JPH0333132B2

JPH0333132B2 -

Info

Publication number: JPH0333132B2
Application number: JP59110147A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Uchida; Shigeharu Ueda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-05-29
Filing date: 1984-05-29
Publication date: 1991-05-16
Also published as: JPS60252425A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はウイルス性脳炎の治療剤に関し、更に
詳しくは、有膜ウイルスを原因とするヒトまたは
動物のウイルス性脳炎に対して特異な治療効果を
発現するジフテリア毒素フラグメントＡを封入し
たリポソームを主成分とする治療剤に関する。ウイルス性疾患に対する治療剤は種々開発され
ているが、それらのうち治療効果が比較的優れて
いるのは２，３のヘルペスウイルス感染症に対す
るアシクロビール（Acyclovir）やアデニン・ア
ラビノシツド（Adenine arabinoside）など数種
の核酸誘導体のみであり、これらの薬剤も、ウイ
ルス性脳炎の治療剤としては、使用量と副作用出
現の点から評価が定まつていない。一方、本発明
の技術分野に属するウイルス性脳炎治療剤は全く
知られていない。本発明は、ジフテリア毒素の蛋白質合成阻害活
性（毒性活性）を保持してはいるが細胞内侵入能
を持つていないジフテリア毒素フラグメントＡ
を、有膜ウイルス感染細胞の膜表面に特異的に融
合し得るリポソームに担持させて、脳炎を起した
ヒトまたは動物の脳内に注入すると、フラグメン
トＡが感染細胞のみに侵入し、これを選択的に破
壊するという知見に基いて完成されたものであ
る。即ち、本発明の目的は、ジフテリア毒素フラグ
メントＡ含有リポソームを主成分とするウイルス
性脳炎治療剤を提供することにある。以下に本発明を詳細に説明する。ジフテリア毒素フラグメントＡジフテリア毒素は分子量約60000の単一鎖蛋白
質であり、ヒトに対して強い毒性をもつている。
その致死量は成人に対して約10〜20μｇと云われ
ている。この毒素蛋白質を還元剤の存在下、トリ
プシンで温和に処理して限定分解すると、分子量
約20000のフラグメントＡと分子量約40000のフラ
グメントＢに分離する（COLLIER.R.J.and
KANDE L.J.（1971）I.Thiol−dependent
dissociation of fraction of toxin into
enzymically active and inactive fragments.，
J.biol.Chem.246：1496−1503；およびGILL.D.
M.and DIXIUS.L.L.（1971）Observations on
the structure on diphtheria toxin.，J.biol.
Chem.246：1485−1491）。このように分離する
と、それぞれのフラグメント単独では毒性をもた
なくなる。それは各フラグメントが毒性をもつた
めの機能分担をしているからである。即ち、フラ
グメントＡは細胞内で蛋白質合成を阻害して細胞
を殺し、フラグメントＢは細胞表面へ結合してフ
ラグメントＡを細胞内へ送り込む働きをしている
（UCHIDA.T.，PAPPENHEIMER.A.M.Jr.and
HARPER.A.A.（1972），Reconstitution of
diphtheria toxin from two nontoxic cross−
reacting mutant toxins.，Science175：901−
903）。従つてフラグメントＢをもたないフラグメ
ントＡは細胞外にあつては全く毒性を発揮せず、
その毒性はジフテリア毒素の10^-4以下である。し
かし細胞内では極めて強い毒性を示し、人為的に
フラグメントＡを細胞内に注入すれば、１分子で
その細胞を死に至らしめる（YAMAIZUMI.M.，
MAKEDA.E.，UCHIDA.T.and OKADA.Y.
（1978b），One molecule of diphtheria toxin
fragment Ａ introduced into ａ cell can
kill the cell.，Cell 15：245−250）。フラグメントＡは、下記の反応(1)を触媒して
EF（伸長因子）２を失活させることにより蛋白質
合成を阻害する（HONJO.T.，NISHIZUKA.
Y.，HAYAISHI.O.and KATO.I.（1968），
Diphtheria−toxin−dependent adenosine
diphosphate ribosylation of aminoacyl
transferase and inhibition of protein
synthesis.，J.biol.Chem.243：2553−3555）。 EF2＋NAD⁺→ADP−リボース−EF2 ＋ニコチンアミド＋H⁺ ……(1) 即ち、EF2はリボソーム上で蛋白質合成が行な
われる際、ペプチイデイール tRNAがＡサイト
からＰサイトへ転移してペプチドを伸長させるの
に必須な蛋白質因子であるが、(1)の反応により、
ADP−リボースと共有結合して失活し、このた
め蛋白質合成が阻害されるのである。尚、この反
応は極めて特異性の高い反応であり、EF2以外の
基質は現在のことろ全くみつけられていない。本発明に係る治療剤に使用するジフテリア毒素
フラグメントＡは、既述した様に、ジフテリア毒
素を還元剤とトリプシンで処理し、常法に従つて
フラグメントＢおよびその他の夾雑物から分離す
ることにより得ることができるが、フラグメント
Ａだけを産生するジフテリア変異菌C₇（β22）よ
り、ジフテリア毒素が全く混入していないフラグ
メントＡを得ることもできる（UCHIDA.T.，
KIM.J.，YAMAIZUMI.M.，MIYAKE.Yおよび
OKADA.Y.（1979）：Reconstitution of lipid
vesicles associated with HVJ（Sendai virus）
spikes. Purification and some properties of vesicles
containing nontoxic fragment Ａ of
diphtheria toxin，J.Cell Biol.80：10−20）。こ
の変異菌C₇（β22）は微生物病研究所、菌株保存
施設に保存されており、誰でも入手可能である。
本発明に於いては、ジフテリア毒素自体が治療剤
中に混入する恐れの全くないこの変異菌が産生す
るフラグメントＡを用いるのが好ましい。有膜ウイルス感染細胞とリポソームの融合有膜ウイルスの感染を受けた細胞の膜表面には
脂質の２重層面が露出し、リポソーム（脂質小胞
体）と特異な親和性を示す様になることが知られ
ている。即ち、リポソームは感染および非感染の
両種の細胞に吸着するが、感染細胞に於いては、
この露出した脂質２重層に融合し、これによつて
リポソーム内に封入されていた物質の融合細胞へ
の移動が起こる。本発明者らは、ジフテリア毒素
フラグメントＡをリポソームに封入して動物の脳
内に注入しても、該フラグメントが有膜ウイルス
感染細胞に選択的に導入されることを見い出し
た。本発明に用いるリポソームは主として燐脂質と
コレステロールから調製することができる。燐脂
質としてはレシチンを用いるのが好ましいが、こ
れにフオスフアテイデイール・セリンおよびフオ
スフアテイデイール・エタノールアミンを加えて
もよい。燐脂質とコレステロールの混合割合には
特に制限はなく、その混合物が低温でリポソーム
の形を保つことができる範囲内にあればよい。このリポソームは、更に蛋白質、特に糖蛋白質
を含んでいてもよい。糖蛋白質として好ましいも
のは強い細胞融合能を持つた外膜ウイルスの１
種、HVJ（Hemagglutinating virus of Japan、
センダイウイルス）に由来するHANAと呼ばれ
る糖蛋白質である。HANAは、その赤血球凝集
活性（Hemagglutinating Activity）とノイラミ
ニダーゼ活性（Neuraminidase Activity：糖鎖
末端のシアル酸を切り離す酵素活性）からつけら
れた名称であり、分子量約67000〜69000の糖蛋白
質である。HVJの細胞融合能は、その表面に存
在するこのHANAと、Ｆと呼ばれるもう１つの
糖蛋白質に起因する。Ｆは、その融合（Fusion）
機能によりつけられた名称であり、分子量約
51000〜53000の糖蛋白質である。HANAは、
HVJが細胞と結合して、これと融合する場合の
第１段階の引金として働くのに対し、Ｆは実際に
細胞と融合する時に働く糖蛋白質である。 HVJはマウスに毒性を示すがヒトには毒性を
示さない。また、HANAとＦはともに動物に対
して全く毒性を示さない。従つてHANAは、本
発明で用いるリポソームの構成成分として安心し
て使用し得ることが理解されよう。この様な糖蛋白質の使用量は、脂質に対して０
〜10⁵HAU／mg（脂質）であることが好ましい。フラグメントＡを封入したリポソームの調製糖蛋白質を構成成分として含まないフラグメン
トＡ含有リポソームの調製は、燐脂質、コレステ
ロールおよびフラグメントＡの混液を、水溶媒
中、十分な量のコール酸および非イオン系界面活
性剤の存在下でよく混合し、次いで透析、ゲル濾
過、吸着などによつて界面活性剤を除去するとい
う通常のリポソーム形成手段により行なうことが
できる。形成したリポソームに封入されなかつた
フラグメントＡは、ゲル濾過により分離すること
ができる。好適なゲル濾過剤はBiogel A50m
（Bio Rad社製）である。糖蛋白質としてHANAを添加する場合は、上
記の混液にHANAおよび界面活性剤、例えば
NP40（ポリオキシエチレン・オクチルフエニル
エーテル、商品名Nonidet P40、オランダ、シ
エル社製）またはオクチルグルコシドを加えて可
溶化し、次いで透析により界面活性剤を除去す
る。これらの界面活性剤を用いた場合は、通常の
透析チユーブを使用することができるので便利で
ある。界面活性剤を除去した後、上記と同様にゲ
ル濾過して、封入されなかつたフラグメントＡを
除去し、次いで蔗糖密度勾配遠心法でリポソーム
に組込まれなかつたHANAをとり除く。上記の方法で用いられるフラグメントＡの量
は、2μｇ〜３mg／mg（脂質）とするのが好まし
い。以上述べた方法で調製したジフテリア毒素フラ
グメントＡ含有リポソームは、そのまま、あるい
は適当な賦形剤を加えて製剤化し、ヒトおよび動
物の脳内に注入することができる。本発明のウイ
ルス性脳炎治療剤とは、上記のリポソーム自体お
よびこれに賦形剤を加えて製剤化したものの両者
をさすものとする。かかる治療剤の１回の投与量
は、フラグメントＡに換算して0.1μｇ〜１mg、望
ましくは0.1μｇ〜10μｇである。本発明に係るウイルス性脳炎治療剤を脳内に注
入することにより、フラグメントＡが感染細胞内
に導入されると、細胞内の全ての蛋白質合成が阻
害され、結果的に感染細胞が破壊されるが、重要
なことは、同時にウイルス増殖が阻止され、感染
の拡大が完全に防止されることである。従つて、
本発明に係る治療剤は、ヒトおよび動物の有膜ウ
イルスによる脳炎、特に亜急性硬化性脳炎、麻疹
脳炎およびヘルペス脳炎などの治療において極め
て優れた効果を発揮する。本発明に係る治療剤は、(イ)非感染の正常細胞に
悪影響を与えることがない、(ロ)ヒトおよび動物の
両者に適用できる、(ハ)有膜ウイルスが原因となる
種々のウイルス性脳炎に対し有効である、(ニ)副作
用の危険性が極めて低い、などの特徴を持つた優
れた治療剤である。以下に、実験例および実施例をあげて本発明の
実施態様を具体的に示す。実験例１ジフテリア毒素フラグメントＡの調製ジフテリア変異菌C₇（β22）を培養した後遠心
し、菌を除いた培養上清を得る。この培養上清に
硫酸アンモニウムを加えてフラグメントＡを沈降
して集め、透析して硫酸アンモニウムを除き、
DEAEセルロースに吸着させてNaClの濃度勾配
で抽出する。これでほとんど夾雑物を含まないフ
ラグメントＡを得ることができるが、さらに
G150を用いてゲル濾過し、最終精製標品を得る。
５の培養上清より約20mgの精製標品を得ること
ができる。実験例２ジフテリア毒素フラグメントＡ含有リ
ポソームの調製レシチンとコレステロールの５対１（wt）混合
物を、最終濃度が２mg／mlとなるように0.01Mト
リス・バツフアー（PH7.5）に加える。これにフ
ラグメントＡを１mg〜500μｇ／mlとなるように
添加する。以上の混合物をよく撹拌し、NP40を
最終濃度が0.5％となる様に加える。NP40の代り
にアルキルフエノール・ポリオキシエチレンエー
テル（Triton ×100：Rohm＆Haas社製）を加
えてもよい。NP40およびTriton ×100はいず
れも中性界面活性剤である。これら中性界面活性
剤を加えると脂質が可溶化し透明になる。NP40
を用いた場合は、透析チユーブSpectrapore
＃２（Spectrum Medical Industries，INC）に
入れて透析し、NP40を除く。Triton ×100の
場合はBiobeads SM2（Bio Rad社製）を加えて
撹拌し、Biobeads にTriton ×100を吸着させ
て除く。こうして中性界面活性剤を除くことによ
りリポソームができ上る。このリポソーム中には
フラグメントＡが含まれている。リポソーム内に
含有されなかつたフラグメントＡを除くために
Bio Gel A50m（Bio Rad社製）を用いてリポソ
ームとフラグメントＡに分離する。得られた精製
リポソーム懸濁液はフラグメントＡを２〜5μ
ｇ／mlの割合で含んでいる。実験例３感染に用いるウイルス液の調製亜急性硬化性脳炎（以下、SSPEという）ウイ
ルス（微生物病研究所・菌株保存施設保存株）を
用いた。この株をヒト胎児肺（以下HELという）
細胞で増殖させた。感染HEL細胞を0.25％トリプ
シン液を用いて培養デイツシユから剥離して単個
細胞とし、Eagle氏最小必須培養液（MEM）に
牛胎児血清（FBS）を10％の割合で加えたもの
（以下、MEM−10％FBSという）に細胞濃度１
〜３×10⁶個／mlで浮遊させ、ウイルス液（保存
用）とした。ウイルス液（保存用）は一定量づつ
分液し、液体窒素中（−196℃）に保存した。使
用に当つては、融解した後MEMを用いて遠心洗
浄（1000rpm，５分間、室温）し、適当量の
MEM−３％FBSに再浮遊させた。なお、ウイル
ス液（保存用）の感染価は前もつて感染中心測定
法で測定し、プラーク形成単位（PFU）で表示
した。感染実験に用いた場合には再度測定し、正
確を期した。実施例１４週令の雌性シリアン・ゴールデン・ハムスタ
ー（静岡実験動物農業協同組合産）を１週間管理
飼育した後５週令で使用した。このハムスターをエーテル麻酔した後、ウイル
ス液0.05ml（455PFU）を右大脳半球内に２段針
付注射器で注射することによつて脳内感染を行な
つた。次いで実験例２で得たジフテリア毒素フラグメ
ントＡ含有リポソーム（以下、LIP−Ａという）
を希釈して下記の実施スケジユールに従い、以下
の要領でハムスターに投与した。すなわち、ハムスターをエーテル麻酔後、紫外
線照射によつて殺菌したLIP−Ａ（フラグメント
Ａを１〜2μｇ／mlを含む）の0.05mlを２段針付注
射器で脳内に直接注入した。なお投与したLIP−
Ａは本投与量の100倍量を用いても致死量に至ら
ない。実施スケジユール処置日数Ａ：ウイルス脳内接種Ｂ：LIP−Ａ脳内投与Ｃ：判定ハムスターの脳炎発病の有無により、LIP−Ａ
脳内投与の効果を判定した。結果を表１に示す。

【表】実施例２４週令の雌性ICR系マウス（静岡実験動物農業
協同組合産）を１週間管理飼育した後、５週令で
使用した。マウスをネンブタール麻酔した後、ウイルス液
の0.03ml（120PFU）を右大脳半球内に２段針付
注射器で注射することによつて、脳内感染を行な
つた。次いで以下の実施スケジユールに従い、実
施例１と同様にしてLIP−Ａの投与を行なつた。Ａ：ウイルス脳内接種Ｂ：LIP−Ａ脳内投与Ｃ：脳内感染細胞数の測定 SSPEウイルスに感染したマウスの脳細胞（神
経細胞およびグリア細胞）数を以下に述べる方法
で測定した。すなわち、マウスをエーテル麻酔した後、心採
血によつて屠殺し、脳を無菌的に摘出する。次い
で、小脳を除去した後、ハンクス氏液で３回洗浄
し、外科用ハサミで細切する。これを0.25％トリ
プシン液30mlに浮遊させ、37℃の温水中に15分間
保温した後、ピペツテイング操作によつて単個細
胞を得る。MEM−３％FBSを用いて遠心洗浄し
た後、５mlの培養液に浮遊させ、感染中心測定法
で感染細胞数を測定し、PFUでその数を表示し
た。結果を以下の表２に示す。

【表】 (注) ＊発病
以上の実施例の結果から、本発明に係るジフテ
リア毒素フラグメントＡ含有リポソームは、ウイ
ルス性脳炎に対して発病防止作用および感染防止
作用を有することがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

１ジフテリア毒素フラグメントＡ含有リポソー
ムを主成分とするウイルス性脳炎治療剤。