KR0162094B1 - 혈소판 막 미립자 - Google Patents

Abstract

열-처리하여 바이러스-불활성화시킨 혈소판 막 미립자 분획물을 제공한다. 이 미립자는 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조할 수 있다. 미립자 분획물은 실질적으로 동종항원 및 GP IIb/IIIa 복합체가 없는 것으로 수혈에 있어서의 제약학상 제제로 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

혈소판 막 미립자

[발명의 분야]

본 발명은 일반적으로 의약 분야에 관한 것으로 보다 상세하게는 출혈을 억제하기 위한 수혈용 혈소판 막 미립자 제제에 관한 것이다.

[발명의 배경]

정상 성인의 인체는 약 60%의 유체(혈장) 및 40%의 유형 요소 (적혈수: 백혈구; 및 혈소판)로 이루어진 혈액 4.0 내지 5.5 리터를 함유한다. 정상적인 생리학적 상태 하에서, 혈소판의 주기능은 출혈을 예방하는 것이다.

혈소판은 골수에서 거핵구라 불리우는 전구 세포로부터 형성되고 순환하면서 8 내지 10일의 수명을 갖는다. 이렇게 짧은 수명으로 인해, 화학요법을 받는 암환제에서와 같이 골수의 혈소판 생성 능력이 저하되는 경우 혈소판 결핍이 신속히 발생한다. 혈소판 결핍은 또한 여러 가지 질환의 결과로서, 예를 들면 혈소판 표면의 당단백질 또는 기타 혈소판 표면 항원에 대해 생체 내에서 항체가 형성되었을 때 발생할 수 있다. 이러한 혈소판의 결핍 또는 파괴의 결과 순환하는 혈소판의 양이 불충분하게(혈소판감소증이라 불리우는 상태) 되고 억제되지 않는 출혈을 야기시킬 수 있다. 혈소판 결핍은 예를 들면 순환하는 혈소판을 손상시키거나 파괴시키기 쉬운 체외 순환을 수반하는 수술로부터 야기될 수도 있다. 혈소판감소증의 임상적 처치는 전형적으로 신선한 무상(無傷) 혈소판의 수혈을 포함해왔다.

대사적으로 활성인 무상 혈소판만이 생체 내에서 출혈을 멈추게 하는 작용을 할 수 있다고 간주되고 있다. 결과적으로, 수혈 치료는 높은 질의 신선한 생존 혈소판의 조달에 의존해왔다. 수혈용 혈소판은 전형적으로 (a) 신선하게 공여된 혈액 유니트로부터 (이 경우는 무작위-공혈자 혈소판이라 칭함) 또는 (b) 혈액 분리에 의해 단일 공혈자로부터 ( 이 경우는 단일-공혈자 혈소판이라 칭함) 제조된다. 이들 수혈 제품은 시선한 농축 무상 혈소판의 혈장 현탄택이다.

현행 혈소판 수혈의 주요한 결점은 무상 혈소판의 3 내지 5일이라는 짧은 저장 수명이다. 병원, 혈액 은행 등에 의해 수집된 많은 혈소판 유니트들이 불행하게도 기간 경과로 인해 폐기된다. 이들의 짧은 저장 수명 때문에 혈소판 유니트의 재고를 다량 유지하는 것이 매우 어렵다. 이 문제점은 군대, 민방위 및 재해본부와 같이 탈 중앙 집중화된 기구들과 관련해서 특히 결정적이다.

생존 무상 혈소판에 대한 몇몇 대체물로 임상적으로 및 동물 모델에서 수혈이 시도되었다. 1956년(1)에 동결건조시킨 혈소판의 임상적 투여에 따라 지혈이 달성되었다는 것이 보고되었는데, 이는 혈소판의 형태학적 완전성이 무상 혈소판의 생체 내 기능 중 적어도 일부를 보유하는데 있어서 필수적이지는 않다는 것을 의미한다. 동결건조시킨 혈소판 물질의 정맥 내 투여의 주요한 부작용은 주입부위에 환자가 동결건조시킨 물질 중의 높은 세로토닌 함량에 의해 야기되는 혈관 때문인 것으로 생각되는 심한 통증을 느낀다는 것이다. 앞의 결과와는 대조적으로, 1959년(2)에 초음파-붕괴시킨 신선한 전 혈소판 제재가 혈소판감소증을 앓는 개의 임파액 중의 적혈구의 수를 감소시키지 못했다는 것이 보고 되었다.

보다 최근에, 맥길(McGill) 등 (3)은 혈소판 막 농축물의 수혈이 혈소판감소증을 앓는 토끼의 출혈 단축시킨다는 것을 보고하였다. 이 농축물은 미토콘드리아 및 표면-연결 계의 잔류물을 함유하는 정상 혈소판 크기의 환영 혈소판을 포함하였다. 맥길의 농축물은 (1) 토끼의 전혈을 원심분리하여 신선한 혈소판을 펠렛화시키고, (2) -65℃에서 펠렛을 동결시키고, (3) 펠렛을 해동시킨 다음 2차 동결시켜 해동시키고, (4) 휑궈서 펠렛을 혈소판이 없는 혈장 중에 재현탁시켜 제조하였다.

앞의 혈소판 막 분획물을 제조하는데 있어서 약 4℃ 이하의 온도 상태를 유지하였다. 생물학적 제제가 더 높은 온도에 노출되었을 때 통상적으로 매우 짧은 기간 내에 활성이 소실되기 때문에 생물학적 제제로 작업할 때에는 이 온도가 표준이다. 예를 들면, 효소와 같은 단백질은 약 60℃로의가열에 의해 불활성화될 수 있다. 활성은 4℃에서도 손실될 수 있다. 예를 들면, 부분적으로 정제된 혈소판 인자 3 (PF-3)은 4℃에서 저장하였을 때 5일 후에 그의 응괴 활성을 대부분 잃어버린다는 것이 보고되었다(4). (PF-3은 트롬빈 생성을 촉진시키는 촉매 표면을 제공하는 혈소판 막 복합체와 관련있는 것 같다). 이러한 활성의 소실은 혈소판 분획물의 제약학적 제제로서의 용도를 고려할 때 큰 관심사이다.

인체 내에 사용하기 위한 혈소판 분획물을 제조할 때, 무균 상태를 사용해야 하는 것은 당연할 일이다. 전혈 수혈과 마찬가지로, 공여된 혈소판 유니트의 사용은 수혈자를 AIDS, 간염 및 기타 수혈관련 질환과 같은 질환의 전염이라는 위험에 노출시키게 된다. 또 다른 위험은 여러회 수혈 후, 수혈자/환자가 공여된 혈소판에 대한 항체를 발현(동종면역화로 알려진 상태)시킬 수도 있다는 것이다.

이러한 항체는 수혈된 혈소판을 급속히 파괴시킬 수 있다. 또한, 저장된 혈소판의 세균 오염은 수혈에 있어서 심각한 위험이다.

[발명의 요약]

본 발명은 신규 방법에 따라 혈소판 막으로부터 유래되는 제약 및 생성물을 제공한다. 이 생성물에는 응혈촉진 활성을 가지고 출혈을 억제하기 위한 전혈소판의 수혈 대체물로서, 국소적으로 상처 치료를 촉진시키기 위해 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 진단 시약으로 사용될 수 있는 혈소판 막 단편 제제가 포함된다.

본 발명의 한 면에 따르면, 이 혈소판 막 단편 제제에는 활성 바이러스가 없다. 이 제제를 제조하기 위한 바람직한 방법은 바이러스 오염 및 세균 오염을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 혈소판 막 단편 제제를 열-처리시키는 것이다.

제제는 비록 열-처리되었다 할지라도 놀랍게도 그의 응혈촉진 및 지혈 특성을 보유한다. 게다가, 열-처리된 막 단편은 기대한 것보다 훨씬 더 안정하다. 제제는 적어도 6개월 동안 응혈촉진 활성의 상당한 손실 없이(90% 이상 보유됨) 적어도 8주 동안 4℃에서 용액으로 저장할 수 있다. 이 제제는 심지어 동결건주 후에도 이 활성(90% 이상)을 보유한다. 또한 동결건조 및 6개월 동안의 저장 후에도 단백질 및 인지질 함량은 변하지 않는다.

본 발명의 다른 면에 따르면, 상기 제제는 비면역원성이고, 특히 제Ⅰ류 HLA항원 결정기에 관해서는 비항원성이다. 따라서, 특정 수혈자에 대한 이 제제의 적합성은 공혈자의 유전적 특성에 의해 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 면에 따르면, 응혈촉진 활성을 가지고 출혈을 억제할 수 있는 혈소판 막 단편 제제는 GP IIb/IIIa 복합체가 거의 없다. 이것은 GP IIb/IIIa 복합체가 지혈에곤련되어 있고 필수적이라는, 폭넓게 지지되어 왔던 관념의 면에서 볼 때 놀라운 것이다.

혈소판 막 단편 제제는 바람직하게는 환영 혈소판이 실질적으로 없는 것이고 비교적 균질한 미립자들을 함유한다. 바람직하게는, 적어도 80%의 미립자들은 600nm이하의 직경을 가지고, 적어도 95%의 미립자들은 1 미크론 이하의 직경을 갖는다. 가장 바람직하게는, 이 미세 세포는 약 300 내지 400nm의 평균직경을 갖는다. 이러한 미립자들은 전형적인 환영 혈소판 크기의 약 1/5 내지 1/7이다.

바람직한 제제는 사실상 세로토닌을 함우하지 않고(혈소판 용해질 중에 발견되는 것의 0.02%이하), 따라서 선행 기술의 일부 제제를 수혈에 사용할 때 나타나는 특성인 호흡 및 혈관 장해가 없다. 이 제제에서는 또한 세포질 효소 마커인 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 호라성이 검출되지 않으며, 실질적으로 인자 V, VIII, IX 및 X이 없다. 한 실시태양에서 미립자 분획물은 3 중량% 탄수화물, 30 중량%, 인지질, 50 중량% 단백질 및 9 중량% 콜레스테롤을 가지며 단백질 대 인지질의 비는 1.97±.010 (평균 ± 표준 편차, n=7)이다.

놀랍게도, 본 발명의 혈소판 막 단편 제제는 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조할 수 있다. 전형적으로, 병원 등에서는 수혈을 위해 혈소판을 실온에서 3 내지 5일 동안 저장한다. 이 후에는, 혈소판은 사용할 수 없는 것으로 간주되어 기간이 경과한 혈소판으로 폐기된다. 본 발명의 제약학적 제제 및 진단 시약은 이러한 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 전적으로 또는 부분적으로 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조된 수혈용 혈소판 막 분획물을 제공함으로써 지금까지 소용없는 것으로 버려졌던 막대한 양의 혈소판을 이용할 수 있다는 잇점을 갖는다.

본 발명의 혈소판 유래 생성물의 제조 방법도 또한 제공된다. 본 발명의 한 면에서는, 프로트롬빈제 활성을 가진 혈소판 또는 혈소판 막 단편을 함유하는 제제를, 이 제제 중에 함유된 바이러스를 불활성시키기에 충붕한 조건 하에서 처리시킨다. 바람직하게는, 제제를 열처리시킨다. 이 제제를 또한 바람직하게는 초음파처리로 균질화시켜 실질적으로 환영 혈소판이 없는 혈소판 막 미립자를 형성시킬 수 있다. 제제는 또한 표면 당단백질 복합체인 모든 GP IIb/IIIa를 실질적으로 제거하기 위해 처리할 수 있다.

본 발명은 또한 출발 물질로서 기간이 경과한 혈소판 또는 이의 막 단편을 이용하는 혈소판 유래 생성물의 제조 방법을 제공한다. 기간이 경과한 혈소판은 단일 공혈원의 것이거나 다수 공여원으로부터 모아진 것일 수 있다. 이 방법은 또한 바이러스를 불활화시키는 처리, 미립자들을 형성시키는 처리 및 GP IIb/IIIa를 실질적으로 제거하기 위해 처리를 포함할 수 있다.

본 발명의 생성물을 제조하기 위한 가장 바람직한 방법은 주로 환영 혈소판 및 용해질을 얻기 위해 혈소판을 반복해서 동결-해동시키고 세척하는 것이다. 이어서 환영 혈소판을 용해질로부터 분리시키고 용액 중에 현탁시켜 현탁액을 형성시킨다. 이어서 환영 혈소판을 함유하는 현탁액을 바이러스 오염물을 불황성화시키기 위해 적어도 2시간 동안 60℃ 이상으로 가열한다. 열 처리는 또한 침전물을 형성시킨다. 그러나, 침전물은 상당한 양의 목적 활성을 함유하기 때문에 이 때에 제거하지 않는다. 대신, 침전물을 포함하는 현탁액을 먼저 바람직하게는 초음파처리로 균질화시킨 다음 침전물을 현탁액으로부터 분리시킨다. 이어서 현탁액을 저장하거나 또는 수혈에 사용한다.

본 발명의 혈소판 막 단편 제제는 출혈을 방지하기 위해 동물 또는 인체의 치료에 제약학적으로 유효한 양으로 사용할 수 있다. 수혈용 제제로 사용하는 경우, 무균 제제를 식염수 또는 혈장과 같은 임의의 생리적을 용인되는 용액중에 현탁시킬 수 있다. 이것은 단독으로 또는 전혈소판을 포함하여 기타 약제들과 함께 사용할 수 있다. 이 제제는 인공 혈액에 대한 이상적인 첨가제이다. 이 제제는 또한 출혈을 멈추게 하고 상처를 치료하기 위해 국소적으로 적용할 수 있다. 이러한 면에서 제제는 겔 또는 연고와 같은 제약상 허용되는 담체 중에 현탁시키거나 거즈와 같은 담체에 흡수시킬 수 있다. 이 제제는 또한 약물 전달용 담체로 사용하거나 또는 라벨링시켜 진단시약으로, 예를 들명 응혈의 위치를 추적하는 조영제로서 사용할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 트롬빈 응괴 시간에 대한 표준 곡선을 나타내는 그래프.

제2도는 PF-3 특이적 활성에 미치는 열 처리 효과를 나타내는 그래프.

제3도는 정상 혈소판의 토끼 및 혈소판감소증 토끼에서 혈소판 수 및 출혈 시간을 나타내는 그래프.

제4도는 독소루비신(doxorubicin) 염산염으로 유발된 혈소판감소증 동물에서 출혈 시간에 미치는 수혈된 혈소판 막 미립자의 효과를 나타내는 그래프.

제5도는 항체로 유발된 혈소판감소증 동물에 미치는 수혈된 혈소판 막 미립자의 효과를 나타내는 그래프.

제6도는 부설판으로 유발된 심한 혈소판감소증을 앓는 동물의 출혈 시간에 미치는 수혈된 혈소판 막 미립자의 투여량-의존 효과를 나타내는 그래프.

[바람직한 실시태양의 상세한 설명]

본 발명의 생성물은 전혈소판 또는 전혈소판의 막 유도체로부터 제조한다.

전혈소판은 신선하게 수집된 혈소판 또는 기간이 경과한 혈소판일 수 있다. 기간이 경과한 혈소판이란 약 4℃ 내지 실온 사이의 온도에서 3일 이상 저장된 혈소판을 의미한다. 기간이 경과한 혈소판은 지금까지의 관행에 따른면 수혈 물질로 사용하기에는 더 이상 적합하지 않기 때문에 버려졌던 것들이다. 혈소판 유도체란 혈소판 막 미세소포를 포함하여 혈소판 막 단편 또는 환영 혈소판과 같은 비-부상 혈소판을 의미한다.

본 발명의 생성물은 유효량으로 개체에 투입될 수 있다. 용어 개체란 적어도 부분적으로는 혈소판에 의해 매개되는 지혈 능력을 갖는 살아있는 유기체, 예를 들면, 인간, 개, 고양이, 말 등을 포함하려는 것이다. 유효량이란 생성물이 투여되는 특정 치료 또는 진단 목적을 달성할 수 있는 양이다. 수혈의 일반적인 경우, 유효량은 전혈소판을 수혈한 경우에 달성되는 것과 실질적으로 같은 수준으로 지혈 기능을 회복하도록 작용하는 양이다. 혈소판감소증을 앓는 개체의 경우, 유효량은 개체에 있어서 출혈 시간을 바람직하게는 위험하지 않는 수준으로, 가장 바람직하게는 정상인 개체와 같은 수준으로 감소시킬 수 있는 양이다.

유효량은 개별적 기준으로 결정될 수 있고 적어도 부분적으로는 개체의 크기, 치료할 증상의 심각성 및 원하는 결과를 기준으로 한다. 따라서, 유효량은 이러한 요소를 고려하고 일상적인 실험을 이용하여 당 업계의 보통의 숙련인에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 생성물은 활성 바이러스가 없도록 처리할 수 있다. 활성 바이러스가 없다는 것은 생성물이 예를 들면 HBV, NANBHV, OMV 또는 HIV와 같은 존재하는 바이러스를 모두 불활성화 시키거나 파괴시키기에 충분한 조건에 두어졌음을 말한다. 이러한 조건에는 항체, 에탄올, 자외선, 유기 용매-세제 및 페난트롤린 킬레이트제와 관련된 처리들이 포함된다. (Virus Inactivation in Plasma Producets., Ed. J. -J. Morgenthaler, Current Studies in Hemotology and Blood Transfusion, No. 56, Karger, N.Y. 1989 참조). 바이러스 불활성화의 바람직한 방법에는 바이러스를 불활성화시키거나 파괴시킬 수 있는 정도 및 기간 동안의 열 처리가 있다.

본 발명의 생성물은 또한 수혈되었을 때 그의 면역원성을 감소시키거나 또는 제거시키기 위해 처리될 수 있다. 본 발명의 생성물은 유리하게는 혼주한 혈소판으로부터 제조되는데, 이는 통상 대부분의 개체 내에 수혈되었을 때 항체 응답을 유도한다. 현재, 동종면역화는 반복적인 혈소판 수혈을 필요로 하는 혈소판감소증 환자의 관리에 있어서 어려운 문제점이다. 혈소판은 HLA-A 및 HLA-B 항원을 나타내는데 이들은 혈소판 막의 일부분이거나 또는 혈장으로부터 흡수된 것이다. HLA-A 및 HLA-B 데 대한 항체의 발현(이것이 혈소판 동종면역화의 주원인임)은 수혈되 혈소판의 빠른 파괴를 일으켜서 지혈에 미치는 수혈된 혈소판의 효과를 감소시킨다. 혈소판농축물 중의 백혈구(HLA 항원의 즉각적인 출처임)에 의한 오염은 또한 동종면역화의 전개에 기여할 수 있다.

본 발명의 바람직한 생성물은 비면역원성, 비동종면역원성 및 HLA 결정기(특히 제I류 HLA 결정기)에 대히 비항원성인 것이다. 여기서 비면역원성이란 수회의 수혈 후에 개체가 수혈된 생성물의 치료 효과를 방해할 수 있는 충분한 면역 응답을 일으키지 않는 것을 의미한다. 비동종면역원성은 동종면역원성 재원으로부터 제조한 물질의 수차례 수혈 후에 개체가 동종항원에 대한 검출가능한 면역응답을 나타내지 않는 것을 의미한다. 검출가능한이란 동종항원에 대한 혈청 항체가 도트 분석과 같은 통상의 기술을 사용하여 검출되지 않거나 또는 임의의 동종항원에 대한 면역 응답이 수혈된 생성물의 치료 효과를 방해할 수 있는 정도로 충분하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 생성물의 바람직한 제조 방법은 다음과 같다 : 신선하게 수집되어 저장된 (20 내지 25℃에서 1 내지 5일) 또는 기간이 경과한 (4℃에서 5일이상)혈소판 농축물(50-60ml/농축물)을 무균 혈장 이동 셋트(Fenwall 4C2243, Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois)를 통해 600ml 혈액 주머니(Fenwalltransfer pack unit, 4R2023, Fenwall Laboratories, 상동)에 혼주하였다. 각 주머니는 총 500-600ml의 혈소판 농축물(이후, 600ml 유니트)을 함유하였다.

600ml 유니트를 오염원인적혈구 및 백혈구를 제거하기 위해 22℃에서 11분 동안 1,000rpm에서 원심분리시켰다(PR 7000, International Equipment Company, Needham Heights, Massachusetts). 혈소판을 함유하는 상징액을 이어서 새로운 600ml 혈액 주머니로 옮기고 22℃에서 25분 동안 3,000rpm으로 원심분리시켜 혈장으로부터 혈소판을 분리시켰다. 혈소판이 없는 혈장을 압출시키고 얻어진 혈소판 펠렛 각각을 0.9% NaCl 용액 (생리 식염수) 20ml 중에 조심스럽게 재현탁시키고, 추가의 식염수로 최종 부피 100ml로 희석시킨 다음 300ml 혈액주머니 중에서 혼주하였다. (처음 3개의 600ml 유니트에 대응하여 주머니 당 100ml 샘플 3개), 재현탁시킨 혈소판을 22℃에서 20분 동안 3,000rpm으로 원심분리시켜 다시 펠렛화하였다. 상징액을 제거하고 혈소판 펠렛을 반복적 재현탁 및 원심분리에 의해 생리식염수로 2회 세척하였다.

세척한 혈소판을 생리 식염수(각 600ml 유니트 당 25ml)중에 최종적으로 재현탁시키고 반복적인 동결 (-80℃에서 6시간 이상) 및 해동 (25℃에서 1시간 이상)3회에 의해 붕괴시켰다. 동결 및 해동된 현탁액을 생리식염수(각 600ml 유니트 당 100ml)로 희석시키고 3,000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 혈소판 환영 펠렛을 수집하였다. 이 혈소판 환영 펠렛을 생리 식염수(각 600ml 유니트 당 100ml)중에 재현탁시키고 반복적 재현탁 및 원심분리로 2회 세척하였다.

혈소판 막을 붕괴시키고 혈소판 환영 분획물을 단리하기 위해 다른 방법을 사용할 수도있다. 예를들면, 혈소판을 글리세롤로 평형화시킨 다음 세포 외부의 글리세롤 농도를 재빨리 회석시켜 저장성(低張性)을 이용해 파괴시킬 수 있다. 이것은 혈소판의 외부 막을 가로질러 삼투압 구배를 형성시키는데 이것이 세포막을 파열시키게 된다. 또한, 많은 기타 화학 약품 (예컨대, NaCl)이 삼투 쇼크를 유도하여 혈소판을 붕괴시키도록 유사한 방법으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에 따르면 반복적인 동결 및 해동이 사용되었다.

세척된 환영 펠렛을 생리 식염수(각 600ml 유니트 당 40 내지 50ml)중에 재현탁시키고 수조 중에서 60℃로 20시간 동안 가열하였다. 별법으로는, 혈소판 환영 현탁액을 5분동안 100℃로 가열할 수 있다. 이들 조건을 모든 바이러스 오염물을 불활성화시키기에 충분한 것이다. 열-처리한 혈소판 환영 현탁액을 플로우 셀(flow cell) (모델명 800B, Heat System) 중의 1/2 디스럽터 호른(disruptor houn)을 사용하여 소니케이터(sonicator)(초음파 처리기 모델명 W-385, Heat Systems, Inc., Farmingdale, New York) 중에서 균질화시켰다. 혈소판 환영 현탁액을 주입하기 전에 소니케이터 기기를 먼저 질소로 씻어내었다. 현탁액을 48㎛의 2배 증폭을 생성시키기 위해 출력 조절을 4로 설정하고 20kHz에서 5분 43초 동안(2초 사이클, 1.4초 동안 작동, 0.6동안 정지) 펄스시켜 초음파처리하였다. 초음파처리된 제제를 이어서 22℃에서 30분 동안 30분 동안 3,000rpm에서 원심분리시켜 상징액 중에 잔류하는 형성된 혈소판 막 미립자로부터 침전된 물질을 분리시켰다. 상징액을 수거하고 질소 하에 4℃ -20℃ 또는 -80℃에서 밀봉된 용기 중에 저장하거나 또는 질소 하에 동결건조시켜 저장하였다. 다른 언급이 없는 한, 4℃에서 저장한 미립자들을 하기 절차에 사용하였다.

상기한 바와 같이 제조한 혈소판 미립자 분획물을 활성 바이러스가 없는 것이었다. 이것은 또한 혈소판 환영이 실질적으로 없는 것으로서 80% 이상의 미립자들이 직경 600nm 이하이고, 95% 이상은 1,000nm 이하이다. 7개의 상이한 제제에 대해 새롭게 기간이 경과한 혈소판(기간 경과 후 2주내)으로부터 제조한 미립자들의 평균 직경은 300 내지 400nm이었다. 7개의 제제들에 대한 평균 직경은 341nm이었다.

혈소판 미립자 분획물은 또한 세로토닌, GP IIb/IIIa(표면 당단백질), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 응고 인자, V, VIII, IX 및 X 및 트롬보스폰딘(알파 과립 성분)이 실질적으로 없는 것이다. 반대로, GPIb(다른 표면 당단백질)는 존재하고 베타-글루쿠로니다제(리소좀 마커) 또한 검출가능하였다. (용해질의 백분율로 약 25%). GP IIb/IIIa는 지혈에 필수적이라고 믿어져왔기 때문에 GP IIb/IIIa의 부재는 놀라운 것이다.

혈소판 미립자 분획물의 조성을 특정 성분에 대한 2가지 상이한 일련의 실험으로 결정하여 하기 표Ⅰ에 나타내었다 :

새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 바람직한 혈소판 미립자 분획물의 응혈촉진 활성을 PF-3 활성을 측정하는데 사용되는 러셀 살모사 독 시간(5)을 이용하여 결정하였다. 러셀 분석은 그 종말점이 피브리노겐 응괴로 결정될 수 있는 트롬빈 생성 시험이다. 특이적 활성은 트롬빈 표준 곡선과 비교하여 결정하였고, 혈소판 단백질 ㎎ 당 또 생성된 트롬빈의 유니트(U)로 표시할 수 있다. 제1 세트 실험에서 단백질 ㎎ 당 PF-3 특이적 활성(U/㎎)이 148.1±13.4(n=7)로 결정되었다. 제2 세트 실험에서는 이것이 175±8(n=8)이었다. 제1 세트 실험에서 인지질 ㎎ 당 PF-3 특이적 활성(U/㎎) 은 291.3±40.0이었다. 제2 세트 실험에서는 이것이 310±23이었다. 이러한 특이적 활성은 신선한 무성 전혈소판에 대한 활성을 훨씬 능가하였다. 이것은 무상 혈소판에서는 보통 노툴되지 않는 응혈촉진 막 단편의 방출에 기인하는 것이라 생각된다.

특이적 활성은 그의 약 60% 이상을 유지하기 위해서는 제제에 보호 물질을 첨가하는 것이 필요하긴 해도, 동결건조 후에도 유지되었다.(0.4gm/dl의 슈크로오스, 90%이상의 활성이 유지됨).

제제의 인지질 부분의 조성을 2가지 상이한 일련의 실험으로 결정하여 하기표Ⅱ에 나타내었다.

혈소판 미립자 분획물을 그들의 응혈촉진 활성 및 혈소판감소증 동물에서의 출혈을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 미립자 분획물의 응혈촉진 활성은 신선한 혈소판으로부터 제제된 것에 비할 만한 것으로 밝혀졌다. 신선한 혈소판 및 새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 분획물들은 전혈소판에 비할 만한 응혈촉진 활성을 가졌다. 이 분획물의 수혈은 모든 수혈 동물에 있어서 출혈 시간을 단축시켰다.

응혈촉진 활성에 미치는 열 처리 효과 및 초음파처리 효과를 또한 시험하였다. 새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 분획물들은 열 처리에 비하여 비교적 안정한 것으로 밝혀졌다. 이 혈소판 미립자 분획물의 응혈촉진 활성이 열처리에 앞서 균질화시켰을 때 크게 감소되는 것을 또한 발견하였다. 본 발명의 미립자 분획물의 상기 및 기타 성질들은 하기 실시예에서 보다 상세히 기술될 것이다.

상기한 절차에 따라 제조한 생성물 및 여러 가지 중간체들을 면역학적 도트분석으로 GP IIb/IIIa의 존재에 대해 시험하였다. GP IIb/IIIa는 무상 혈소판 제제, 혈소판 용해질, 혈소판 용해질로부터의 상징액 및 혈소판 막 환형 분획물 중에 존재하였다. 가열한 혈소판 막 환형 분획물 또는 최종 생성물 중에서는 검출 가능한 GP IIb/IIIa가 없었다.

최종 생성물 및 중간체들을 또한 면역학적 도트 분석으로 HLA 항원(제I류)의 존재에 대해 시험하였다. HLA 항원은 세척한 무상 혈소판 제제, 혈소판 용해질, 혈소판 용해질로부터의 상징액 및 혈소판 막 환형 분획물 중에 존재하였다. HLA 항원은 가열한 혈소판 막 환형 분획물 또는 최종 생성물 중에서는 검출할 수 없었다.

최종 생성물 및 중간체들을 또한 면역학적 도트 분석으로 GPIb의 존재에 대해 시험하였다. 열 처리된 것을 포함하여 시험한 모든 샐플링에서 GPIb가 존재하였다.

이제까지 설명한 바람직한 실시태양에 관한 것이었다. 그러나, 넓은 의미에서 본 발명은 이렇게 제한되지 않는다. 본 발명의 한 명은 바이러스 오염물을 제거하기 위해 열-처리한 혈소판 또는 혈소판 막 분획물을 제공하는 것이다. 이러 한 열처리는 일반적으로 바이러스 오감영물을 발활성화시키는 것으로 공지되어 있지만, 혈소판 제제와 관련하여 사용되지는 않았다. 따라서 본 발명은 수혈에 유용한, 바이러스를 불활성화시킨 혈소판 분획물을 처음으로 제공한다.

본 발명의 다른 면은 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조된 수혈 제제에 관한 것이다. 본 발명은 사상 처음으로 통상 버려졌던 기간이 경과한 막대한양의 혈소판을 수혈에 사용할 수 있도록 하였다. 게다가, 기간이 경과한 혈소판의 저장 동안의 바이러스 감염에 대한 가능성이 높기 때문에 본 발명의 열 처리 단계는 또한 이들이 바이러스-불활성화되었다는 것을 보장함으로써 기간이 경과한 혈소판을 유용하게 하는데 기여하였다.

본 발명은 또한 실질적으로 환영 혈소판이 없는 혈소판 미립자 분획물을 제조하는데 있어서 열-불활성화를 균질 단계와 결합하였다. 제제는 균질한 크기에 실질적으로 원하지 않는 세포질 물질이 없는 미립자들을 함유한다. 본 발명의 바람직한 방법에 따라 균질화(초음파처리)는 열-불활성화 단계에 이어 행하는데 이는 균질한 크기의 미립자를 생성시키고, 상당한 양의 활성이 열-불활성화 단계중에 형성된 임의의 침전물 중에 함유되는 것을 방지한다.

상기한 바와 같이 미립자 분획물은 단계적으로 제조할 수 있다. 먼저, 혈소판 막을 부분적으로 붕괴시켜 환영 혈소판 분획물 및 세포질 물질을 함유하는 용해질을 형성시켰다. 일단 혈소판 환영을 이 세포질 물질로부터 분리시킨 다음 환영 혈소판을 균질화시켜 실질적으로 환영 혈소판을이 없고 실질적으로 균일한 크기의 미립자를 함유하는 분획물을 형성시킨다. 그러나, 부분적 붕괴의 예비 단계는 전적으로 제거시킬 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 그러므로, 혈소판을 초음파처리시키고 형성된 미립자들을 용해질로부터 단리할 수도 있다.

본 발명은 혈소판막 미립자 분획물은 전혈소판과 비교하였을 때 실질적으로 비면역원성이므로 혈액군이 일치하는 여러 명의 공혈자로부터 수집하여 혼주한 혈소판으로부터 제조할 수 있다고 여겨진다. 모든 백혈구를 효과적으로 제거하는 포괄적인 세척 또한 제제의 비면역원성에 기여할 수 있다.

따라서 본 발명의 바람직한 생성물은 응혈촉진 활성을 가지고, 바이러스가 없으며, 비동종면역원성이고, 적합한 용기 중에서 상업적인 양으로 제조되고, 동결건조되어 저장될 수 있도록 안정한다.

[실시예 1]

PF-3(혈소판 인자-3) 응혈촉진 활성용 트롬빈 생성 시험인 러셀 살모사 독시간 측정으로 측정하였다. 시험의 종말점은 혼주한 인체 혈장 샘플 중에 존재하는 피브리노겐의 응괴로 가시적으로 결정된다.

CaCl원액(이미다졸 완충액 중의 0.025M, pH 7.3)을 37℃로 유지시켰다.

용액중의 혈소판 막 미립자 분획물(식염수 중의 25㎍/ml) 및 혼주한 인체 혈장을 실온에서 저장하였다. 러셀 살모사 독(RVV; 식염수 중의 10㎍/ml; Wellcome Diagnostics, Dartford, England)을 얼음 위에 두었다.

혼주한 혈장 및 혈소판 막 미립자 용액 각 0.1ml를 붕규산 유리 시험관(12x75㎜) 중 37℃에서 혼합하고 5 내지 10분 동안 배양시킴으로써 분석을 개시하였다. 이어서 RVV 용액(0.1ml)을 첨가하고 37℃에서 30초 동안 추가 배양시킨후 CaCl용액 0.1ml을 첨가하였다. CaCl용액의 첨가에 피브린 응괴가 감지되기까지의 시간을 측정하였다. 분석계에 의해 생성된 트롬빈 유니트를 정제한 소 트롬빈(Sigma 850-1; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 및 혼주한 인체 혈장을 사용한 트롬빈 응괴 시간의 표준 곡선(제1도)으로부터 계산하였다.

러셀 살모사 독 시간(5)를 사용하여 응혈촉진 활성(PF-3)에 미치는 열처리 효과 및 초음파처리 효과를 시험하였다. 제2도에 나타낸 바와 같이. 열처리에 이은 초음파처리는 상당량의 응혈촉진 활성을 보유한 혈소판 막 미립자 분획물을 생성시켰다. 그러나, 초음파처리를 열처리 앞에 행한 경우(나타내지 않았음). 혈소판 막 미립자 분획물의 응혈촉진 활성은 급격이 변하여 응혈촉진 활성이 50% 감소하였다.

[실시예 2]

혈소판 미립자를 항체로 유발된 혈소판감소증 동물에서 출혈을 억제하는 실험을 하였다. 항-토끼 혈소판 항혈청을 사용하여 토끼에 혈소판감소증을 유발시켰다. 혈소판 수 출혈 시간을 먼저 10마리의 정상 토끼에 대해 측정하였다(체중 3.53±0.41㎏; 혈소판 수 548,000±97,000μl; 출혈시간 153±47초; 평균±표준편차). 시판되는 항-토끼 혈소판 항혈청을 구입하여 체중㎏ 당 항혈청 0.2-0.4ml의 투여량으로 10마리의 토끼에 정맥내로 투여하였다. 항혈청 주입 2시간 후에 모든 동물에서 다양한 정도의 혈소판감소증이 나타났다. 데이터를 유발된 혈소판감소증의 정도에 따라 분류하였다 : 1군, 혈소판 수가 80,000μl 이하 ; 2군, 혈소판 수가 100,000 내지 200,000μl 사이; 및 3군, 혈소판 수가 200,000μl 이상(제3도)

항혈청-처리한 모든 10마리의 토끼에서 출혈 시간의 연장이 또한 유도되었다(항혈청 주입 후 2시간 뒤에 측정함). 두드러진 연장은 1군의 동물(심한 혈소판감소증, 75,000μl)에서만 나타났고, 2군 및 3군 동물에서는 약간의 연장이 관찰되었다(제3도)

새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 혈소판 미립자 분획물을 심한 혈소판감소증을 가진1군 동물에 수혈하였다.(2㎎ 단백질/㎏ 체중). 제4도를 참고로 하여, 항혈청 주입 2시간 후에얻은 혈소판 수는 동물 1,2 및 3의 경우 각각 41,000, 73,000 및 56,000μl이었다. 같은 기간에, 세 마리의 토끼 모두에서, 특히 2번 토끼에서 출혈 시간이 두드러지게 지속되었는데, 초기 절개 20분 뒤에도 시험 부위로부터 매우 많은 출혈이 지속되어 출혈을 멈추기 위해 국소 압박을 적용해야 했다. 혈소판 미립자를 수혈받은 후, 1번 및 3번 동물은 점진적인 출혈시간의 단축을 보여주었으며, 2번 토끼에서는 국소 압박 없이 20분 내에 출혈의 자발적 정지가 발행하였다. 따라서, 본 발명의 혈소판 미립자의 수혈 후의 출혈시간 단축의 일반적인 경향이 모든 수혈 동물에서 증명되었다.

[실시예 3]

혈소판 미립자를 독소루비신 염산염으로 유발된 혈소판감소증 동물에서의 출혈 억제 능력에 대해 시험하였다. 독소루비신 염산염(아드리아마이신 ; 2㎎/㎏체중)을 9마리의 쥐에 정맥내로 투여하여 혈소판감소증을 유발시켰다. 혈소판 수의 기저선(독소루비신 주입 전)은 488,000±94,000/μl이었다. 출현 시간의 기저선은 128±21 초이었다. 독소루비신 주입 1주일 후, 혈소판 수는 130,000±31,000/μl(p0.01)로 감소하였고 혈소판감소증 대조군(p0.01)에 대한 출혈 시간은 2.4배 증가하였다.(311±89초; n=9).

새롭게 기간이 경과한 혈소판으로부터 제조한 혈소판 미립자 분획물(2㎎ 막 단백질/㎏ 체중) 또는 식염수 제제를 독소루비신으로 유발된 혈소판감소증 토끼에 수혈하였다. 지혈 효능은 응혈촉진성 막을 수혈받은 모든 동물에서 나타났다. 수혈 후 15분, 2시간 및 시간에 반복 측정한 출혈 시간은 혈소판감소증 대조군(0.01)으로부터 출혈 시간의 상당한 단축을 나타내었다.(제5도). 반대로, 혈소판 감소증 토끼에 식염수를 주입하기 전 및 후에 얻은 측정치들 사이에는 뚜렷한 차이가 나타나지 않았다.

[실시예 4]

출혈을 억제하는에 있어서 본 발명의 혈소판 미립자의 효능은 이 미립자를 심한 혈소판감소증 토끼에 투여하였을 때의 투여량-의존 반응에 의해 또한 확인되었다. 부설판 2회 주사액(총 35㎎/㎏체중)을 토끼에 피하로 투여하여 심한 혈소판감소증(25,000/μl이하의 혈소판 수)을 일으켰다. 3가지 상이한 투여량의 혈소판 미립자 (0.5㎎/㎏ 체중, 1.0㎎/㎏ 체중 및 2.0㎎/㎏ 체중) 및 식염수 대조용 제제를 심한 혈소판감소증 토끼에 수혈하였다. 수혈한 날에 모든 동물에 대해 측정한 혈소판 수의 기저선은 약 15,000μl수준이었다.

제6도를 참조하면, 본 발명의 혈소판 미립자의 지혈 효능은 수혈된 투여량에 직접적으로 관련있다. 심한 혈소판감소증 토끼에 식염수를 수혈한 경우는 출혈시간을 변화시키지 않았다. 이와는 반대로, 심한 혈소판감소증 토끼의 연장된 출혈시간은 혈소판 미립자를 수혈하였을 때 투여량-의존 방식으로 단축되었다.

전술한 혈소판감소증 토끼에서의 수혈 연구는 본 발명의 혈소판 막 단편 제제의 지혈 효능을 증명한다.

당 업계의 숙력인들은 앞의 설명란 및 도면에 나타낸 실시태양에 대한 여러 가지 변화 및 변형이 본 발명의 영역 내에서 행해질 수 있다는 것을 알 수있을 것이다. 그러므로, 상기 설명란에 포함되고 수반되는 도면 중에 나타난 모든 사실은 제한하는 의미가 아닌 설명하려는 것으로 해석되어야 할 것이다.

[참고문헌]

1) Klein, E., Farber, S., Djersasi, I., Toch, R., Freeman, G., Arnold, P., The Preparation and Clinical Administration of Lyophilized Platelet Material to Children with Acute Leukemia and Aplastic Anemia, J. Pediatrics, 49:517, 1956.

2) Hjort, P., Perman, V., and Cronkite, E., Fresh, Disintegrated Platelets and Radiation Thrombocytopenia : Correction of Prothrombin Consumption without Correction of Bleeding.

3) McGill, M., Fugman, D., Vittorio, N., and Darrow, C., Platelet Membrane Vesicles Reduced Microvascular Bleeding Times in Thrombocytopenic Rabbits, J. Lab. Clin. Med , 109:127-133, 1987.

4) Wu, V-Y., McCoy, L. E., Platelet Factor 3: Quantitation and Characterization, Thromb. Res., 11:581-593, 1977.

5) Spaet, T.H., Cintron, J., Studies on Platelet Factor-3 Availability, Brit. J. Hamematol, 11:269, 1965.

Claims (24)

1. 단리된 혈소판 막 단편으로부터 제조되며, 활성 바이러스가 없고(없거나) 제Ⅰ류 HLA 결정기에 대해 비항원성이고(이거나) GP IIb/IIIa 복합체가 없는 것을 특징으로 하는 응혈촉진 활성을 가진 혈소판 막 단편 제제.
2. 제1항에 있어서, 환형 혈소판이 없는 혈소판 막 단편 제제.
3. 제1항에 있어서, 직경이 1 미크론보다 큰 소포가 없는 혈소판 막 단편 제제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 불활성화시키기 위해 제제 또는 제제의 중간체를 처리한 혈소판 막 단편 제제.
5. 제4항에 있어서, 상기 제제 또는 중간체를 열처리한 혈소판 막 단편 제제.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 함유하며, 약학적 유효량의 상기 혈소판 막 단편을 포함하는 혈소판 막 단편 제제.
7. 제4항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 함유하며, 약학적 유효량의 상기 혈소판 막 단편을 포함하는 혈소판 막 단편 제제.
8. 제5항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 함유하며, 약학적 유효량의 상기 혈소판 막 단편을 포함하는 혈소판 막 단편 제제.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판으로부터 제조한 혈소판 막 단편 제제.
10. 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판으로부터 제조되고, 단리되어 제약상 허용되는 담체와 결합된 것임을 특징으로 하는, 응혈 촉진 활성을 가진 혈소판 막 단편을 약학적 유효량으로 함유하는 제제.
11. 제10항에 있어서, 실온에서 3일 이상 저장된 혼주한(pppled) 혈소판으로부터 제조한 제제.
12. 응혈촉진 활성을 가진 단리한 혈소판 또는 혈소판 막 단편 제제를, 상기 제제에 함유된 모든 바이러스를 불활성화시키고(시키거나) 상기 제제가 제Ⅰ류 HLA 결정기에 대해 비항원성이 되도록 만들고(만들거나) 상기 제제로부터 GP IIb/IIIa 복합체가 모두 제거되도록 처리하는 것을 특징으로 하는 혈소판 유해 생성물의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 제제에 함유된 모든 바이러스를 불활성화시키기 위해 제제를 열처리하는 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 환영 혈소판이 없는 혈소판 막 미립자를 형성시키기 위해 상기 제제를 균질화시키는 것을 더 포함하는 방법.
15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 혈소판 유래 생성물을 동결건조시키는 것으로 이루어진 방법.
16. 제13항에 있어서, 상기 열처리 후 상기 제제를 초음파처리하는 것으로 이루어진 방법.
17. 제15항에 있어서, 초음파처리 후 상기 제제를 동결건조시키는 것을 더 포함하는 방법.
18. 제18항에 있어서, 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판 또는 그의 막 단편을 단리하고 출발물질로 사용하는 것을 특징으로 하는, 혈소판 유래 막 단편 생성물의 제조 방법.
19. 제18항에 있어서, 실온에서 3일 이상 저장된 혼주한 혈소판 또는 그의 막 단편을 출발물질로 사용하는 것을 특징으로 하는방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 막 단편 생성물을 동결건조시키는 것을 더 포함하는 방법.
21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판 또는 그의 막 단편을 함유한 제제를 그 제제에 함유된 모든 바이러스를 불활성화시키도록 처리하는 것을 더 포함하는 방법.
22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 환영 혈소판이 없는 혈소판 막 미립자를 형성시키기 위해 상기 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판 또는 그의 막 단편을 균질화시키는 것을 더 포함하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 바이러스를 상기 실온에서 3일 이상 저장된 혈소판 또는 그의 막 단편을 가열함으로써 불활성화시키는 방법.
24. 혈소판 또는 그의 막 단편을 함유하는 제제를 가열하는 단계, 상기 열-처리된 제제를 초음파처리하여 미립자를 형성시키는 단계, 및 가열 결과로 형성된 모든 침전물을 상기 미립자 분획물로부터 분리시키는 단계로 이루어진 혈소판 유해 생성물의 제조방법