JPH04506451A - 血小板膜微粒子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 血小板膜微粒子 技術分野 本発明は一般的には医薬の分野に関し、特に出血を制御するために輸血において 用いる血小板膜微粒子製剤に関する。

背景技術 正常成人の体は、約６０％の液体（血しょう）および４０％の形を持つ要素（赤 血球：白血球：および血小板）からなる４、０から５．５リツトルの血液を含ん でいる。正常な生理学的条件下、血小板の主たる機能は出血の防止である。

血小板は骨髄において巨核球と呼ばれる前駆細胞から形成され、血液循環におい て８から１０日の寿命を持っている。この短い寿命の結果、血小板を生成する骨 髄の能力が抑制された場合、例えば化学療法を受けているガン患者のごとくは、 血小板欠乏が急速に起こる。血小板欠乏はまた、各種の疾患、例えばインビボに おいて血小板表面積タンパク質に対する、または他の血小板表面抗原に対する抗 体が産生される場合の結果としても起こり得る。そのような血小板の涸渇または 破壊の結果として血液循環血小板の量が不十分となり（血小板減少症と呼ばれる 状態）、制御できない出血を起こす。血小板欠乏はまた例えば血液循環血小板を 損傷および破壊しがちな体外循環法を含む外科手術によっても住じる。血小板減 少症の臨床的管理としては典型的には新鮮で無傷の血小板の輸血が含まれている 。

代謝的に活性で無傷の血小板のみがインビボにおいて出血を止める機能があると 広く思われていた。その結果、輸血療法は高品質で新鮮で生存可能な血小板の獲 得に依存してきた。輸血のための血小板は典型的には、（ａ）ランダム提供者血 小板と呼ばれる新しく提供された血液ユニットから、または（ｂ）単−提供者血 小板と呼ばれる単一提供者からのフエレーシス（ｐｈｅｒｅｓｉｓ）によす調製 される。これらの輸血製剤は新鮮で濃縮された無傷の血小板の血しょう懸濁液で ある。

現在の血小板輸血の実施の主たる問題点は無傷の血小板の貯蔵寿命か短いことで ある（３から５日）。病院、血液銀行などで集められた多くの血小板ユニブトが 不幸にも期限切れのため捨てられている。その貯蔵寿命の短さのため、血小板ユ ニットの多量の在庫目録を維持するのか困難である。この問題点は軍隊、民間防 衛および災害活動の場合のごとき分散された運用に関して特に重大である。

無傷の生存可能な血小板のいくつかの代替物が臨床的におよび動物モデルにおい て試みられてきた。１９５６年（１）、凍結乾燥された血小板の臨床的投与によ り止血が達成された事が報告されており、血小板の形態的完全性は無傷の血小板 のインビボでの少なくともいくつかの機能の保持には必須ではない事を示唆して いる。凍結乾燥された血小板物質の静脈内投与の主たる副作用は、多分凍結乾燥 物貿中の高セロトニン含量により起こされた血管けい彎により患者が注入部位に 激しい痛みを経験することであった。前記の結果と反対に、１９５９年（２）に 新鮮な超音波破壊全血小板製剤は血小板減少症のイヌのリンパ液中の赤血球の数 を減少させなかった事が報告されている。より最近、マックギル（ＭｃＧｉｌｌ ）ら（３）は血小板膜濃縮物の輸血が血小板減少症のウサギの出血時間を短くし たと報告している。濃縮物には正常血小板とほとんど同じ大きさのゴースト血小 板が含まれており、ミトコンドリアおよび表面−結合系の残遺組織を含んでいた 。マックギル（ＭｃＧｉｌｌ）の濃縮液は：　（１）ウサギの全血を遠心分離し てペレット状新鮮匍小板とし：　（２）ペレットを一６５℃で凍結させ：　（３ ）ペレットを融解し続いて２度凍結−融解させる：および（４）洗浄し、ペレッ トを血小板を含まない血しょうに再懸濁させることにより調製された。

前記の血小板膜分画の調製においては、約４℃またはそれ以下の温度条件が維持 された。そのような温度は生物学的製剤を取り扱う場合には普通の事であり、生 物学的製剤がより高い温度に＠露された場合は非常に短い時間で活性が普通には 失われるからである。例えば、酵素のごときタンパク質は約６０℃に加熱するこ とにより不活性化されるであろう。活性は４℃であっても失われるであろう。

例えば、部分精製された血小板因子３　（ＰＦ−３）は４℃で貯蔵しても４日後 にはその凝固活性の大部分を失うことが報告されている（４）。（ＰＦ−３はト ロンビン発生を促進する触媒表面を提供する血小板膜濃縮物と関連があるらしい 。）そのような活性の消失は血小板分画を医薬として使用することを考える場合 には非常に関心が持たれるところである。

ヒトに使用する血小板分画を調製する場合は、もちろん無菌条件を使用する必要 がある。全血輸血と同様に、提供された血小板ユニットの使用は受血者をＡＩＤ Ｓ、肝炎および他の輸血関連疾患のごとき疾患の伝染の危険に曝すことになる。

別の危険性は多数回の輸血後、受血者１５！者に提供された血小板に対する抗体 が現れることである（同種免疫として知られている状態）。そのような抗体は輸 血された血小板の急速な破壊を起こす。さらに、貯蔵血小板の細菌感染は輸血に おける重大な危険性である。

発明の概要 本発明は血小板膜から新規な方法に従って誘導される医薬および診断生成物を提 供する。生成物は前血液凝固活性を持つ血小板膜分画製剤を含み、出血を制御す るために全血小板の代わりに使用され、傷治療を促進する為に局所的に使用され 、あるいはインビトロおよびインビボにおいて診断薬として使用される。

本発明の一つの態様に従うと、血小板膜分画製剤は活性なウィルスを含んでいな い。この製剤を作る方法はウィルス混入並びに細菌混入を減するまたは除去する ために血小板膜分画製剤の熱処理を含んでいる。本製剤は熱処理されるけれども 、驚くべき事にその前血液凝固薬および止血活性は保持されている。さらに、熱 処理膜断片は期待されたよりもはるかにより安定である。本製剤は前血液凝固活 性の顕著な損失がなく、少なくとも８迦間、少なくとも６ケ月（９０％以上保持 ）４℃で貯蔵できる。この活性は凍結乾燥後でさえも保持される（９０％以上） 。さらに、タンパク質およびリンＩ！１′１Ｊｉｒ含量は凍結乾燥後および６ケ 月の貯蔵後にも変化しない。

本発明の別の態様に従うと、本製剤は非免疫性であり、特にクラスＩ　ＨＬＡ抗 原決定基に関して非抗原性である。それ故特定の受血者に対する本製剤の適合性 は提供者の遺伝的特性により制限されない。

本発明のさらに別の態様に従うと、前血液凝固活性を持ち出血を制御できる本血 小板膜分画製剤は実質的にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を含んでいない。この事 はＧＰ　Ｔ　Ｉｂ／Ｉ　Ｉ　Ｉ　ａ複合体が止血に関与しており、必要であると 広ぐ信じられていることを考えると驚くべき事実である。

本血小板膜分画製剤はゴースト血小板を含まず、比較的均一な微粒子を含んでい ることが好ましい。好ましくは、少なくとも微粒子の８０％は６００ナノメ一タ ー未満の直径を持っており、少なくとも９５％は１ミクロン未満の直径を持って いる。最も好ましくは、微粒子は約３００から４００ナノメーターの間の平均直 径を持っている。そのような微粒子は典型的なゴースト血小板の約１１５から１ ／７の大きさである。

好ましい製剤は実質的にセロトニンを含まず（血小板溶解物に観察される量の０ ．０２％未満）、それにより従来の技術によるある種の製剤が輸血に使用された 場合に特徴的な呼吸及び血管の問題をなくしている。本製剤はさらに検出可能な プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性（細胞質酵素マーカー）を持たず、実質 的に因子ｖ、ｖｒｒｒ、ｒｘおよびＸを含んでいない。一つの実施態様において 微粒子分画は重量で３％の炭水化物、３０％のリン脂質、５８％のタンパク質・ および９％のコレステロールであり、リン脂質に対するタンパク質の比は１．９ ７±０．１０（平均±ＳＤ、ｎ−７）である。

驚くべきことに血小板膜断片製剤は期限切れの血小板からも製造される。典型的 には、病院などは輸血のための血小板を室温で３から５日保存している。これ以 後は血小板は使用不可能と考えられ”期限切れ血小板”として捨てられる。本発 明の医薬品及び診断薬はそのような期限切れの血小板から製造してもよいことが 発見された。それ故、本発明は輸血のための血小板膜分画の準備が完全にまたは 一部期限切れの血小板からなされるという利点を持っており、それによりこれま で有用でないとして捨てられていた多量の血小板が使用できる。

本発明の血小板由来の生成物を製造するための方法も提供される。本発明の一つ の態様においてプロトロンビナーゼ活性を持つ血小板または血小板膜断片を含む 試料が、試料中に含まれているウィルスを不活性化するのに十分な条件下で処理 される。好ましくは試料は熱処理される。そのような試料はまた、好ましくは超 音波処理にて均一化されることによりゴースト血小板を実質的に含まない血小板 膜微粒子が作られる。この試料はまた実質的に全てのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ表面 糖タンパク質複合体を除去するために処理されるであろう。

本発明はまた出発原料として期限の切れた血小板またはその膜断片を用いた血小 板由来生成物の製造方法をも提供する。期限切れの血小板は単−提供者源であっ てもよく、多数の提供者からプールされたものでもよい。この方法はまたウィル ス不活性化のための処理、微粒子形成のための処理およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ を実質的に除去するための処理を含む。

ゴースト血小板を溶解物から分離し、溶液中に懸濁し懸濁液を得る。続いてゴー スト血小板を含む懸濁液はウィルス混入物を不活性化するために少なくとも６０ ℃にて少なくとも２時間加熱される。熱処理によりまた沈澱の形成を起こす。し かしながら沈澱は顕著な量の所望の活性を含んでいるのでこの時点では沈澱を除 去しない。そのかわり沈澱を含む懸濁液を最初にホモジエナイズしく好適には超 音波処理により）、そして沈澱を懸濁液から分離する。懸濁液は貯蔵されるかま たは輸血に使用される。

血小板膜断片製剤は出血を防止するために動物またはヒトにおいて医薬として有 効量使用される。輸血のための医薬製剤として使用された場合、無菌製剤は塩溶 液または血しょうのごとき生理学的に適合する溶液に懸濁される。それは単独で もまたは全血小板を含む他の薬剤と一緒に使用してもよい。本製剤は人工血液へ の理想的な添加剤である。本製剤はまた出血を停止させるためおよび傷の処置の ために局所的に応用してもよい。この点に関しては本製剤はゲルまたは軟膏のご とき医薬として受容可能な担体中に懸濁させてもよいし、またはガーゼの様な担 体に染み込ませてもよい。本製剤はまた薬剤運搬のための担体として使用しても よいし、または例えば凝血の位置を追跡するための造影剤として標識して診断的 に使用してもよい。

図面の簡単な説明 図１はトロンビン凝固時間の標準曲線を示すグラフであり：図２はＰＦ−３特異 活性に対する熱処理の影響を示すグラフであり：図３は正常血小板のおよび血小 板減少症のウサギにおける血小板数および出血時間を示すグラフであり： 図４はドキンルビシン塩酸塩誘発血小板減少症動物における出血時間に対する輸 血された血小板膜微粒子の効果を示すグラフであり：図５は抗体誘発血小板減少 症動物における輸血された血小ＥＭ微粒子の効果を示すグラフであり： 図６はブスルファン誘発重度血小板減少症動物における出血時間に対する輸血さ れた血小板膜微粒子の用量応答性効果を示すグラフである。

好ましい態様の詳細な説明 本発明の生成物は全血小板からまたは全血小板の膵由来物から調製される。全血 小板は新しく集められたものでもよいし期限切れの血小板でもよい。期限切れの 血小板とは約４℃から室温の間の温度で少なくとも３日間貯蔵された血小板を意 味している。期限切れの血小板とは、受は入れられている慣例に従うと輸血品と しての使用にはもはや適さないとして捨てられていたものである。血小板の誘導 物とはゴースト血小板または血小板膜微粒子を含む血小板膜断片のごとき無傷で ない血小板を意味している。

本発明の生成物は患者に有効量投与される。術語”患者”とは例えばヒト、イヌ 、ネコ、ウマ等のごとく、少なくとも一部は血小板により開始される止血能を持 つ生きている生物を含むことを意味する。”有効量”とは本生成物が投与される 特定の治療または診断の目的が達成できる量である。輸血の一般的な場合におい て、有効量とはもし全血小板が輸血されたとした場合に達成されるであろうもの と実質的に同じレベルの止血機能を回復するように作用する量である。血小板減 少症の患者の場合、有効量とは患者の出血時間を減少させる（好ましくは危険で ないレベルまで、および最も好ましくは正常個体と一致するレベルまで減少させ る）量である。有効量は個々の個体に基づいて、および少なくとも一部は患者の 大きさ、処置される徴候の激しさおよび要求される結果に基づきうる。それ故有 効量はそのような因子を用いておよび日常の経験を用いて当業者により決定され うる。

本発明の生成物は活性なウィルスを除くために処理される。活性なウィルスを含 まないとは、生成物が例えばＨＢＶ、ＮＡＮＢＨＶ、ＣＭＶまたはＨＩＶのごと き存在するどのようなウィルスをも不活性化または破壊するのに十分な条件に委 ねられることを意味する。そのような条件としては抗体、エタノール、紫外光、 有機溶媒−界面活性剤およびフェナンスロリンキレート剤を含む処置が挙げられ る。　にこに引例として含まれている”血しよう生成物におけるウィルスの不活 性イど、モルゲンクーラー（Ｊ、　Ｊ、　Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ）監修、　 Ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｈｅｍｏｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｌ ｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、　Ｎｏ、　５６．　［ａｒｇｅｒ、　Ｎ、Ｙ 、　１９８９．を参照された■B ）ウィルス不活性化の好適な方法としてはウィルスを不活性化または破壊する程 度まで熱処理することが挙げられる。

本発明の生成物はまた輸血された時のその免疫原性を減少または除去するために 処理されるであろう。本発明の生成物は都合の良いことにプールされた血小板か ら調製され、それは通常はとんどの個体に輸血された場合抗体応答を誘導するで あろう。現在、同種免疫は繰り返しの血小板輸血を必要とする血小板減少症の患 者の処置における困難な問題である。血小板は血小板膜の一部であるかまたは血 しょうから吸着されるＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ抗原を示す。ＨＬＡ−Ａまた はＨＬＡ−Ｂ　（血小板同種免疫の第一の原因である）に対する抗体の発生は輸 血された血小板の急速な破壊をおこし、それ故、止血に対する血小板の輸血の効 果を減少させている。血小板濃縮液への白血球（ＨＬＡ抗原となる源である）の 混入もまた同種免疫の発生に寄与するであろう。

本発明の好ましい生成物は非免疫原性、非同種免疫原性およびＨＬＡ決定基（特 にクラスＩ　ＨＬＡ決定基）に対して非免疫原性である。ここで非免疫原性とは 数回の輸血後、患者が輸血された生成物の治療効果を妨害するのに十分な免疫応 答を身につけないことを意味している。ここで非同種免疫原性とは数回の同種免 疫原から調製される物質の輸血後、患者が同種抗原に対して検出可能な免疫応答 を示さないことを意味している。検出可能とは同種抗原に対する血清抗体がドツ ト検定のごとき慣用の技術を用いては検出できないか、または、同種抗原に対す る免疫応答が輸血された生成物の治療効果を妨害するのに十分でないことを意味 している。

本発明の好ましい生成物を製造するための好ましい方法は以下の通りである。

新しく集められ、貯蔵された（２０−２５℃で１−５日）または期限が切れた（ ４℃で５日以上）血小板濃縮液（５０−６０ｍＬｌｆａＮ液）を６００ｍ１の血 液バック（Ｆｅｎｗａｌｌ　トランスファーバックユニット、　４Ｒ２０２３， Ｆｅｎｗａｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ、　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、　ｌ１ｌｉ ｎｏｉｓ）に、無菌面しょうトランスファーセット（Ｆｅｎｗａｌｌ、　４Ｃ２ ２４３゜Ｆｅｏｗａｌｌ　１ａｂｏｒａｔｏｉｅｓ、上記）を通してプールした 。各々のバックは全量で５００−６００ｍｌの血小板濃縮液を含んでいた（以後 ６００ｍ１ユニツトと称する）。６００ｍ１ユニツトを２２℃にてＬ　Ｏｏｏｒ ｐｍで１１分間遠心分離して混入している赤血球および白血球細胞を除去した（ ＰＲ７０００，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ、　Ｎｅｅｄｈａｍ　Ｉｌｅｉｇｈｔｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） 　ａ血小板を含んでいる上澄を新しい６００ｍ１血液バツクへ移し２２℃にて２ ５分間３．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して血しょうから血小板を分離した。血小板 を含まない血しょうを絞り出し得られる血小板ペレットを２０ｍ１の０．９％Ｎ ａＣ１溶液（生理食塩水）に穏やかに再懸濁し、新しい塩溶液で最終的に１００ ｍ１の容量まで希釈し、３００ｍ１の血液バック中にプールしたＣバック当り１ ００ｍ１の３つの試料は最初の６００ｍ１ユニツト３つに対応する）。再懸濁し た血小板を再び２２℃にて２０分間３．００Ｏｒｐｍで遠心分離し沈殿させた。

上澄み液を除去し血小板ペレットを生理食塩水で２度洗浄した（再懸濁および遠 心分離を繰り返してン。

洗浄した血小板は最終的に生理食塩水（各々６００ｍ１ユニツト当り２５ｍ１） に再懸濁し凍結（−８０℃で少なくとも６時間）および融解（２５℃で少なくと も１時間）を３回繰り返すことにより破壊された。凍結および融解された！！！ ４ＲＩ液を生理食塩水（各々６００ｍ１ユニツトあたり１００ｍ１）で希釈し、 ３０分間３．００Ｏｒｐｍで遠心分離して血小板ゴーストペレットを集めた。

血小板膜を破壊し、血小板ゴースト分画を単離するのに別の方法を用いてもよい 。例えば、血小板をグリセロールで平衡化し続いて細胞外のグリセロール濃度を 急激に希釈することにより浸透圧を低くして破壊してもよい。これは血小板の外 膜をはさんで浸透圧の勾配を作りそのことにより細胞膜の崩壊を導くものである 。さらに、浸透圧ショックの誘導及び血小板の破壊の為に多くの他の化学薬品（ 例えば、ＮａＣ１）を類似の方法で使用してもよい。好ましい実施態様において は凍結および融解の繰り返しが使用された。

洗浄されたゴーストペレットを生理食塩水（各々６００ｍ１ユニツト当り４０− ４０−５Ｏに再懸濁し、水浴上６０℃で２０時間加熱した。もしくは、血小板ゴ ースト懸濁液を１００℃で５分間加熱した。これらの条件は混入ウィルスを不活 性化するのに十分である。加熱処理中に大きなふわふわした沈澱が発生した。

この熱処理血小板ゴースト懸濁液は次にフローセル中、１／２”ジスラブターホ ーンＣＭｏｄｅ１．８０ＱＢ、　Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、超音波 処理器（ウルトラソニックプロセッサー１［ｏｄｅｌ　Ｖ−３８５，ｔＩｅａｔ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、　Ｗｅｔ　Ｙｏｒｋ ）中でホモジエナイズされた。超音波処理システムは血小板ゴースト懸濁液の注 入に先立って最初に窒素で置換された。４８マイクロメーターの二重振幅を生成 するために出力調整セツティングを”４”とし、２０ｋＨｚで５分４３秒（２秒 サイクル、１，４秒オン、０．　６秒オフ）パルスをかける事により懸濁液を超 音波処理した。超音波処理した試料はつぎに２２℃にて３０分間３．ＯＯＯｒｐ ｍで遠心分離して、上澄み液に残っている生成した血小板膜微粒子から沈澱物質 を分離した。上澄み液を除き、封をした容器中で４℃、−２０℃または一８０℃ で貯蔵するかまたは窒素上凍結乾燥して貯蔵した。特に指示しない限り、微粒子 は４℃で貯蔵され以下の方法で使用された。

前記のごとくして調製された血小板微粒子画分は活性なウィルスを含んでいなか った。それはまた実質的に血小板ゴーストを含まず、微粒子の８０％以上が直径 ６００ナノメ一ター未満であり、９５％以上が１．０００ナノメ一ター未満であ った。新しく期限切れとなった血小板（期限切れ後２週間以内）から調製された ７つの異なった試料の微粒子の平均直径は３００から４００ナノメーターの間で あった。７つの試料の平均直径は３４１ナノメーターであった。

血小板微粒子画分はまた実雪的にセロトニン、ＧＰＩ　Ｉｂ／Ｉ　Ｉ　Ｉａ　（ 表面糖タンパク質）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、血液凝固因子Ｖ、Ｖ ＩＩ１、ＩＸおよびＸｌおよびトロンポスポンジン（アルファ顆粒成分）を含ん でいなかった。一方、ＧＰＩｂ（別の糖タンパク質）が存在しており、ベーター グルクロニダーゼ（リソソームマーカー）もまた検出可能であった（溶解物のパ ーセントとして約２５％）。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは止血に必要であると信じら れているので、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが存在しないことは驚きであった。

血小板微粒子画分の組成はある種の成分に対し２つの異なった組の実験で決定さ れ表　に示されている： 表■ 成分毎の合計重量パーセント（Ｗ／Ｗ）実験　炭水化物　リン脂質　タンパク質 　コレステロールＮ＝７　３．３±０．１４　３０．０±０．９　５７．８±０ ．９　９（予想値）Ｎ＝８　２．６±０．３　３０．１±２．５　５３．２±１ ．７　９．９±０．９新しく期限切れとなった血小板から調製された好ましい血 小板微粒子画分の前血液凝固活性は、ＰＦ−３活性の測定に使用されるラッセル クサリヘビ蛇毒時間（５）を用いて決定された。ラッセル検定はトロンビン生成 試験であり、終末点はフィブリノーゲン凝固により決定される。比活性はトロン ビン標準曲線と比較して決定され、血小板タンパク質のｍｇ当りまたは血小板リ ン脂質ｍｇ当りに生成されたトロンビンの単位（Ｕ）として表現される。タンパ ク質ｍｇ当りのＰＦ−３の比活性（Ｕ／ｍｇ）は最初の組の実験において１４８ −１±１３−　４　（ｎ−７）であると決定された。第二の組の実験においては １７５±８（ｎ−８）であった。最初の組の実験においてリン脂質ｍｇ当りのＰ Ｆ−３比活性（Ｕ／ｍｇ）は２９１．３±４０．０であった。第二の組の実験に おいて、それは３１０±２３であった。それらの比活性は新鮮で無傷の全血小板 の比活性をはるかに越えていた。このことは無傷の細胞では通常利用できない全 血液凝固膜断片の放出によるものと信じられている。

凍結乾燥品において比活性の約６０％以上を保持するためには試料に保護物質を 添加する必要があったが、比活性は凍結乾燥後でさえも保持された（０．　４ｇ ｍ／ｄｉのシラ糖、９０％以上の活性が保持された）。

本試料のリン脂質部分の組成は二つの別々組の実験において決定され、表ＩＩに 示されている： 表ＩＩ 各リン脂質の合計パーセント（Ｗ／Ｗ）実験　ｐｒ　ＰＳ　ＰＥ　ＰＣ５Ｐ Ｎ＝４　５．８±１．０　１０．１±０．９　２２．５±１．５　４５．８±４ −０　１５．４±０．７Ｎ＝８　６．８±０．５　１２．２±０．７　２３．８ ±２．１　４０．６±２−３　１６．６±１．５Ｐｒ：ホスファチジルイノシト ール　ＰＳ、ホスファチジルセリンＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン　Ｐ ＣホスファチジルコリンＳＰ、スフィンゴミエリン 血小板微粒子画分を、前血液凝固活性および血小板減少症の動物に於ける出血制 御の能力に関して試験した。新しく期限切れとなった血小板から調製された微粒 子画分の前血液凝固活性は新鮮な血小板から調製されたものに匹敵することが観 察された。新鮮なおよび新しく期限切れとなった血小板から調製された画分は、 全血小板に匹敵する前血液凝固活性を持っていた。この両分の輸血は全ての受皿 動物の出血時間を短くした。

前血液凝固活性に対する熱処理の影響および超音波処理の影響が試験された。

新しく期限切れとなった血小板から調製された微粒子画分は熱処理に対して比較 的安定である事が観察された。この血小板微粒子画分の前血液凝固活性は、加熱 処理にホモジェナイズが先んじた場合非常に減少する事がさらに発見された。本 発明の微粒子分画のこれらおよびその他の性質は以下の実施例により詳しく示さ れる。

上で明らかにされた方法によって調製された生成物ならびに種々の中間体にＧ液 および血小板膜ゴースト分画に存在した。加熱された血小板膜ゴースト分画また は本最終生成物中には検出可能なＧＰＩｒｂ／ＩＩＩａは存在しなかった。

最終生成物および中間体にＨＬＡ抗原（クラス■）が存在するかを、免疫学的ド ツト検定により試験した。ＨＬＡ抗原は洗浄された無傷の血小板製剤、血小板溶 解物、血小板溶解物からの上澄み液、および血小板膜ゴースト分画に存在した。

ＨＬＡ抗原は加熱された血小板膜ゴースト分画または本最終生成物中には検出で きなかった。

最終生成物及び種々の中間体はさらにＧＰＩｂの存在を免疫学的ドツト検定によ り試験した。試験された全ての試料（加熱処理されたものを含む）はＧＰＩｂの 存在を示した。

以上の説明は好ましい実施態様のものである。しかしながら本発明はそのもっと も広い意味においてそのように制限されるものではない。本発明の一つの態様は 血小板またはウィルスの混入を除去するために加熱処理された血小板膜画分の準 備である。そのような熱処理は一般的にウィルス混入物を不活性化することか知 られているが、血小板製剤に関連して使用されたことはなかった。それ数本発明 は輸血に有用なウィルス不活性化血小板画分を最初に提供するものである。

本発明の別の態様は期限切れ血小板から調製される輸血製剤である。本発明は通 常は捨てられていた多量の期限切れ血小板を輸血に有用化する本当に初めてのも のである。さらに、貯蔵中期限切れ血小板にウィルス混入の可能性が高まるので 、本発明の熱処理工程はウィルスが不活性であることを保証することによって期 限切れ血小板を有用にすることにも寄与している。

本発明はまた、実質的にゴ〜スト血小板を含まない血小板膜画分の調製に熱不活 性化と均質化工程を組み合わせている。本製剤は均一な大きさの微粒子を含むが 不所望の細胞質物質は実質的には含まれていない。本発明の好ましい方法に従う と、加熱処理工程に続いてホモジエナイズ（超音波処理）工程があり、そのため 均一な大きさの微粒子が作られると同時に、熱不活性化工程の間に生成される沈 澱にかなりの量の活性が結合することが防がれる。

前に記載したごとく微粒子画分は段階に分けて調製されるであろう。最初に、血 小板膜が部分的に破壊され、ゴースト血小板画分および細胞質物質を含む溶解物 が形成される。この細胞質物質から血小板ゴーストが分離されたら次にゴースト 血小板が均質化され、実質的にゴースト血小板を含まないが実質的に単一の大き さの微粒子を含む両分が形成される。しかしながら、部分破壊の予備的な工程を 全く除いてもよいことが理解されるであろう。それ故、血小板を超音波処理し、 生成した微粒子を溶解物から単離してもよい。

本発明の血小板膜微粒子画分は全血小板と比較した場合かなり非免疫原性であり それ故、合致した血液型の様々な提供者から集められプールされた血小板から調 製してもよいと信じられる。全ての白血球を効果的に除去する多くの洗浄もまた 製剤の非免疫原性に寄与している。

この様に本発明の好ましい生成物は前血液凝固活性を持ち、ウィルスを含まず、 非同種免疫原性であり、また調製され、凍結乾燥されそして適当な容器中に市販 量貯蔵されても安定である。

実施例Ｉ ＰＦ−３（血小板因子−３）全血液凝固活性はトロンビン発生試験であるラッセ ルクサリヘビ蛇毒時間検定により測定された。試験の終末点はプールされたヒト 血しょう試料中に存在するフィブリノーゲンの凝固により視覚的に決定された。

ＣａＣ１ｚの貯蔵溶液（イミダゾール緩衝液中０．０２５Ｍ、ｐＨ７，３）は３ ７℃に維持された。プールされたヒト血しようおよび血小板微粒子画画溶液（塩 溶液中２５　μｇ／ｍｌ）は室温で貯蔵された。ラッセルクサリヘビ蛇ｆｆ１（ Ｒｖ■：塩溶液中１０　ｕ　ｇ／ｍ　ｌ　；　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ、　Ｄａｒｔｆｏｒｄ、英国）は氷上に保持された。

検定は混合により開始され、ホウケイ酸ガラス管（１２ｘ７５ｍｍ）中にプール された血しようの各々０．１ｍｌおよび血小板微粒子の溶液を３７℃にて５−１ ０分間インキュベートした。つぎにＲＶＶ溶Ｍ（０，１ｍ１）を添加し、３７℃ にて３０秒さらにインキュベートした後、０．１ｍｌのＣａＣ１ｚの溶液を添加 した。ＣａＣ１ｚの溶液の添加からフィブリン凝固までの時間が決定された。

検定システムにより生成されるトロンビンの単位は、精製されたウシトロンビン （Ｓｉｇｍａ　８５０−１　；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　１０）およびプールされたヒト血しようを用いてトロンビ ン凝固時間の標準曲線（図１）から計算された。

ラッセルクサリヘビ蛇毒時間（５）を用いる前血液凝固活性（ＰＦ−３）に対す る熱処理の影響及び超音波処理の影響が試験された。図２に示したごとく熱処理 に続く超音波処理はかなりの量の前血液凝固活性を保持している血小板微粒子分 画を生じさせた。しかしながら、超音波処理を熱処理に先立たせると（データは 示されていない）血小板膜微粒子画分の前血液凝固活性が劇的に変化し、前血液 凝固活性は５０％減少した。

実施例２ 血小板微粒子は、抗体誘発血小板減少症動物に於ける出血制御の能力に関して試 験された。抗−ウサギ血小板抗血清がウサギに於ける血小板減少症の誘発に使用 された。最初に血小板数および出血時間が１０羽の正常ウサギで決定された（体 重３５３±０．４１Ｋｇ；血小板数５４８，０００±９７．０００／μ［：出血 時間、１５３±４７秒：平均±ＳＤ）。抗−ウサギ血小板抗血清は市販品を使用 し、１０羽のウサギへ体重ｋｇ当り０．２−０．４ｍｌの用量で静脈内に投与し た。抗血清を注射して２時間後には全ての動物に種々の程度の血小板減少か存在 した。データは”誘発された血小板減少症”の程度にしたがって分類された群１ 、血小板数８０．０００／μ１未満１群２、血小板数１００．０００−２００． ０００／μｌの間および群３、血小板数２００．０００／μ１以上（図３）。

減少症、＜７５．０００／μｌ）、群２および３の両方の動物においては中程度 の延長が観察された（図３）。

新しく期限切れとなった血小板から調製された血小板微粒子画分（２ｍｇタンパ ク質／ｋｇ体重）が重度の血小板減少症である群１の動物へ輸血された。図４を 参照すると、抗血清注射後２時間において得られた血小板数は動物１．２および ３に対し各々４１，０００．７３．０００および５６．０００／μｌであつ血の 抑制が起こった。それ故、本発明の血小板微粒子の輸血後の出血時間の短縮の一 般的傾向が全ての受皿動物で示された。

実施例　３ 本血小板微粒子のドキソルビシン塩酸塩−誘発、血小板減少症動物における出血 制御の能力が試験された。血小板減少症を誘発するため９羽のウサギにドキ・ノ ルビシン塩酸塩（アドリアマイシン；２ｍｇ／ｋｇ体重）が静脈内投与された。

基準血小板数（ドキソルビシン注射前）は４８８．０００±９４，０００／μｌ であった。基準出血時間は１２８±２１秒であった。ドキソルビシン注射−週間 後、血小板数は１３０．０００±３１．０００／μＩ　（ｐｒｏ、０１）に減少 し、出血時間は血小板減少性対照動物に対して２．４倍増加した（３１１±８９ 秒：ｎ＝９）（ｐ＜０．０１）。新しく期限切れとなった血小板から９された血 小板微粒子分画（２ｍｇ膜タンパク質／ｋｇ体重）または塩溶液製剤をドキソル ビシンにより血小板減少症が誘発されたウサギに輸血した。前血液凝固膜を受け 取つ縮されたことが示された（＜（１０１）（図５）。対照的に血液減少性ウサ ギへの塩溶液のみの注入では、その前後の測定において顕著な相違は見られなか った。

実施例　４ 出血を制御する本発明の血小板微粒子の効能は、微粒子が重度の血小板減少症ウ サギへ投与された場合の用量依存性応答により更に確認された。重度の血小板減 少症を誘発するため（μｌ当りの血小板数が２５．０００未満）ブスルファンを ウサギの皮下に２回注射した（合計して３５ｍｇ／ｋｇ体重）。血小板微粒子の 三つの別々の用量（０，５ｍｇ／ｋｇ体重、１．０ｍｇ／ｋｇ体重および２゜０ ｍｇ／ｋｇ体重）および塩対照製剤が重度血小板減少症ウサギへ輸血された。

輸血の日に決定された基準血小板数は全ての動物に対し約１５，０００／μｌの オーダーであった。

図６を参照すると、血小板微粒子の止血効能は輸血された用量に直接的に相関し ていた。重度血小板減少症ウサギへの塩溶液の輸血は出血時間を変化させなかっ た。一方、重度血小板減少症ウサギにおいて長引かされた出血時間は血小板微粒 子が輸血された場合、用量依存性にしたがって短縮された。

血小板減少症ウサギにおける以上の輸血の研究は、本発明の血小板膜断片製剤の 止血効能を証明している。

図面に示し、そして上に記載した実施態様に対して各種の変更および変形が本発 明の範囲内でなされるであろうことが当業者には理解されるであろう。従って、 前記の明細書本文に含まれ、そして付随する図面に示されている全ての内容は例 示であり制限する意味ではないと解釈されるべきであることを意図している。

文献 １）クライン（Ｋｌｅ　ｉｎ）、Ｅ、、ファーバー（Ｆａ　ｒｂｅ　ｒ）、Ｓ、 、ジェルサージ（Ｄｊｅｒｓａｓｉ）、１．、トツホ（Ｔｏｃｈ）、Ｒ，，７リ ーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、Ｇ、、アーノルド（Ａｒｎｏ　Ｉｄ）、Ｐ、、”急 性白血病および再生不良性貧血の小児に対する凍結乾燥血小板材料の製造と臨床 的投与”Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、４９：５１７．１９５６゜２）ショルト（ Ｈｊｏｒｔ）、Ｐ、、バーマン（Ｐｅ　ｒｍａｎ）、Ｖ、、ａｎｄ　クローンカ イト（Ｃｒｏｎｋｉｔｅ）、Ｅ、、”新鮮な崩壊血小板および放射線血小板減少 症・出血の補正なしのプロトロンビン消費の補正”。

３）マックギル（ＭｃＧｉ　１１）、Ｍ、、　フーグマン（Ｆｕｇｍａｎ）、Ｄ 、。

ピットリオ（Ｖｉｔｔｏｒｉｏ）、Ｎ、、ａｎｄ　Ｆロウ（Ｄｒ　ｒｏｗ）、Ｃ ，。

”血小板減少症は血小板減少症ウサギの微少血管出血時間を短くする”Ｊ、Ｌａ ｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、１０９：１２７−１３３．１９８７゜４）ウー（Ｗｕ） 、Ｖ−Ｙ、、−ｒ−）コイ（ＭｃＣｏｙ）、Ｌ、Ｅ、、”血小板因子　３：定量 および特性付け”、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、１１：５８１−５９３．１９７７ ゜ ５）スベー１−　（Ｓｐａｅ　ｔ）　、　Ｔ、　Ｈ，、シントロン（Ｃｉｎｔｒ ｏｎ）、Ｊ。

、”　血小板因子−３有効性の研究”、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｈａｍｅｍａｔｏｌ、１ １：２６９，１９６５゜ トロンビン凝固時間の標準曲線 図１ （生成されたトロンビンのユニット／ｍｇタンパク質）出血時間（秒） ＰＭＭまｒコは塩溶液を輸血された重度血小板減少症ウサギ輸血後の時間（分） 図６ 補正書の翻訳文提出帯 （特許法第１８４条の７第１項） 平成　３年１０月１４日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１９８９ ２、発明の名称 血小板膜画分子 ３、特許出願人 ニュートン、ボーダー・ストリート　４５名　称　ピーアールピー・インコーホ レーテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正書の提出日 英文明細書第３４頁第２０行〜第３５頁第２１行（出願翻訳文第１８頁第５行〜 第１８頁第１６行）（請求項２４を補正した） ２０、期限切れの血小板から調製される請求項１．３．９．１０．１５および１ ６のいずれか１項に記載の血小板膜断片。

２１、前血液凝固活性を持ちおよび期限切れの血小板から調製された血小板膜断 片を医薬として有効量含み、医薬として受容可能な担体を組み合わせてなる製剤 。

２２、プールされた期限切れの血小板から調製される請求項２１記戦の製剤。

２３．４℃で少なくとも８週間安定である請求項１．３．９．１０．１５．１６ および２１のいずれか１項に記載の血小板膜断片。

２４、前血液凝固活性を持つ血小板または血小板膜断片を含む物質を該物質中に 含まれているウィルスを不活性化するのに十分な条件下で処理し、そして処理さ れた血小板画分を集めることを特徴とする血小板膜画分の製造方法。

２５、含まれているウィルスを不活性化するために該物質が熱処理される請求項 ２４記載の方法。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．前血液凝固活性を持ちそして活性なウイルスを含んでいない血小板膜断片。 ２．ゴースト血小板を実質的に含んでいない請求項１記載の血小板膜断片。 ３．１ミクロンより大きな直径を持つ小胞を実質的に含んでいない請求項１記載 の血小板膜断片。 ４．クラス　Ｉ　ＨＬＡ決定基に関して非抗原性である請求項１ないし３のいず れか１項に記載の血小板膜断片。 ５．非同種免疫原性である請求項４記載の血小板膜断片。 ６．非免疫原性である請求項４記載の血小板膜断片。 ７．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでいない請求項４記載の血小板 膜断片。 ８．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでいない請求項１ないし３のい ずれか１項に記載の血小板膜断片。 ９．前血液凝固活性を持ち、クラス　Ｉ　ＨＬＡ決定基に関して非抗原性である 血小板膜断片。 １０．非同種免疫原性である請求項９記載の血小板膜断片。 １１．ゴースト血小板を実質的に含んでいない請求項９または１０記載の血小板 膜断片。 １２．１ミクロンより大きな直径を持つ小胞を実質的に含んでいない請求項９ま たは１０記載の血小板膜断片。 １３．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでいない請求項９または１０ 記載の血小板膜断片。 １４．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでいない請求項１２記載の血 小板膜断片。 １５．前血液擬固活性を持ち、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでい ない血小板膜断片。 １６．１ミクロンより大きな直径を持つ小胞を実質的に含んでいない請求項１５ 記載の血小板膜断片。 １７．製造後または中間体においてウイルス不活性化の為の処理がなされている 、前血液凝固活性を持つ血小板膜断片。 １８．製造後または中間体において加熱処理がなされている請求項１７記載の血 小板膜断片。 １９．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に含んでいない請求項１７記載の血 小板膜断片。 ２０．期限切れの血小板から調製される請求項１、３、９、１０、１５および１ ６のいずれか１項に記載の血小板膜断片。 ２１．前血液凝固活性を持ちおよび期限切れの血小板から調製された血小板膜断 片を医薬として有効量含み、医薬として受容可能な担体を組み合わせてなる製剤 。 ２２．プールされた期限切れの血小板から調製される請求項２１記載の製剤。 ２３．４℃で少なくとも８週間安定である請求項１、３、９、１０、１５、１６ および２１のいずれか１項に記載の血小板膜断片。 ２．前血液凝固活性を持つ血小板または血小板膜断片を含む物質を該物質中に含 まれているウイルスを不活性化するのに十分な条件下で処理することを特徴とす る血小板由来生成物の製造方法。 ２５．含まれているウイルスを不活性化するために該物質が熱処理される請求項 ２４記載の方法。 ２６．実質的にゴースト血小板を含まない血小板膜微粒子を生成させるために、 該物質を均質化することを更に特徴とする請求項２４または２５記載の方法。 ２７．該熱処理後に該物質を超音波処理することを更に特徴とする請求項２５記 載の方法。 ２８．該超音波処硬後に該物質を凍結乾燥することを更に特徴とする請求項２５ 記載の方法。 ２９．該生成物中の全てのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に除去すること を更に特徴とする請求項２４または２５記載の方法。 ３０．出発材料として期限切れの血小板またはその膜断片を用いることを特徴と する血小板由来膜断片生成物の製造方法。 ３１．出発材料としてプールされた期限切れの血小板またはその膜断片を用いる ことを特徴とする請求項３１記載の方法。 ３２．該膜断片生成物を凍結乾燥することを更に特徴とする請求項３０記載の方 法。 ３３．生成物中に含まれるおそれのあるウイルスを不活性化するために該期限切 れの血小板またはその膜断片を含む材料を処理することを更に特徴とする請求項 ３０記載の方法。 ３４．実質的にゴースト血小板を含まない血小板膜微粒子を生成するために該期 限切れの血小板またはその膜断片を均質化することを更に特徴とする請求項３０ 記載の方法。 ３５．実質的にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を除去するために該期限切れの血小 板またはその膜断片を処理することを更に特徴とする請求項３１記載の方法。 ３６．該期限切れの血小板またはその膜断片を加熱することにより該ウイルスが 不活性化される請求項３３記載の方法。 ３７．該期限切れの血小板またはその膜断片を非同種免疫原性生成物を生成させ るのに十分な条件下処理することを更に特徴とする請求項３１記載の方法。 ３８．前血液凝固活性を持つ血小板または血小板膜断片を含む物質を該物質を非 同種免疫原性とするのに十分な条件下処理することを特徴とする血小板由来生成 物の製造方法。 ３９．血小板膜微粒子を生成させるために該血小板またはその膜断片を均質化す ることを更に特徴とする請求項３８記載の方法。 ４０．該生成物からＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を除去することを更に特徴とす る請求項３８記載の方法。 ４１．該血小板由来生成物を凍結乾燥することを更に特徴とする請求項３８ない し４０のいずれか１項に記載の方法。 ４２．全てのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を実質的に除去するのに十分な条件下 で前血液凝固活性を持つ血小板または血小板膜断片を含む物質を処理することを 特徴とする血小板由来生成物の製造。 ４３．実質的にゴースト血小板を含まない血小板腹微粒子を生成させるために該 物質を均質化させることを更に特徴とする請求項４２記載の方法。 ４４．該血小板由来生成物を凍結乾燥することを更に特徴とする請求項４２また は４３記載の方法。 ４５．血小板またはその膜断片を含む物質を加熱し、微粒子を作るために該熱処 理した物質を超音波処理し、そして核微粒子画分から加熱の結果として生成した 沈澱物を分離することを特徴とする血小板由来生成物の製造方法。