KR20160050179A

KR20160050179A - 하이퍼타우린을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법

Info

Publication number: KR20160050179A
Application number: KR1020140147617A
Authority: KR
Inventors: 류범용; 하승정
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-28
Filing date: 2014-10-28
Publication date: 2016-05-11

Abstract

본 발명은 동결보존액을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하이퍼타우린을 포함하는 동결보존액으로 정원줄기세포를 동결시키는 정원줄기세포의 동결보존 방법과 하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 정원줄기세포 동결보존 방법을 따르면, 동결보존 후에도 증식력과 미토콘드리아 활성이 우수한 정원줄기세포를 제공할 수 있는 효과가 있으므로, 효율적으로 정원줄기세포를 동결보존할 수 있다는 장점이 있다.

Description

하이퍼타우린을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법{METHOD OF CRYOPRESERVATION OF SPERMATOGONIAL STEM CELLS USING HYPOTAURINE}

본 발명은 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높이기 위하여 하이퍼타우린(hypotaurine)을 포함하는 동결보존액으로 정원줄기세포를 동결시키는 동결보존 방법과 하이퍼타우린(hypotaurine)을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다.

정원줄기세포(spermatogonial stem cell)는 남성의 일생 전반에 거쳐 일어나는 정자형성과정(spermatogenesis)의 토대가 되는 성체 줄기세포로서, 남성의 유전정보를 전달하는 생식선 줄기세포이다. 동물의 정소 내 정원줄기세포는 전체 정소세포군 중 극소수만이 존재하는 것으로 알려져 있지만 이론상으로 하나의 정원줄기세포는 4096개의 정자를 만들어 낼 수 있는 높은 생산성을 지닌 세포이다. 더불어 정원줄기세포는 자가 재생(self-renewal) 능력을 통하여 정소 내 적절한 수를 유지하며, 최종적으로 정자를 생산하는 분화(differentiation) 능력을 통하여 일생 동안 남성의 생식능력을 유지하는데 원천이 되는 세포이다. 따라서, 정원줄기세포의 동결보존은 암 치료, 화학적 치료 등과 같이 정자형성과정을 일시적 혹은 영구적으로 정지시키는 외부 요인들에 의해 발생하는 남성불임 치료에 필수적이다.

정원줄기세포의 동결보존에는 일반적으로 완만동결-급속융해법(Slow freezing-rapid thawing)이 활용되고 있지만, 이러한 동결보존 방법은 미토콘드리아 기능 이상, DNA 절편화(DNA fragmentation), 과도한 활성산소 발생을 통한 산화적 스트레스(Oxidative stress), 동결-융해 후 세포자연사(Apoptosis) 유도, 및 삼투압 스트레스(Osmotic stress) 등과 같은 동결 상해(Cryo injury)를 유발한다는 문제점이 있다. 동결-융해 과정에서 발생하는 비정상적 활성산소는 세포에 산화적 스트레스를 줌으로서 DNA 절편화와 같은 세포의 치명적 손상을 유발하거나 세포자연사를 유도한다. 활성산소는 크게 슈퍼옥사이드(O₂^-), 과산화수소(H₂0₂), 수산화 라디칼(·OH)이 있는데, 각각의 활성산소는 여러 항산화제 또는 항산화 효소 통해 제거되거나 물로 전환된다.

또한, 종래 방법들은 체세포 동결 보존 기법과 유사한 방법을 사용했다는 한계점을 지니고 있다. 더욱이, 정원줄기세포에 대한 동결 보존의 효과를 직접적으로 평가하거나 생식세포 동결 보존을 최적화하기 위한 시도는 많이 이루어지지 않은 실정이다.

따라서, 종래기술의 문제점들을 해결하기 위하여 동결-상해를 감소시킨 효율적인 정원줄기세포 동결보존 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 보완하기 위해 안출된 것으로, 하이퍼타우린을 포함하는 동결보존액으로 정원줄기세포를 동결시키는 동결보존 방법과 하이퍼타우린을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물의 제공을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 동결보존액을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법으로서, 하이퍼타우린을 포함한 동결보존액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 동결보존 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 동결보존액은 3.5~14mM 농도의 하이퍼타우린을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 동결보존액은 FBS 5~20%(v/v), DMSO 5~20%(v/v)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 동결보존액은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline) 또는 MEM-α(Minimum essential medium alpha) 액체배지인 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 동결보존액을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 보존액은 하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 동결보존액은 FBS(fetal bovine serum) 5~20%(v/v), 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 5~20%(v/v)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 동결보존액은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline) 또는 MEM-α(Minimum essential medium alpha)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 동결보존 후에도 증식력과 미토콘드리아 활성이 우수한 정원줄기세포를 제공할 수 있는 효과가 있으므로, 효율적인 동결보존을 통한 우수종축의 형질 보존, 인간 불임치료, 세포치료제 등과 같은 분야의 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 정원줄기세포의 동결 보존에 대한 항산화제 및 세포자연사 억제제의 효과를 확인하기 위하여 동결-융해 후 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 정원줄기세포의 동결 보존에 대한 항산화제 및 세포자연사 억제제의 효과를 확인하기 위하여 동결-융해 후 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 동결-융해 후 증식능력을 알아보기 위하여 정상적인 germ cell colony(도 3A)와 생식세포 발현(도 3B)을 관찰한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 동결보존 효율을 확인하기 위하여 정원줄기세포의 미토콘드리아 활성을 통한 ATP양을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 Trehalose-Hypotaurine 복합 동결 보존제의 정원줄기세포 동결 보존 효율을 확인하기 위하여 회수율과 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 Z-VAD-fmk, Trehalose, 및 Hypotaurine 복합 동결 보존제의 정원줄기세포 동결 보존 효율을 확인하기 위하여 회수율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 Z-VAD-fmk, Trehalose, 및 Hypotaurine 복합 동결 보존제의 정원줄기세포 동결 보존 효율을 확인하기 위하여 증식률을 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 종래 동결보존 방법의 효율에 대한 문제점을 해결하기 위하여 하이퍼타우린을 포함한 동결보존액을 사용하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포 동결보존 방법과 동결보존액을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 보존액은 하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 발명하였다. 또한, 상기 동결보존 방법이 정원줄기세포의 동결보존 효율을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에서는 생쥐 정소로부터 정원줄기세포를 회수하고(실시예 1-1 참조), 회수된 고순도의 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하였으며(실시예 1-2 참조), 회수된 정원줄기세포를 하이퍼타우린이 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존 하였다(실시예 1-3 참조). 또한, 동결-융해 후 정원줄기세포의 보존 효율을 측정하기 위해 회수율, 증식률, 및 미토콘드리아 활성을 확인하였다(실시예 2-1 및 실시예 2-2 참조). 이에 더하여, Trehalose-Hypotaurine 복합 동결 보존제와 Z-VAD-fmk, Trehalose, 및 Hypotaurine 복합 동결 보존제의 정원줄기세포 동결 보존 효율을 측정하기 위해 회수율과 증식률을 확인하였다(실시예 2-3 및 실시예 2-4 참조). 그 결과, 하이퍼타우린을 이용한 동결보존액이 동결보존 효율을 증진할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기와 같이 하이퍼타우린을 포함하는 동결보존액으로 동결시키는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 동결보존액은 3.5~14mM 농도의 하이퍼타우린을 포함할 수 있고, 바람직하게는 14mM 농도의 하이퍼타우린을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 동결보존액은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline) 또는 MEM-α(Minimum essential medium alpha)일 수 있고, 바람직하게는 FBS 5~20%(v/v), DMSO 5~20%(v/v)가 포함된 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 동물세포배양배지를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공할 수 있다.

a) 포유류의 정소를 효소처리 함으로써 정원줄기세포를 회수하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계의 회수된 정원줄기세포를 하이퍼타우린이 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존하는 단계.

본 발명에서 상기 b) 단계의 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외 배양기에서 배양하는 동결보존 방법일 수 있고, 성장인자는 GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor, 신경영양인자), GFRα1(soluble GDNF receptor family α1), bFGF(basic fibroblast growth factor, 섬유아세포 성장인자)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 b) 단계의 회수는 트립신 처리를 통해서 단일세포로 회수하는 동결보존 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 더하여, 본 발명은 동결보존액을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 보존액은 하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험방법

본 실시예에서는 생식선줄기세포의 효율적인 동결보존법 개발을 위하여 관리와 정소세포군의 회수가 용이한 생쥐를 대상 동물로 선정하였고, 형광발현 단백질(green fluorescent protein, GFP)유전자를 지닌 C57BL/6-TgEGFP(C57GFP)종의 정원줄기세포를 실험의 대상으로 설정하였다.

1-1. 생쥐 정소로부터 정원줄기세포의 회수

생후 6~8일령의 C57GFP생쥐로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출한 후, 적출된 정소의 백막을 제거하였고, 정소 조직을 trypsin-EDTA와 DNaseⅠ등의 효소들을 복합 처리하는 방법으로 정소로부터 정원줄기세포가 포함된 단일 세포들을 분리하였다. 분리된 단일세포들을 다음 단계의 처리 전까지 세포부유액에 10% 우태아혈청을 첨가한 후, pore size가 40μm인 nylon mesh에 통과시켜 잔여 정소조직과 세포 덩어리들을 제거하였고, 이후 30% Percoll 층을 이용한 원심분리(4℃, 600g, 10분)를 통하여 정소세포를 분리하였다. 분리된 세포들은 PBS-S [DPBS에 1mM Sodium pyruvate, 5.6 mM D-glucose, 10 mM Hepes, 50 units/ml penicillin and 50 ㎍/ml streptomycin, 1% FBS 첨가]로 2회 washing한 후, anti-Thy-1-antibody microbeads가 피복된 magnetic microbead와 MACS(Magnetic activated cell sorting)기법을 이용하여 고순도 정원줄기세포를 회수하였다.

1-2. 정원줄기세포의 체외배양 후 회수

상기 실시예 1-1에서 회수된 고순도 정원줄기세포의 대량증식을 위해 체외배양을 실시하였다. 회수된 정원줄기세포를 공배양세포(feeder cell)가 준비된 12 well 배양접시에 한 well당 0.1 × 10⁶개씩 담아 성장인자(10ng/ml GDNF, 75ng/ml GFRα1, 1ng/ml bFGF)가 첨가된 무혈청 배양액에서 6주간 체외배양 하였고, 배양액은 2~3일마다 교체해주었다. 체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 trypsin처리를 통해 단일세포로 회수되었다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM-α 배양액에 넣어 원심분리 하였다.

1-3. 하이퍼타우린을 이용한 동결보존

체외 증식된 정원줄기세포를 대상으로 동결보존시 하이퍼타우린의 영향을 확인하기 위하여 하이퍼타우린의 농도에 따른 동결보존 능력을 측정하였다. 우태아혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 DPBS에 하이퍼타우린을 각각 3.5mM, 7mM, 및 14mM로 첨가하여 동결보존하고 해동하여 원심분리 후 회수율과 증식률을 측정하였다.

동결보존 방법은 체외 증식 후 회수된 정원줄기세포를 동결 보존액과 0.5 × 10⁶cells/mL의 농도로 희석하여 1.8ml 동결용기에 보존하였고, 동결용기를 Freezing container에 넣고 약 -1℃/min의 속도로 -80℃까지 온도를 낮춰 하루 동안 보관한 후, 동결용기를 다시 액체질소로 옮겨 1달 동안 보관하였다.

실시예 2. 동결-융해 후 동결보존 효율 측정 실험 결과

본 실시예에서는 항산화제 및 세포자연사 억제제의 첨가가 정원줄기세포의 동결 보존에 미치는 효율을 알아보았다. 정원줄기세포의 동결 보존에 대한 세 가지의 항산화제(Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine, Glutathione peroxidase)와 두 가지의 항산화 효소(Glutathione peroxidase, Catalase) 및 두 가지의 세포 자연사 억제제(Y-27632, Z-VAD-fmk)의 효과를 확인하기 위하여 FBS 10%와 DMSO 10%로 구성된 기본 동결 보존제에 각각의 제제를 서로 다른 농도로 동결 보존액에 첨가하였다. 보다 구체적으로, Ascorbic acid는 각각 0.1, 0.5, 1mM, Glutatione은 50, 100, 200μM, Hypotaurine은 3.5, 7, 14mM, Glutatione peroxidase는 1, 5, 10U/ml, Catalase는 50, 100, 200㎍/ml, Y-27632는 50, 100, 200μM, Z-VAD-fmk는 15, 30, 60μM의 농도로 첨가하였다. Z-VAD-fmk는 DMSO를 용매로 사용하였고, 나머지 다른 첨가물질은 DPBS를 용매로 하여 첨가하는 농도의 두 배로 준비하여, 20%의 FBS와 20%의 DMSO를 포함하는 DPBS로 구성된 동결 보존액에 1:1 비율로 섞어 6주 간 체외배양한 정원줄기세포를 액체 질소에서 한 달간 동결 보존 하였다. 세포의 증식력을 측정하기 위해 동결-융해시킨 정원줄기세포를 생쥐의 무혈청 배양액에서 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 일주일간 체외배양하였다.

2-1. 회수율과 증식률 측정을 통한 동결보존 효율 비교

본 실시예에 필요한 정원줄기세포의 수적 확보를 위하여 동결보존 전 6주간 체외배양을 실시하였다. 정원줄기세포의 동결 보존에 대한 세 가지의 항산화제(Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine)와 두 가지 항산화 효소(Glutathione peroxidase, Catalase) 및 두 가지의 세포 자연사 억제제(Y-27632, Z-VAD-fmk)의 효과를 확인하기 위하여 FBS 10%와 DMSO 10%로 구성된 기본 동결 보존제에 각각의 제제를 농도별로 첨가하였으며, 항산화제 및 세포자연사 억제제를 첨가하지 않은 기본 동결 보존액을 대조군으로 하였다. 체외배양한 정원줄기세포를 액체 질소에 한 달간 동결 보관한 후, 동결된 세포를 융해하여 회수율(Recovery rate)에 대한 효과를 측정하였다. GFP를 발현하는 세포의 수를 항산화제나 세포자연사 억제제를 첨가하지 않은 기본 배양액에 동결 보존했던 대조군과 비교하였다. 그 결과, 농도에 관계없이 항산화제 및 세포자연사 억제제의 모든 처리군에서 세포의 회수율은 유의적인 차이가 나타나지 않았지만(도 1), 동결-융해 후 1주간 배양을 통해 세포의 증식률(proliferation rate)을 평가한 결과, Hypotaurine 3.5mM, 7mM, 14mM 처리군 각각에서 모두 높은 증식률을 나타내었고, Hypotaurine 14mM 처리군에서 현저히 높은 증식률을 나타내었다(도 2). 또한, 증식률이 가장 높았던 Hypotaurine 14mM 처리군은 정상적인 germ cell colony가 관찰되었고(도 3A), 생식세포 마커인 PLZF, VASA, GFRα1을 이용한 면역세포화학법 분석을 통해서 생식세포 발현을 관찰하였다(도 3B).

본 실시예를 통하여, 다양한 항산화제 및 세포자연사 억제제 처리군 모두 정원줄기세포의 동결-융해 후 회수율에는 영향을 미치지 않지만, Hypotaurine 14mM 처리군에서 정원줄기세포 동결-융해 후 증식률의 현저한 향상을 확인할 수 있으므로 Hypotaurine의 동결 보존제로서의 효율성이 검증되었다.

2-2. 미토콘드리아 활성 확인을 통한 동결보존 효율 비교

상기 실시예 2-1을 토대로 Hypotaurine이 정원줄기세포의 동결 보존 효율을 높이는 원인을 확인하기 위하여 미토콘드리아의 활성을 확인하였다. Hypotaurine이 정원줄기세포의 미토콘드리아 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ATP양을 luminometer를 이용하여 측정하였다. 또한, 항산화제 또는 세포 자연사 억제제를 첨가하지 않은 기본 배양액에 동결 보존했던 대조군과 비교하였다.

그 결과, Hypotaurine은 3.5mM, 7.0mM, 14.0mM 처리군 각각에서 111.0 ± 6.1%, 126.2 ± 10.9%, 128.9 ± 4.9% ATP양이 증가되었고, 14.0mM 처리군에서 가장 높은 증식 효율을 나타내었다(도 4).

상기 실시예 2-1과 2-2의 결과를 종합해볼 때, 3.5mM, 7.0mM, 14mM 농도의 Hypotaurine이 사용된 동결보존 방법은 정원줄기세포의 동결 보존 후 증식률 및 미토콘드리아의 활성을 증가시킴으로써 정원줄기세포의 보존 효율을 효과적으로 증진시킬 수 있고, 14mM 농도의 Hypotaurine이 사용된 동결보존 방법이 정원줄기세포의 보존 효율을 가장 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

2-3. Trehalose - Hypotaurine 복합 동결 보존제와의 정원줄기세포 동결 보존 효율 비교

정원줄기세포의 동결 보존 효율 증진을 확인하기 위하여 정원줄기세포를 대조군(DPBS에 10% FBS와 10% DMSO를 첨가), 단일 처리군(Hypotaurine 14mM, Trehalose 200mM), 복합 처리군(Hypotaurine 14mM과 Trehalose 200mM이 혼합된 동결 보존제)으로 각각 한 달간 액체 질소에 동결 보존 후, 융해하여 회수율과 증식률을 확인하였다. 그 결과, 회수율은 모든 처리군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 수치상으로 14mM 농도의 Hypotaurine 단일 처리군에서 가장 높았다. 또한, 증식률은 단일 처리군(Trehalose 200mM; 172.6 ± 6.3%, Hypotaurine 14mM; 156.8 ± 2.7%)과 복합 처리군(160.6 ± 4.2%) 모두 대조군에 비해 높았고, Trehalose보다 현저히 적은 14mM 농도의 Hypotaurine 단일 처리군에서 유의미한 증가를 확인하였다(도 5A 및 도 5B).

따라서, 14mM 농도의 Hypotaurine이 사용된 동결보존 방법이 정원줄기세포의 회수율과 증식률을 모두 상승시킴으로써 보존 효율을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

2-4. Z- VAD - fmk , Trehalose , 및 Hypotaurine 복합 동결 보존제의 정원줄기세포 동결 보존 효율 비교

상기 실시예 2-3과 동일하게 동결 보존제의 복합적인 동결 보존 효율을 확인하기 위하여 대조군(DMSO only), Hypotaurine 14mM, Z-VAD-fmk 15μM, Trehalose 200mM로 구성된 단일 처리군(Single group)과 각각의 병합 첨가제로 구성된 복합 처리군(Combination group)으로 나누어 동결-융해 후, 회수율과 증식률을 확인하였다.

그 결과, 회수율은 단일 처리군 및 복합 처리군 모두 대조군과 유의차가 나타나지 않았지만(도 6), 증식률은 Hypotaurine 14mM 단일 처리군(168.9 ± 11.4%)에서 대조군에 비해 유의적으로 높았고(도 7), 복합 처리군의 경우, 단일 처리군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

상기 실시예 2-1 내지 2-4을 통해, Hypotaurine 처리군은 증식률에서 현저한 증가를 보였고, 적은 Hypotaurine 농도로도 회수율과 증식률 증가 효과가 있었으며, Hypotaurine 14mM 단일 처리군의 동결보존 효율이 복합처리군보다 증진되었음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 동결보존액으로 정원줄기세포(Spermatogonial stem cells)를 동결시키는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존 방법.
제1항에 있어서,
상기 동결보존액은 3.5~14mM 농도의 하이퍼타우린을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존 방법.
제1항에 있어서,
상기 동결보존액은 FBS(fetal bovine serum) 5~20%(v/v), 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 5~20%(v/v)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존 방법.
제 1항에 있어서,
상기 동결보존액은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline) 또는 MEM-α(Minimum essential medium alpha) 액체배지인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존 방법.
동결보존액을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 보존액은 하이퍼타우린(Hypotaurine)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 동결보존액은 3.5~14mM 농도의 하이퍼타우린을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 동결보존액은 FBS(fetal bovine serum) 5~20%(v/v), 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 5~20%(v/v)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 동결보존액은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered saline) 또는 MEM-α(Minimum essential medium alpha)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 정원줄기세포의 동결보존용 조성물.