistettiin lisäksi annoksesta riippuvalla - vasteella, kun mikropartikkeleita annettiin voimakkaasti • · '···' 35 trombosytopenisille kaneille. Kaksi injektiota busulfaa- :*·*; nia (yhteensä 35 mg/kg ruumiinpainoa) annettiin ihonalai- • · sesti kaneille voimakkaan trombosytopenian tuottamiseksi • · 22 107702 (verihiutalemäärä alle 25 OOO/jnl) . Kolme eri annosta ve-rihiutalemikropartikkeleja (0,5 mg/kg ruumiinpainoa, 1,0 mg/kg ruumiinpainoa ja 2,0 mg/kg ruumiinpainoa) ja sa-liinikontrollivalmistetta siirrettiin voimakkaasti trom-5 bosytopenisiin kaneihin. Verihiutalemäärän perustaso, määritettynä siirtopäivänä kaikkiin eläimiin, oli luokkaa noin 15 000/μ1.
Viitaten kuvioon 6, verihiutalemikropartikkelien hemo-10 staattinen tehokkuus oli suoraan verrannollinen siirrettyyn annokseen. Saliinin siirtäminen voimakkaasti trom-bosytopenisiin kaneihin ei muuttanut vuotoaikaa. Toisaalta, pidentynyt vuotoaika voimakkaasti trombosytopenisissä kaneissa lyheni annoksesta riippuvalla tavalla, kun veri-15 hiutalemikropartikkeleita siirrettiin.
Edellä mainitut verensiirtokokeet trombosytopenisillä kaneilla osoittavat keksinnön mukaisen verihiutalemem-braanifragmenttivalmisteen hemostaattisen tehon.
20
Alaa tuntevien tulee ymmärtää, että erilaisia muutoksia ja muunnelmia suoritusmuotoihin, joita on esitetty piir-·”: roksissa ja kuvailtu edellä, voidaan tehdä keksinnön ·:··· puitteissa. Sen vuoksi on tarkoitettu, että kaikki asia, 25 joka sisältyy edelliseen kuvaukseen ja on esitettynä • · oheisissa piirroksissa, tulee tulkita valaisevina eikä rajoittavassa mielessä.
• * • · · • · · • · · • · »*· • · * • · · • · • · · • · · • · «·· • · * · • « · ·· · ♦ · · • · ♦ · • · · ♦ ·· • · 23 107702
Viitejulkaisut 1) Klein, E., Farber, S., Djersasi, I., Toch, R., Freeman, G., Arnold, P., "The Preparation and Clinical Administration of Lyophilized Platelet Material to Children 5 with Acute Leukemia and Aplastic Anemia", J. Pediatrics, A2.J517, 1956.
2) Hjort, P., Perman, V., and Cronkite, E., "Fresh, Disintegrated Platelets and Radiation Thrombocytopenia: 10 Correction of Prothrombin Consumption without Correction of Bleeding".
3) McGill, M., Fugman, D., Vittorio, N., and Darrow, C., "Platelet Membrane Vesicles Reduced Microvascular Blee- 15 ding Times in Thrombocytopenic Rabbits", J. Lab. Clin.
Med., 109:127-133, 1987.
« 4) Wu, V-Y., McCoy, L.E., "Platelet Factor 3: Quantitation and Characterization", Thromb. Res., 11:581-593, 1977.
20 5) Spaet, T.H., Cintron, J., "Studies on Platelet Factor-3 Availability", Brit. J. Hamematol, 11:269, 1965.
··· • · • · · • · • · • · 1 • · • · · ·♦1« • · • ·1 • 1 · • · · ♦ · ··· • · ♦ · · • · • · · • ·· ^ · · • · · ♦ · • · • ♦ · « ·· I • · · • · ♦ · · • » · • · • m
Claims (10)
107702
1. Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi, tunnettu siitä, että lämpökäsitellään valmistetta, 5 joka sisältää verihiutaleita tai verihiutalemembraanif-ragmentteja, joissa on prokoagulanttiaktiivisuutta, siten, että kaikki mainitun valmisteen sisältämät virukset inaktivoituvat, ja mahdollisesti (i) mainitusta valmisteesta muodostuu ei-alloimmunogeeninen, ja/tai (ii) GP 10 Ilb/IIIa-kompleksit eliminoituvat olennaisesti mainitusta valmisteesta, ja eristetään käsitelty verihiutalemem-braanifraktio.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 lisäksi siitä, että se käsittää mainitun valmisteen homo-genoinnin verihiutalemembraanimikropartikkelien muodostamiseksi, jotka eivät sisällä olennaisesti verihiutalehaa-muja.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu li säksi siitä, että se käsittää mainitun valmisteen soni- ... koinnin mainitun lämpökäsittelyn jälkeen. • · • · ·
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu li- • · ;.v 25 säksi siitä, että se käsittää lisäksi mainitun valmisteen lyof ilisoinnin. • ·
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vanhentuneita verihiutaleita tai ,...: 30 niiden membraanifragmentteja lähtöaineena. • · · • · *** 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu li- säksi siitä, että käytetään yhteenkoottuja vanhentuneita • # · verihiutaleita tai niiden membraanifragmentteja lähtöai- :v. 35 neena. • » • i • ♦ · • ·
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu li- 107702 säksi siitä, että lyofilisoidaan mainittu membraanifrag-menttituote.
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu li-5 säksi siitä, että homogenoidaan mainittuja vanhentuneita verihiutaleita tai niiden membraanifragmentteja veri-hiutalemembraanimikropartikkelien muodostamiseksi, jotka eivät olennaisesti sisällä verihiutalehaamuja.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuumennetaan valmistetta, joka sisältää verihiutaleita tai niiden membraanifragmentteja, sonikoidaan mainittua lämpökäsiteltyä valmistetta mikro-partikkelien muodostamiseksi, ja erotetaan kaikki maini-15 tun mikropartikkelifraktion kuumentamisen seurauksena muodostunut saostuma.
10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpökäsittely saa aikaan sen, että 20 mainittu valmiste ei ole antigeeninen ryhmän I HLA-deter-minanttien suhteen. • · · • · • · · • · • · • · 1 i · Φ • · • · « ··1· • · • · · » · · I · · • · • · · • · * · · „ · • · • · · • · • · , ··· • · · • · · • · # · · · • · • · ·«· 107702
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/337,916 US5185160A (en) | 1984-06-21 | 1989-04-14 | Platelet membrane microvesicles |
US33791689 | 1989-04-14 | ||
PCT/US1990/001989 WO1990012581A1 (en) | 1989-04-14 | 1990-04-12 | Platelet membrane microparticles |
US9001989 | 1990-04-12 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI914819A0 FI914819A0 (fi) | 1991-10-11 |
FI107702B true FI107702B (fi) | 2001-09-28 |
Family
ID=23322568
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI914819A FI107702B (fi) | 1989-04-14 | 1991-10-11 | Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5185160A (fi) |
EP (2) | EP0467991B1 (fi) |
JP (1) | JP2972329B2 (fi) |
KR (1) | KR0162094B1 (fi) |
AT (1) | ATE169501T1 (fi) |
AU (2) | AU649398B2 (fi) |
CA (1) | CA2051659C (fi) |
DE (1) | DE69032559T2 (fi) |
DK (1) | DK0467991T3 (fi) |
ES (1) | ES2118721T3 (fi) |
FI (1) | FI107702B (fi) |
GR (1) | GR1001172B (fi) |
HU (1) | HU214884B (fi) |
IE (1) | IE990035A1 (fi) |
NO (1) | NO306761B1 (fi) |
WO (1) | WO1990012581A1 (fi) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5428008A (en) * | 1989-04-14 | 1995-06-27 | Prp, Inc. | Therapeutic composition of micellar structures capable of promoting hemotasis |
US5332578A (en) * | 1989-04-14 | 1994-07-26 | Prp, Inc. | Platelet membrane microparticles |
US6187572B1 (en) | 1990-04-16 | 2001-02-13 | Baxter International Inc. | Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants |
US5358844A (en) * | 1993-02-18 | 1994-10-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Preservation of blood platelets |
US5462752A (en) * | 1994-07-28 | 1995-10-31 | Prp, Inc. | Inhibition of platelet binding |
AT407484B (de) * | 1997-11-12 | 2001-03-26 | Bio Prod & Bio Eng Ag | Arzneimittel zur förderung der wundheilung |
DK1351697T3 (da) * | 2001-01-18 | 2014-01-20 | Georg Watzek | Lægemiddel til fremme af regenerationen af væv |
US20050191286A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-09-01 | Gandy James B. | Lyophilized platelet rich plasma for the use in wound healing (chronic or acute) and bone or tissue grafts or repair |
US20060142198A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-06-29 | Wound Care Partners Llc | Compositions for treating wounds and processes for their preparation |
US20060004189A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-01-05 | James Gandy | Compositions for treating wounds and processes for their preparation |
WO2006060779A2 (en) * | 2004-12-03 | 2006-06-08 | Case Western Reserve University | Novel methods, compositions and devices for inducing neovascularization |
DE102006045550A1 (de) | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Herstellung von agglutionationsfähigen Thrombozytenfragmenten und deren Verwendung |
EP2334785B2 (en) | 2008-09-16 | 2019-08-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Compositions containing platelet contents |
US11891620B2 (en) | 2014-05-16 | 2024-02-06 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Cell culture media compositions for primary cells |
WO2016141325A1 (en) | 2015-03-04 | 2016-09-09 | University Of Rochester | Systemic and topical application of platelet microparticles to treat bleeding in trauma patients |
US10596123B2 (en) * | 2015-03-11 | 2020-03-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Exosome delivery technology |
WO2016205144A1 (en) * | 2015-06-14 | 2016-12-22 | Bluecircle Therapeutics, Inc. | Compositions of platelet-derived theranostics and uses thereof |
EP3886879A4 (en) | 2018-11-30 | 2022-12-07 | Cellphire Inc. | PLATES AS DELIVERY AGENTS |
US20200224164A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-07-16 | Cellphire, Inc. | Platelets as delivery agents |
WO2020227149A1 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Cellphire, Inc. | Materials and methods for producing blood products |
EP4013496A4 (en) | 2019-08-16 | 2023-10-18 | Cellphire Inc. | THROMBOSOMES AS AN ANTI-PLATELET DEACTIVATING AGENT |
WO2021158622A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Cellphire, Inc. | Anti-fibrinolytic loaded platelets |
WO2021232015A1 (en) * | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Cellphire, Inc. | Platelet derived extracellular vesicles |
CN117643621B (zh) * | 2023-10-27 | 2024-07-02 | 江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院) | 一种溶栓药PLT-r-SAK及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4994438A (en) * | 1981-11-02 | 1991-02-19 | Cedars Sinai Medical Center | Heat treatment of lyophilized plasma fractions |
US4456590B2 (en) * | 1981-11-02 | 1989-05-30 | Heat treatment of lyphilized blood clotting factor viii concentrate | |
US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
US4760131A (en) * | 1986-04-23 | 1988-07-26 | Collagen Corporation | Wound-healing composition |
US4764463A (en) * | 1986-10-30 | 1988-08-16 | The University Of Tennessee Research Corporation | Platelet cyropreservation |
US4753797A (en) * | 1987-06-24 | 1988-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Enhancing platelet morphology prior to patient use |
-
1989
- 1989-04-14 US US07/337,916 patent/US5185160A/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-04-12 EP EP90908046A patent/EP0467991B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-12 WO PCT/US1990/001989 patent/WO1990012581A1/en active IP Right Grant
- 1990-04-12 IE IE19990035A patent/IE990035A1/en unknown
- 1990-04-12 HU HU374/90A patent/HU214884B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-04-12 ES ES90908046T patent/ES2118721T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-12 JP JP2506787A patent/JP2972329B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-12 EP EP97113637A patent/EP0815866A3/en not_active Ceased
- 1990-04-12 DK DK90908046T patent/DK0467991T3/da active
- 1990-04-12 CA CA002051659A patent/CA2051659C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-12 DE DE69032559T patent/DE69032559T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-12 AU AU55388/90A patent/AU649398B2/en not_active Ceased
- 1990-04-12 AT AT90908046T patent/ATE169501T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-12 KR KR1019910701331A patent/KR0162094B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-04-17 GR GR900100286A patent/GR1001172B/el unknown
-
1991
- 1991-10-11 FI FI914819A patent/FI107702B/fi active
- 1991-10-14 NO NO914024A patent/NO306761B1/no not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-07-15 AU AU41950/93A patent/AU652317B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5185160A (en) | 1993-02-09 |
WO1990012581A1 (en) | 1990-11-01 |
ATE169501T1 (de) | 1998-08-15 |
EP0467991A1 (en) | 1992-01-29 |
ES2118721T3 (es) | 1998-10-01 |
HU214884B (hu) | 2000-03-28 |
DE69032559D1 (de) | 1998-09-17 |
DE69032559T2 (de) | 1999-01-07 |
NO306761B1 (no) | 1999-12-20 |
NO914024D0 (no) | 1991-10-14 |
HUT61200A (en) | 1992-12-28 |
AU4195093A (en) | 1993-10-07 |
AU649398B2 (en) | 1994-05-26 |
KR920700661A (ko) | 1992-08-10 |
FI914819A0 (fi) | 1991-10-11 |
JPH04506451A (ja) | 1992-11-12 |
KR0162094B1 (ko) | 1998-12-01 |
DK0467991T3 (da) | 1999-02-01 |
AU5538890A (en) | 1990-11-16 |
EP0815866A3 (en) | 1998-08-12 |
EP0467991A4 (en) | 1993-01-07 |
CA2051659A1 (en) | 1990-10-15 |
AU652317B2 (en) | 1994-08-18 |
GR900100286A (en) | 1991-09-27 |
JP2972329B2 (ja) | 1999-11-08 |
IE990035A1 (en) | 2000-11-01 |
NO914024L (no) | 1991-10-14 |
EP0467991B1 (en) | 1998-08-12 |
GR1001172B (el) | 1993-06-07 |
HU903374D0 (en) | 1991-12-30 |
EP0815866A2 (en) | 1998-01-07 |
CA2051659C (en) | 2001-08-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI107702B (fi) | Menetelmä verihiutalemembraanifraktion valmistamiseksi | |
US5578565A (en) | Reconstituted platelet membrane vesicles | |
US5332578A (en) | Platelet membrane microparticles | |
JP5204490B2 (ja) | 出血の制御及び出血性疾患の治療のための止血剤としての細胞由来微粒子 | |
EP1338648B1 (en) | Pharmaceutically acceptable fixed-dried human blood platelets | |
Chao et al. | Infusible platelet membrane microvesicles: a potential transfusion substitute for platelets | |
US7901674B2 (en) | Aldehyde-fixed platelets with internalized paramagnetic or magnetic nanoparticles | |
US5462752A (en) | Inhibition of platelet binding | |
JPH03503170A (ja) | ウィルス不活性化血液製剤および方法 | |
JPH09110715A (ja) | 血液凝固疾患を治療するための医薬組成物とその製造法 | |
JP4938454B2 (ja) | 止血を促進するためのフィブリノゲン標的微粒子 | |
Lee et al. | Novel treatment modalities: new platelet preparations and subsititutes. | |
JP2021506931A (ja) | 病原体減少血小板組成物および関連方法 | |
US20180369346A1 (en) | Methods, compositions and kits for reducing tissue adhesions | |
US20110251127A1 (en) | Inactivation of infectious agents in plasma proteins by extreme pressure | |
HU211345A9 (hu) | Vérlemezke-membrán mikrorészecskék Az átmeneti oltalom az 1-14. igénypontokra vonatkozik. | |
Monteleone et al. | Anti-D immunoglobulin in children with newly diagnosed immune thrombocytopenic purpura: a pilot study | |
Borzini et al. | In co nclusio n, quantitative, mo rpho lo gic and func-tional data, particularly when measured in vitro as PFA-PI using an ADP cartridge, showed that TC-cry-o preserved platelets are at least as go od as, and po s-sibly superio r to, DMSO-cryo preserved platelets. | |
JPWO2002028416A1 (ja) | 溶血性貧血の予防・治療剤 |