CN112616829A - 间充质干细胞冻存液、间充质干细胞细胞库及制备方法 - Google Patents
间充质干细胞冻存液、间充质干细胞细胞库及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞冻存液、间充质干细胞细胞库及制备方法，涉及细胞技术领域，本发明提供的间充质干细胞冻存液，包括特定配比的基础培养基、海藻糖、白蛋白、还原剂、脂类、微量元素和冷冻保护剂，其中海藻糖、白蛋白和脂类能够作为冻存液的保护成分，还原剂能够为冻存的细胞提供还原环境，在此基础上加入微量元素，使得本发明提供的间充质干细胞冻存液能够进一步提高间充质干细胞复苏后的活率和正常生长速率。并且，本发明提供的间充质干细胞冻存液化合物成分明确、不含有血清，避免了传统冻存液的动物源性安全问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞冻存液、间充质干细胞细胞库及制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)来源于中胚层组织，属于多能干细胞，其特点是来源广泛、免疫原性低、一定的分化潜能、具有自我更新能力、具有调节免疫的能力，根据其来源主要分为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞等。
目前，间充质干细胞的冻存液，主要为含有牛来源血清成分的5％-20％胎牛血清(FBS)+细胞基础培养基(IDMEM或α-MEM或F12/DMEM)+10％DMSO。DMSO属于冷冻保护剂，可以保护细胞在降温过程中免受晶体物质的伤害，但其含量越高对细胞的毒性作用越大，而FBS为人源细胞引入了动物源的成分，有一定的安全隐患，如引入支原体、牛源致病菌等，并具有批次不稳定性。如果不添加FBS，细胞复苏后活率则大幅度下降。因此，为保证间充质干细胞的安全性及复苏后的活率，有必要开发一种成分明确、不含血清、活率较高的冻存液。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种间充质干细胞冻存液，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种间充质干细胞细胞库。
本发明的第三个目的在于提供上述间充质干细胞细胞库的制备方法。
本发明提供了一种间充质干细胞冻存液，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为80％-95％的基础培养基、1mM-100mM的海藻糖、0.01μg/L-10g/L的白蛋白、0.1μM-100μM的还原剂、体积比为0.01％-1％的脂类、质量百分比含量为0.00001％-1％的微量元素和体积比为2.5％-15％的冷冻保护剂。
进一步的，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为85％-90％的基础培养基、10mM-50mM的海藻糖、0.1g/L-10g/L的白蛋白、1μM-100μM的还原剂、体积比为0.1％-1％的脂类、质量百分比含量为0.00001％-0.0001％的微量元素和体积比为2.5％-12.5％的冷冻保护剂；
优选地，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为86％的基础培养基、30mM的海藻糖、1g/L的白蛋白、55μM的还原剂、体积比为0.1％的脂类、质量百分比含量为0.00004％的微量元素和体积比为10％的冷冻保护剂。
进一步的，所述基础培养基包括IDMEM、α-MEM、F12/DMEM、high glucose DMEM或low glucose DMEM。
进一步的，所述脂类包括：花生四烯酸、胆固醇、麻油酸、次亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、次棕榈酸或硬脂酸中的一种或多种；
优选地，所述脂类包括：1nM-1M花生四烯酸、1nM-1M胆固醇、1nM-1M亚麻油酸、1nM-1M次亚麻酸、1nM-1M肉豆蔻酸、1nM-1M油酸、1nM-1M棕榈酸、1nM-1M次棕榈酸或1nM-1M硬脂酸中的一种或多种；
优选地，所述脂类包括：50μM花生四烯酸、50μM胆固醇、50μM亚麻油酸、50μM次亚麻酸、50μM肉豆蔻酸、50μM油酸、50μM棕榈酸、50μM次棕榈酸或50μM硬脂酸中的一种或多种。
进一步的，所述微量元素包括：CuSO4、ZnSO4、亚硒酸钠或柠檬酸铁中的一种或多种；
优选地，所述微量元素包括：0.1μg/L-100g/L CuSO4、0.1μg/L-100g/L ZnSO4、0.1μg/L-100g/L亚硒酸钠或0.1μg/L-100g/L柠檬酸铁中的一种或多种；
优选地，所述微量元素包括：5mg/L CuSO4、5mg/L ZnSO4、5mg/L亚硒酸钠或5mg/L柠檬酸铁中的一种或多种。
进一步的，所述白蛋白包括人血清白蛋白；
优选地，所述还原剂包括β-巯基乙醇；
优选地，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜。
进一步的，所述间充质干细胞冻存液还包括营养物质；
优选地，所述营养物质包括：胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、维生素C、维生素E、孕酮、腐胺或血清素中的一种或多种；
优选地，所述营养物质包括：0.1μg/L-100g/L胰岛素、0.1μg/L-100g/L转铁蛋白、0.01μg/L-1g/L氢化可的松、0.01μg/L-1g/L维生素C、0.01μg/L-1g/L维生素E、0.01μg/L-1g/L孕酮、0.01μg/L-1g/L腐胺或0.01μg/L-1g/L血清素中的一种或多种；
优选地，所述营养物质包括：100mg/L胰岛素、100mg/L转铁蛋白、0.5μg/L氢化可的松、50mg/L维生素C、70mg/L维生素E、5μg/L孕酮、10mg/L腐胺或2mg/L血清素中的一种或多种。
进一步的，所述间充质干细胞冻存液还包括生长因子；
优选地，所述生长因子包括：人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板衍生生长因子或人胰岛素样生长因子中的一种或多种；
优选地，所述生长因子包括：1ng/mL-100mg/mL人表皮生长因子、1ng/mL-100mg/mL人成纤维细胞生长因子、1ng/mL-100mg/mL人血小板衍生生长因子或1ng/mL-100mg/mL人胰岛素样生长因子中的一种或多种；
优选地，所述生长因子包括：50ng/mL人表皮生长因子、50ng/mL人成纤维细胞生长因子、50ng/mL人血小板衍生生长因子或50ng/mL人胰岛素样生长因子中的一种或多种。
另外，本发明还提供了一种间充质干细胞细胞库，所述间充质干细胞细胞库包括间充质干细胞和上述的间充质干细胞冻存液。
进一步的，包括使用上述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞后，程序降温至-75～-85℃后转入液氮保存，得到所述间充质干细胞细胞库；
优选地，所述间充质干细胞细胞库的制备方法如下步骤：
(i)用DPBS洗涤间充质干细胞；
(ii)用酶消化间充质干细胞；
(iii)终止消化后，离心收集间充质干细胞；
(iv)用上述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞；
(v)程序降温至-80℃，转入液氮可短期、长期保存，得到间充质干细胞库。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明提供的间充质干细胞冻存液，包括特定配比的基础培养基、海藻糖、白蛋白、还原剂、脂类、微量元素和冷冻保护剂，其中海藻糖、白蛋白和脂类能够作为冻存液的保护成分，还原剂能够为冻存的细胞提供还原环境，在此基础上加入微量元素，使得本发明提供的间充质干细胞冻存液能够进一步提高间充质干细胞复苏后的活率和正常生长速率。并且，本发明提供的间充质干细胞冻存液不含有FBS，避免了传统冻存液的动物源性安全问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1星期后的间充质干细胞细胞复苏后在显微镜下的生长情况，scalbar＝50μM；
图1B为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1星期后的间充质干细胞细胞复苏后的活率比较；
图1C为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1星期后的间充质干细胞细胞复苏后的活细胞回收率比较；
图1D为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1星期后的间充质干细胞细胞复苏后，用CCK8检测增殖情况比较；
图1E为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1星期后的间充质干细胞细胞复苏后连续三代细胞增殖倍数比较；
图2A为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1个月后的间充质干细胞细胞复苏后在显微镜下的生长情况，scalbar＝50μM；
图2B为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1个月后的间充质干细胞细胞复苏后的活率比较；
图2C为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1个月后的间充质干细胞细胞复苏后的活细胞回收率比较；
图2D为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1个月后的间充质干细胞细胞复苏后，用CCK8检测增殖情况比较；
图2E为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存1个月后的间充质干细胞细胞复苏后连续三代细胞增殖倍数比较；
图3A为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存4个月后的间充质干细胞细胞复苏后在显微镜下的生长情况，scalbar＝50μM；
图3B为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存4个月后的间充质干细胞细胞复苏后的活率比较；
图3C为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存4个月后的间充质干细胞细胞复苏后的活细胞回收率比较；
图3D为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存4个月后的间充质干细胞细胞复苏后，用CCK8检测增殖情况比较；
图3E为本发明实验例1提供的用实施例7与对比例3的冻存液冻存4个月后的间充质干细胞细胞复苏后连续三代细胞增殖倍数比较。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于传统FBS的冻存液含有FBS，有动物源性的安全性问题，本发明提供了一种成分明确、不含有FBS的间充质干细胞冻存液，包括：体积比为85％-95％的基础培养基、1mM-100mM的海藻糖、0.01μg/L-10g/L的白蛋白、0.1μM-100μM的还原剂、体积比为0.01％-1％的脂类、质量百分比含量为0.01％-1％的微量元素和体积比为2.5％-15％的冷冻保护剂。
本发明提供的间充质干细胞冻存液中，海藻糖、白蛋白和脂类能够作为冻存液的保护成分，还原剂能够为冻存的细胞提供还原环境，在此基础上加入微量元素，使得本发明提供的间充质干细胞冻存液能够进一步提高间充质干细胞复苏后的活率和正常生长速率。并且，本发明提供的间充质干细胞冻存液不含有FBS，避免了传统冻存液的动物源性安全问题。
其中，基础培养基中含有细胞生长繁殖所必须的基本营养物质，其含量例如可以为，但不限于85％、88％、90％、92％或95％。作为优选，基础培养基可以选自IDMEM、α-MEM、F12/DMEM、high glucose DMEM或low glucose DMEM。
海藻糖能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而对冻存细胞起到良好的保护作用。其含量例如可以为，但不限于1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。
白蛋白作为保护剂，其含量例如可以为，但不限于0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、0.01g/L、0.1g/L、1g/L或10g/L。作为优选，白蛋白可以为人血清白蛋白。
在某些细胞生长分裂的过程中，会向培养基中释放氧自由基。氧自由基积累到一定程度的时候，会破坏细胞膜和细胞器膜，从而导致细胞死亡，达不到很高的密度。在本发明提供的间充质干细胞冻存液中加入还原剂，能够中和掉细胞培养基中积累的氧自由基，从而使得细胞分裂到很高的密度而不死亡。还原剂的含量例如可以为，但不限于0.1μM、1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM。作为优选，所述还原剂包括β-巯基乙醇。
脂类的含量例如可以为，但不限于0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。作为优选，脂类可以选自花生四烯酸、胆固醇、麻油酸、次亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、次棕榈酸或硬脂酸中的一种或多种。上述脂类的使用浓度可以为：1nM-1M花生四烯酸、1nM-1M胆固醇、1nM-1M亚麻油酸、1nM-1M次亚麻酸、1nM-1M肉豆蔻酸、1nM-1M油酸、1nM-1M棕榈酸、1nM-1M次棕榈酸或1nM-1M硬脂酸。当选择浓度为50μM花生四烯酸、50μM胆固醇、50μM亚麻油酸、50μM次亚麻酸、50μM肉豆蔻酸、50μM油酸、50μM棕榈酸、50μM次棕榈酸或50μM硬脂酸时，间充质干细胞冻存液的效果更好。
微量元素的含量例如可以为，但不限于0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。作为优选，微量元素可以选自CuSO4、ZnSO4、亚硒酸钠或柠檬酸铁中的一种或多种。上述微量元素的使用浓度可以为：0.1μg/L-100g/L CuSO4、0.1μg/L-100g/L ZnSO4、0.1μg/L-100g/L亚硒酸钠或0.1μg/L-100g/L柠檬酸铁。当选择浓度为5mg/L CuSO4、5mg/L ZnSO4、5mg/L亚硒酸钠或5mg/L柠檬酸铁时，间充质干细胞冻存液的效果更好。
冷冻保护剂的含量例如可以为，但不限于2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％或15％。作为优选，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜(DMSO)。
在一些优选的实施方式中，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为86％的基础培养基、30mM的海藻糖、1g/L的白蛋白、55μM的还原剂、体积比为0.1％的脂类、质量百分比含量为0.00004％的微量元素和体积比为10％的冷冻保护剂。
通过对本发明间充质干细胞冻存液中各组分的用量进行进一步的调整和优化，能够使得本发明提供的冻存液在平衡成本的基础上，取得更好的冻存效果。
为了能够进一步提升间充质干细胞复苏后的活率和正常生长速率，在本发明提供的间充质干细胞冻存液优选添加营养物质和/或生长因子。
作为优选，所述营养物质包括：胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、维生素C、维生素E、孕酮、腐胺或血清素中的一种或多种。上述营养物质的使用浓度可以为：0.1μg/L-100g/L胰岛素、0.1μg/L-100g/L转铁蛋白、0.01μg/L-1g/L氢化可的松、0.01μg/L-1g/L维生素C、0.01μg/L-1g/L维生素E、0.01μg/L-1g/L孕酮、0.01μg/L-1g/L腐胺或0.01μg/L-1g/L血清素。当选择浓度为100mg/L胰岛素、100mg/L转铁蛋白、0.5μg/L氢化可的松、50mg/L维生素C、70mg/L维生素E、5μg/L孕酮、10mg/L腐胺或2mg/L血清素时，间充质干细胞冻存液的效果更好。
作为优选，所述生长因子包括：人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板衍生生长因子或人胰岛素样生长因子中的一种或多种。上述生长因子的使用浓度可以为：1ng/mL-100mg/mL人表皮生长因子、1ng/mL-100mg/mL人成纤维细胞生长因子、1ng/mL-100mg/mL人血小板衍生生长因子或1ng/mL-100mg/mL人胰岛素样生长因子。当选择浓度为50ng/mL人表皮生长因子、50ng/mL人成纤维细胞生长因子、50ng/mL人血小板衍生生长因子或50ng/mL人胰岛素样生长因子时，间充质干细胞冻存液的效果更好。
根据本发明的第二个方面，本发明还提供了一种间充质干细胞细胞库，包括间充质干细胞和上述的间充质干细胞冻存液。
基于本发明提供的间充质干细胞冻存液的有益效果，本发明提供的间充质干细胞细胞库能够用于短期或长期保存间充质干细胞或建立间充质干细胞库，且在间充质干细胞复苏后，也具有较高的活率和正常的生长速率。
根据本发明的第三个方面，本发明还提供了上述间充质干细胞细胞库的制备方法，包括使用上述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞后，程序降温至-75～-85℃后转入液氮保存，得到所述间充质干细胞细胞库。
该方法工艺简单、操作方便，无需特定或昂贵的设备即可完成。
在一些具体的实施方式中，所述间充质干细胞细胞库的制备方法如下步骤：
(i)用DPBS洗涤间充质干细胞；
(ii)用酶消化间充质干细胞；
(iii)终止消化后，离心收集间充质干细胞；
(iv)用上述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞；
(v)程序降温至-80℃，转入液氮可短期、长期保存，得到间充质干细胞库。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种间充质干细胞冻存液，包括：
体积比为86％的基础培养基、30mM的海藻糖、1g/L的白蛋白、55μM的还原剂、体积比为0.1％的脂类、质量百分比含量为0.00004％的微量元素和体积比为10％的冷冻保护剂。
所述基础培养基为IDMEM；
所述白蛋白为人血清白蛋白；
所述还原剂为β-巯基乙醇；
所述脂类为50μM花生四烯酸、50μM胆固醇、50μM亚麻油酸、50μM次亚麻酸、50μM肉豆蔻酸、50μM油酸、50μM棕榈酸、50μM次棕榈酸和50μM硬脂酸；
所述微量元素为5mg/L CuSO4、5mg/L ZnSO4、5mg/L亚硒酸钠和5mg/L柠檬酸铁；
所述冷冻保护剂为DMSO。
实施例2
本实施例提供了一种间充质干细胞冻存液，包括：
体积比为80％的基础培养基、100mM的海藻糖、0.01g/L的白蛋白、100μM的还原剂、体积比为0.01％的脂类、质量百分比含量为1％的微量元素和体积比为2.5％的冷冻保护剂。
所述基础培养基为IDMEM；
所述白蛋白为人血清白蛋白；
所述还原剂为β-巯基乙醇；
所述脂类为1M花生四烯酸、1nM胆固醇、1M亚麻油酸、1nM次亚麻酸、1M肉豆蔻酸、1nM油酸、1M棕榈酸、1nM次棕榈酸和1M硬脂酸；
所述微量元素为0.1μg/L CuSO4、100g/L ZnSO4、0.1μg/L亚硒酸钠和100g/L柠檬酸铁；
所述冷冻保护剂为DMSO。
实施例3
本实施例提供了一种间充质干细胞冻存液，包括：
体积比为95％的基础培养基、1mM的海藻糖、10g/L的白蛋白、0.1μM的还原剂、体积比为1％的脂类、质量百分比含量为0.00001％的微量元素和体积比为15％的冷冻保护剂。
所述基础培养基为IDMEM；
所述白蛋白为人血清白蛋白；
所述还原剂为β-巯基乙醇；
所述脂类为1nM花生四烯酸、1M甘油酸酯、1nM亚麻油酸、1M次亚麻酸、1nM肉豆蔻酸、1M油酸、1nM棕榈酸、1M次棕榈酸和1nM硬脂酸；
所述微量元素为0.1μg/L CuSO4、100g/L ZnSO4、0.1μg/L亚硒酸钠和100g/L柠檬酸铁；
所述冷冻保护剂为DMSO。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，还包括营养物质和生长因子。
所述营养物质包括：100mg/L胰岛素、100mg/L转铁蛋白、0.5μg/L氢化可的松、50mg/L维生素C、70mg/L维生素E、5μg/L孕酮、10mg/L腐胺和2mg/L血清素；
所述生长因子包括：50ng/mL人表皮生长因子、50ng/mL人成纤维细胞生长因子、50ng/mL人血小板衍生生长因子和50ng/mL人胰岛素样生长因子。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于，冷冻保护剂的体积比为5％。
对比例1
本对比例提供了一种间充质干细胞冻存液，与实施例1的区别在于仅包括：体积比为86％的基础培养基、30mM的海藻糖、4g/L的白蛋白、55μM的还原剂、体积比为0.1％的脂类和质量百分比含量为0.00004％的微量元素。
对比例2
本对比例提供了一种间充质干细胞冻存液，与实施例1的区别在于，包括：75％基础培养基、200mM海藻糖、0.005μg/L白蛋白、200μM还原剂、0.005％脂类、2％微量元素和0.5％冷冻保护剂。
对比例3
传统的FBS(gibco)冻存液。
实验例1
分别使用本发明实施例1-5和对比例1-3提供的间充质干细胞冻存液将3支来源不同的人脐带间充质干细胞(1组、2组、3组)冻存一个星期后再复苏细胞，检测复苏后间充质干细胞的活率，结果如下表所示：
其中，选择效果较为突出的实施例4(C1冻存液组，简称C1)与对比例3(FBS冻存液，简称FBS)进行进一步的比较，结果如图1A、图1B、图1C、图1D和图1E所示。从结果中可以看出，间充质干细胞形态、活率、活细胞回收率、增殖情况及连续三代的增殖情况与FBS组无明显差异。
实验例2
本发明实施例4提高的间充质干细胞冻存液与实施例3提供的传统FBS冻存液将3支来源不同的人脐带间充质干细胞冻存一个月后再复苏细胞，结果如图2A、图2B、图2C、图2D和图2E所示。从结果中可以看出，间充质干细胞形态、活率、活细胞回收率、增殖情况及连续三代的增值情况与FBS组无明显差异。
实验例3
本发明实施例7提高的间充质干细胞冻存液与实施例3提供的传统FBS冻存液将3支来源不同的人脐带间充质干细胞冻存四个月后再复苏细胞，结果如图3A、图3B、图3C、图3D和图3E所示。从结果中可以看出，间充质干细胞形态、活率、活细胞回收率、增殖情况及连续三代的增值情况与FBS组无明显差异。
上述结果为用商品化无血清培养基培养的三株P4代人脐带间充质干细胞用本发明冻存液和传统FBS冻存液在液氮冻存不同时间(分别为1个星期、1个月、4个月)后复苏，人脐带间充质干细胞的存活率、活细胞回收率、增殖情况以及复苏之后连续三代的细胞增殖情况对比。结果显示用本发明冻存液将3支来源不同的人脐带间充质干细胞分别冻存1个星期、1个月、4个月，再复苏细胞，间充质干细胞活率为88.89％±8.81％。且本发明冻存液与传统FBS冻存液相比冻存后再复苏人脐带间充质干细胞，间充质干细胞活率、活细胞回收率、增殖情况及连续三代的增值情况无明显差异。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为80％-95％的基础培养基、1mM-100mM的海藻糖、0.01μg/L-10g/L的白蛋白、0.1μM-100μM的还原剂、体积比为0.01％-1％的脂类、质量百分比含量为0.00001％-1％的微量元素和体积比为2.5％-15％的冷冻保护剂。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为85％-90％的基础培养基、10mM-50mM的海藻糖、0.1g/L-10g/L的白蛋白、1μM-100μM的还原剂、体积比为0.1％-1％的脂类、质量百分比含量为0.00001％-0.0001％的微量元素和体积比为2.5％-12.5％的冷冻保护剂；
优选地，所述间充质干细胞冻存液包括：体积比为86％的基础培养基、30mM的海藻糖、1g/L的白蛋白、55μM的还原剂、体积比为0.1％的脂类、质量百分比含量为0.00004％的微量元素和体积比为10％的冷冻保护剂。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基包括IDMEM、α-MEM、F12/DMEM、high glucose DMEM或low glucose DMEM。
4.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述脂类包括：花生四烯酸、胆固醇、麻油酸、次亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、次棕榈酸或硬脂酸中的一种或多种；
优选地，所述脂类包括：1nM-1M花生四烯酸、1nM-1M胆固醇、1nM-1M亚麻油酸、1nM-1M次亚麻酸、1nM-1M肉豆蔻酸、1nM-1M油酸、1nM-1M棕榈酸、1nM-1M次棕榈酸或1nM-1M硬脂酸中的一种或多种；
优选地，所述脂类包括：50μM花生四烯酸、50μM胆固醇、50μM亚麻油酸、50μM次亚麻酸、50μM肉豆蔻酸、50μM油酸、50μM棕榈酸、50μM次棕榈酸或50μM硬脂酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述微量元素包括：CuSO4、ZnSO4、亚硒酸钠或柠檬酸铁中的一种或多种；
优选地，所述微量元素包括：0.1μg/L-100g/L CuSO4、0.1μg/L-100g/L ZnSO4、0.1μg/L-100g/L亚硒酸钠或0.1μg/L-100g/L柠檬酸铁中的一种或多种；
优选地，所述微量元素包括：5mg/L CuSO4、5mg/L ZnSO4、5mg/L亚硒酸钠或5mg/L柠檬酸铁中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述白蛋白包括人血清白蛋白；
优选地，所述还原剂包括β-巯基乙醇；
优选地，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜。
7.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液还包括营养物质；
优选地，所述营养物质包括：胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、维生素C、维生素E、孕酮、腐胺或血清素中的一种或多种；
优选地，所述营养物质包括：0.1μg/L-100g/L胰岛素、0.1μg/L-100g/L转铁蛋白、0.01μg/L-1g/L氢化可的松、0.01μg/L-1g/L维生素C、0.01μg/L-1g/L维生素E、0.01μg/L-1g/L孕酮、0.01μg/L-1g/L腐胺或0.01μg/L-1g/L血清素中的一种或多种；
优选地，所述营养物质包括：100mg/L胰岛素、100mg/L转铁蛋白、0.5μg/L氢化可的松、50mg/L维生素C、70mg/L维生素E、5μg/L孕酮、10mg/L腐胺或2mg/L血清素中的一种或多种。
8.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液还包括生长因子；
优选地，所述生长因子包括：人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板衍生生长因子或人胰岛素样生长因子中的一种或多种；
优选地，所述生长因子包括：1ng/mL-100mg/mL人表皮生长因子、1ng/mL-100mg/mL人成纤维细胞生长因子、1ng/mL-100mg/mL人血小板衍生生长因子或1ng/mL-100mg/mL人胰岛素样生长因子中的一种或多种；
优选地，所述生长因子包括：50ng/mL人表皮生长因子、50ng/mL人成纤维细胞生长因子、50ng/mL人血小板衍生生长因子或50ng/mL人胰岛素样生长因子中的一种或多种。
9.一种间充质干细胞细胞库，其特征在于，所述间充质干细胞细胞库包括间充质干细胞和权利要求1-8任一项所述的间充质干细胞冻存液。
10.权利要求9所述的间充质干细胞细胞库的制备方法，其特征在于，包括使用权利要求1-8任一项所述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞后，程序降温至-75～-85℃后转入液氮保存，得到所述间充质干细胞细胞库；
优选地，所述间充质干细胞细胞库的制备方法如下步骤：
(i)用DPBS洗涤间充质干细胞；
(ii)用酶消化间充质干细胞；
(iii)终止消化后，离心收集间充质干细胞；
(iv)用权利要求1-8任一项所述的间充质干细胞冻存液重悬间充质干细胞；
(v)程序降温至-80℃，转入液氮可短期、长期保存，得到间充质干细胞库。
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