KR101230435B1 - 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 동결보존액에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 정원줄기세포 동결보존 기법을 따르면, 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진을 확인할 수 있기 때문에 효율적인 동결보존을 통해 우수종축의 형질 보존 연구 분야의 발전뿐 아니라 인간 불임치료와 같은 적극적인 활용법 개발에 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

Description

폴리에틸렌 글리콜을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법{Method of cryopreservation of spermatogonial stem cells using polyethylene glycol}

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 동결보존액에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

줄기세포 (stem cells)는 미분화 상태로 오랜 기간 동안 자가분열을 통하여 증식이 가능하며, 적절한 조건하에서 특수한 기능을 수행하는 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 줄기세포는 분리시기에 따라 배아줄기세포 (embryonic stem cells)와 성체줄기세포 (adult stem cells)로 구분된다. 전분화능을 지닌 배아줄기세포와 달리 성체줄기세포는 조직 및 기관에 존재하는 미분화 세포로서 조직 및 기관에서 자가분열 (self-renewal)과 분화 (differentiation)를 통해 적절한 세포를 공급하여 기능적으로 항상성을 유지 할 수 있게 한다.

정자형성과정 (spermatogenesis)을 통해 남성 측 유전정보를 다음 세대에 전달하는 매개체인 정자를 생산하는 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells; SSCs)는 정소 (testis)에 존재하는 성체줄기세포다. 정원줄기세포는 연속적이고 매우 생산적이며 고도의 유기적인 과정인 정자형성과정의 토대가 되는 생식선 줄기세포다. 남성의 정소 (testis)에 존재하는 정원줄기세포의 분열과 분화에 의해 남성 생애 전반에 걸쳐 정자형성과정이 유지된다.

1994년 Brinster (Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, 22;91(24):11303-7) 연구팀은 생쥐 정소세포의 이식기법을 개발하여 생쥐의 정소에 정원줄기세포가 존재한다는 실증을 보임과 동시에 정원줄기세포의 기능적 특성을 직접적으로 연구할 수 있는 전기를 마련하였다. 이후 정소세포 및 정원줄기세포 이식기법은 정원줄기세포의 생물학적인 특성과 활용법 개발에 있어서 필수적이고 가장 핵심적인 기술로 사용되고 있다.

현재까지 다양한 종의 동물들의 정소로부터 정원줄기세포가 포함된 정원세포군을 분리하는 방법들이 개발되었다. 일반적으로 줄기세포를 포함한 동물세포를 장기간 보존하는 방법은 체외배양법과 동결보존법이 있다. 설치류의 정원세포의 경우 공배양세포와 성장인자가 포함된 배양환경에서 장기간 체외배양법이 개발되었지만 다른 종의 경우 효율적인 체외배양방법이 부족한 상황이다.

1996년 Brinster (Nature medicine. 1996, 2, 693-696) 연구팀은 동결보존된 정원줄기세포를 이식한 정소에서 정자형성과정이 재개되는 것과 정자세포가 생산되는 것을 확인하였고 이는 정원줄기세포의 장기간 효율적 보존방법 개발과 정자 결핍으로 인한 불임환자의 치료법 개발과 같은 치료법 연구 적용의 가능성을 높여주었다. 이 후 2003년 Shinohara (Human reproduction. 2003, 18; 12, 2660-2667) 연구팀은 동결보존된 정원줄기세포의 이식을 통해 불임 생쥐로부터 새끼를 생산함으로써 정자 동결보존을 대체할 수 있는 방법 연구에 대하여 기반을 마련해 주었다. 그러나 상기 기법들은 체세포 동결보존법을 인용한 방법이므로 쉽게 활용될 수 있으나 세포 생존율이 비교적 떨어지고, 정소의 모든 세포군을 동결한 기법이므로 순수한 정원세포군의 동결 및 해동 후의 생존율을 알 수 없다. 따라서 순수한 정원세포군의 생존율을 높이기 위한 개선된 기술 개발에 대한 필요성이 절실하다.

이에 본 발명자는 정원세포의 체외배양을 통해 순수한 정원세포군을 회수한 후 효율적으로 정원줄기세포를 동결보존 할 수 있는 방법을 개발하기 위한 연구를 계속 한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로 동결보존액에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(ⅰ) 포유류의 정소를 효소 처리함으로써 단일 세포군을 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 단일 세포군으로부터 정원줄기세포를 회수하는 단계;

(ⅲ) 상기 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하는 단계; 및

(ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계의 회수된 정원줄기세포를 폴리에틸렌 글리콜이 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존하는 단계;

를 포함한 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.

상기 효소는 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin), Dnase I 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하다.

상기 (ⅱ) 단계의 정원줄기세포의 회수는 MACS 기법을 이용하여 회수하는 것을 포함할 수 있다.

상기 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외배양기에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 성장인자는 GDNF, GFRα1, bFGF인 것이 바람직하다.

상기 (ⅲ) 단계의 회수는 트립신(trypsin)처리를 통해서 회수하는 것이 바람직하다.

상기 동결보존액은 우태아 혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 MEM-α인 것을 포함할 수 있다.

상기 분자량이 1,200 내지 10000인 폴리에틸렌 글리콜을 2.5 내지 10% 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 정원줄기세포 동결보존 기법을 따르면, 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진을 확인할 수 있기 때문에 효율적인 동결보존을 통해 우수종축의 형질 보존 연구 분야의 발전뿐 아니라 인간 불임치료와 같은 적극적인 활용법 개발에 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의한 1개월간 체외배양된 생쥐 정원줄기세포를 효소처리를 통하여 단일 세포군을 회수하고 PEG을 이용한 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 및 회수율을 나타낸 도면이다.
- 표내 제시된 수치 : 3회 이상 독립 실시된 실험 결과의 평균 수치 및 표준오차 수치
- Final concentration (%) of PEG : 정원줄기세포 동결 시 동결보존액에 포함된 PEG의 농도
- Survival rate (%) after thawing : 정원줄기세포의 동결 및 해동 후 생존율
- Recovery rate (%) : 동결 및 해동 후 살아있는 정원줄기세포의 회수율
- * : PEG이 포함되지 않은 것과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였음을 나타냄 (p < 0.05)
도 2는 동결 및 해동 후 각각의 처리별로 증식 수를 나타낸 도면이다.
- PEG을 처리하지 않은 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.38 x 10⁶개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 69.3%에 해당하는 숫자임.
- 2.5%의 PEG을 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.82 x 10⁶개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 91.2%에 해당하는 숫자임.
- 5%의 PEG을 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.54 x 10⁶개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 77%에 해당하는 숫자임.
- 10%의 PEG을 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 0.86 x 10⁶개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 43.4%에 해당하는 숫자임. 2.5%의 PEG 처리에서 통계학적으로 유의한 차이가 나타남.
도 3은 본 발명에서 실시되었던 대표적인 기법인 2.5% PEG이 포함 된 동결보존액을 이용하여 동결 후 체외배양중인 정원줄기세포의 사진이다.
- Fresh : 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 정원줄기세포의 체외배양 모습 (화살표는 정원줄기세포의 clump를 나타냄, bar: 100 um)
- PEG 2.5%: 2.5%의 PEG 처리를 통해 동결된 정원줄기세포의 체외배양 모습 (화살표는 정원줄기세포 clump를 나타냄, bar: 100 um)

본 발명의 일 목적은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 동결보존액에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는,

(ⅰ) 포유류의 정소를 효소 처리함으로써 단일 세포군을 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 단일 세포군으로부터 정원줄기세포를 회수하는 단계;

(ⅲ) 상기 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하는 단계; 및

(ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계의 회수된 정원줄기세포를 폴리에틸렌 글리콜이 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존하는 단계;

를 포함한 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.

상기 포유류는 인간을 포함하며, 본 발명에 있어서 생쥐인 것이 바람직하다. 정소는 수컷의 생식세포인 정자를 만드는 기관으로 포유동물의 경우에는 고환이라고도 한다.

상기 정소를 효소 처리함으로써 단일 세포군을 분리할 수 있는데, 상기 효소란 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin), Dnase I 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하다.

상기 분리된 단일세포군은 다음단계를 수행하기 전에 10% 우태아 혈청과 복합항생제가 첨가된 DMEM 배양액에 보관되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (ⅱ)단계의 정원줄기세포의 회수는 MACS(magnetic activated cell sorting) 기법을 이용하여 회수하는 것이 바람직하다. 단일 세포군을 원심분리한 정소세포를 MACS 기법을 이용하면 고순도의 정원줄기세포의 회수가 가능하다.

본 발명의 용어, “정원줄기세포”란 정조줄기세포(SSCs, spermatogonial stem cells)라고도 불리며, 정원줄기세포는 정소에 존재하면서 정자형성(spermatogenesis)에 중요한 기능을 한다. 그 명칭에 있어 포유류 암컷에서 이들의 존재 가능성이 제기되어 이와 구분하기 위해 `남성생식선줄기세포` (雄性, 웅성, male germline stem cells)라고도 불린다. 이 세포는 성체줄기세포 특유의 자가재생능력과 정자세포로의 분화능력을 동시에 가지고 있으나 고환 내에 아주 극소수가 존재한다.

상기 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외 배양기에서 배양하는 것이 바람직하다. 체외배양은 상기 고순도 정원줄기세포의 대량증식을 위함이다.

상기 성장인자는 GDNF(Glial cell- line derived neurotrophic factor, 신경영양인자), GFRα1(GDNF family co-receptor α1), bFGF(Basic fibroblast growth factor, 섬유아세포 성장인자)인 것이 바람직하다.

상기 배양은 체외배양기에서 1~2개월간 배양하는 것이 바람직하고, 배양액은 2~4일 간격으로 교체해 주고, 7~9일 간격으로 계대배양 하는 것을 포함할 수 있다.

상기 체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 트립신(trypsin) 처리를 통해서 동결보존을 위한 단일 세포로 회수될 수 있다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEMα 배양액에 넣어 원심분리하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일실시예에서의 동결보존액은 우태아 혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 MEM-α인 것이 바람직하다. 상기 동결보존액에 세포막 비투과성 동결보존제인 분자량 1,200 내지 10000의 폴리에틸렌 글리콜 2.5% 내지 10% 농도를 첨가하는 것이 바람직하다. 특히 1,200 분자량의 2.5% 농도의 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 동결보존 시 남성생식선 줄기세포인 정원줄기세포의 보존성을 효과적으로 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 농도의 분자량 1,200의 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 동결보존하고 7일 이후 해동하여 생존율 및 원심분리 후 회수율과 증식력의 측정이 가능하고, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 장기간 동결보존을 할 수 있다.

본 발명의 “폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)"이란 세포융합을 일으키는 데 사용하는 중합체이다. 세포와 세포, 세포와 리보솜 등을 원심침강 등으로 밀착시켜 고농도의 PEG을 작용시키면 막융합을 하며, 혼성세포(hybridoma)를 형성할 때 사용한다. 융합의 기구는 고농도의 PEG에 의한 자유수의 소실에 따른 소수적 상호작용의 저하 또는 불순물의 영향일 수 있다. PEG는 단백질, 핵산 등의 분리를 위한 수용액 2층계의 구성성분으로서도 사용한다.

상기 동결보존 방법은 본 발명의 일실시예에서 0.5 x 10⁶ cells/ml 농도의 세포를 각 분자량과 여러 가지 농도의 PEG이 첨가된 동결보존액에 넣고 한 개의 동결용기에 1ml씩 보존한다. 동결 용기는 isopropanol이 담긴 cryocontainer에 넣어 -80℃까지 약 -1℃/min의 속도로 온도를 낮춰 (이후 완만동결법이라 칭함) 하루 동안 보관한다. 이 후 동결 용기는 다시 -196℃ 액체 질소로 옮겨 6일간 보관할 수 있다.

이처럼 본 발명의 일 목적은 정소세포군으로부터 고순도 정원줄기세포 회수기법과 체외배양기법을 통해 순수한 정원줄기세포군을 확보하여 정원줄기세포에 최적화된 동결보존법을 연구함으로써 생식선줄기세포의 장기간 보존법 개발 연구에 적용할 수 있는 방법을 제공하려는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 성체 가축 종 정원줄기세포의 회수 및 순수도 증진 기법에 적용하여 유전능력은 뛰어나지만 질병이나 노화 등으로 정액채취가 불가능한 우수종축의 정소로부터 순수한 정원줄기세포를 채취하고 효율적으로 보존하여 우수종축의 생식세포 보존 효율성을 증진 시킬 수 있는 방법을 제공하려는데 있다. 또한 정원줄기세포의 이식기법에 적용하여 젊은 recipient 정소에 이식한 후 recipient 정소로부터 이식된 종모돈의 정원줄기세포에서 유래되는 정자를 생산함에 따른 우수종모돈의 활용도를 증진 시킬 수 있는 방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 정원줄기세포의 장기간 보존방법으로 확대하여 암 치료나 질병 및 노화 등으로 정자가 결핍되어 수정이 불가능한 환자의 정원줄기세포를 효율적으로 보관하여 남성불임치료 연구에 적용시키고자 하는데 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1. 실험 방법>

본 실험은 생식선줄기세포의 효율적인 동결보존법을 개발하는데 있어서 관리와 정소세포군의 회수가 용이한 생쥐를 대상 동물로 선정하였고, 형광발현단백질(green fluorescent protein)유전자를 지닌 C57BL/6-TgEGFP과 정원줄기세포의 체외배양 효율이 가장 높은 종으로 알려진 DBA/2 종을 교배하여 생산된 형광발현단백질 생쥐(C57GFP X DBA)의 정원줄기세포를 기술개발의 대상으로 설정하였다.

1. 정원줄기세포를 포함하는 정소세포의 회수

생쥐 정소로부터 하기 과정을 통해 정소세포군을 회수하였다.

가. 생쥐 정소의 복합 효소처리를 통한 단일 세포군 회수

생후 7~8 일령의 생쥐로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출한 후 정소의 백막을 제거하고 정소조직을 trypsin과 Dnase I 등의 효소들을 복합처리 하는 방법으로 정소로부터 정원줄기세포가 포함된 단일 세포들을 분리하였다. 분리된 단일 세포들은 다음 단계의 처리 전까지 10% 우태아 혈청과 복합항생제가 첨가된 DMEM 배양액 (이후 DMEM으로 칭함)에 넣어 보관하였다.

나. Density gradient 를 이용한 죽은 세포 및 세포외 잔해 제거

1) 등장 Percoll(iso-osmotic Percoll) 용액 준비

30% Percoll 용액 (총 100ml 당 Percoll 원액 30ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수증류수 58.5ml을 혼합함)을 제조하였다.

2) Percoll을 이용한 정원줄기세포 분리

상기 1)에서 제조된 등장 Percoll 용액을 2ml 씩 15ml conocal tube에 넣어 Percoll column을 준비하였다. 상기 1에서 분리된 정소세포를 DMEM으로 세포수가 10x10⁶/ml 되게 조정한 후 2ml의 세포부유액을 Percoll column 상부에 주입하였다. 이후 tube를 600 G에서 10분간 원심분리 하였고 원심분리 후 tube 최하위에 위치한 세포들을 회수하였다. 회수된 단일 세포들은 혈청이 첨가된 식염수 (총 100ml 당 DPBS 99ml, 우태아 혈청 1ml, pyruvate 11mg, glucose 100mg, HEPES 1ml, 복합항생제 0.5ml을 혼합함)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

2. 정소세포로부터 고순도 정원줄기세포의 회수

상기 1에서 회수된 단일 세포군은 600 G에서 7분간 원심분리 하였고 원심분리 후 정소세포는 Magnetic activated cell sorting (MACS) 기법을 이용해 고순도의 정원줄기세포를 회수하였다.

3. 정원줄기세포의 체외배양 및 대량 회수

상기 2에서 회수된 고순도 정원줄기세포는 대량증식을 위해 체외배양 하였고 동결보존을 위해 회수되었다.

가. 정원줄기세포의 체외배양

상기 2에서 회수된 고순도 정원줄기세포는 성장인자 (10ng/ml GDNF, 75ng/ml GFRα1, 1ng/ml bFGF)가 포함된 무혈청배지와 지지세포층 피복된 12well plate에 한 well당 0.1 x 10⁶개씩 담겨 체외배양기 (CO2 5%, 37℃)에서 1개월간 배양 하였다. 이때 배양액은 2~3일 간격으로 교체해 주었고, 7일 간격으로 계대배양 해 주었다.

나. 동결보존을 위한 정원줄기세포의 회수

체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 trypsin 처리를 통해 단일 세포로 회수되었다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEMα 배양액 (이후 MEMα라 칭함)에 넣어 600G에서 7분간 원심분리 하였다.

4. 세포막 비투과성 동결보존제를 이용한 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진

체외 증식된 정원줄기세포를 대상으로 동결보존시 세포막 비투과성 동결보존제인 polyethylene glycol (PEG) 처리에 따른 세포 생존율의 증진 여부를 확인하였다.

가. PEG 을 이용한 정원줄기세포의 동결보존

정원줄기세포의 동결보존 과정에서 PEG의 영향을 확인하기 위하여 농도에 따른 동결보존 능력을 측정하였다. 우태아 혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 MEM-α (이후 동결보존액이라 칭함)에 분자량 1,200, 3,000, 10,000의 PEG을 각각 2.5%, 5%, 10%로 첨가하여 동결보존하고 7일 후 해동하여 생존율 및 원심분리 후 회수율과 증식력을 측정하였다.

동결보존 방법은 0.5 x 10⁶ cells/ml 농도의 세포를 각 분자량과 여러 가지 농도의 PEG이 첨가된 동결보존액에 넣고 한 개의 동결용기에 1ml씩 보존하였다. 동결 용기는 isopropanol이 담긴 cryocontainer에 넣어 -80℃까지 약 -1℃/min의 속도로 온도를 낮춰 (이후 완만동결법이라 칭함) 하루 동안 보관하였다. 이 후 동결 용기는 다시 -196℃ 액체 질소로 옮겨 6일간 보관하였다.

나. 동결보존된 정원줄기세포의 해동 및 회수

동결상태의 정원줄기세포를 37℃ 항온 수조에서 3분간 해동 후 tryphan blue 용액 염색 방법을 통해 각 PEG의 농도별로 정원줄기세포의 생존율을 확인 (이후 동결 및 해동 직후 생존율 이라 칭함) 하였다. 이 후, 5배 volume의 새 배양액에 옮겨 담아 600G로 2회 원심분리 후 정원줄기세포의 생존율 측정을 통해 살아있는 세포 수를 확인하여 얼린 세포 수(0.5 x 10⁶개)당 살아있는 세포 수의 비율을 측정 (이후 원심분리 후 회수율 이라 칭함) 하였다.

다. 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 체외배양

상기에서 회수된 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포는 성장인자가 포함된 무혈청 배양액에 넣어 지지세포들이 피복된 배양 접시에 담아 체외배양 했다. 이때 한 개의 동결용기에서 동결된 정원줄기세포는 한 개의 접시에 모두 담아 PEG의 농도별로 각각 1주일간 배양 후 증식된 세포 수를 확인하였고, 이때 동결되지 않은 (이후 신선한 세포라 칭함) 0.5 x 10⁶개의 정원줄기세포의 1주일간 배양 후 증식된 세포 수와 비교하여 증식비율을 측정 (이후 동결 및 해동 후 증식율 이라 칭함) 하였다.

< 실시예 2. 실험 결과- PEG 의 분자량 및 농도에 따른 효능>

본 발명과정에서 세포막 비투과성 동결보존제 처리 농도에 따른 정원줄기세포의 동결 후 생존율 변화는 동결 및 해동 직후와 원심분리 후 tryphan blue 염색법을 통하여 분석하였다.

또한 원심분리 후의 정원줄기세포를 각 각 체외배양 하여 세포막 비투과성 동결보존제 처리 농도에 따른 정원줄기세포의 동결 및 해동 후 증식 상태를 각 각 비교하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 이상으로 실시하였다.

1. 정원줄기세포의 동결보존 및 해동 후 생존율 측정

고순도의 정원줄기세포를 대상으로 동결보존을 실시했을 때 PEG이 포함되지 않은 동결보존액을 이용했을 경우 동결 및 해동 직후의 생존율은 73.2± 6.7%(평균±표준오차)이었고, 분자량 1,200, 3,000, 10,000의 PEG을 각 각 2.5%, 5%, 10%의 농도로 이용했을 경우 동결 및 해동 직후의 생존율은 각 각 (2.5%-1,200(PEG 농도-분자량), 2.5%-3,000, 2.5%-10,000, 5%-1,200, 5%-3,000, 5%-10,000, 10%-1,200, 10%-3,000, 10%-10,000의 순서로) 89.0± 2.9%, 94.5 ± 3.5%, 89.4± 4.3%, 91.4± 2.2%, 89.7± 2.3%, 90.2± 3.9%, 86.6± 5.6%, 88.2± 5.5%, 86.5± 3.3%로 나타났다. 또한 모든 농도에서 통계학적인 유의차를 나타내는 결과를 보였으며 가장 높은 생존율을 보인 농도는 PEG 2.5%-3,000 처리였다.

2. 동결 및 해동된 정원줄기세포의 회수율 측정

PEG이 포함되지 않은 동결보존액을 통해 동결 후 해동된 정원줄기세포의 회수율은 PEG 첨가되지 않은 경우 67.7± 11.4% 였고, 분자량 1,200, 3,000, 10,000의 PEG을 각 각 2.5%, 5%, 10%의 농도로 이용했을 경우 동결 및 해동 후 회수율은 각 각 (2.5%-1,200(PEG 농도-분자량), 2.5%-3,000, 2.5%-10,000, 5%-1,200, 5%-3,000, 5%-10,000, 10%-1,200, 10%-3,000, 10%-10,000의 순서로) 96.8± 13.8%, 87.3± 24.5%, 87.2± 19.1%, 95.5± 11.3%, 92.5± 20.7%, 73.0± 21.5%, 64.2± 13.1%, 64.5± 4.7%, 49.8± 2.5%으로 분자량 1,200의 PEG을 2.5% 농도로 사용했을 때 가장 높은 회수율과 통계적인 유의차를 나타내는 결과를 보였다.

3. 동결 및 해동된 정원줄기세포의 증식율 측정

동결 후 해동된 정원줄기세포 1주일간 체외배양 후 증식율을 측정한 결과 PEG을 동결보호제에 첨가하지 않은 경우 증식율은 69.3.4± 8.3% 이었다. 분자량 1,200, 3,000, 10,000의 PEG을 각 각 2.5%, 5%, 10%의 농도로 이용했을 경우 동결 및 해동 후 정원줄기세포의 증식율은 각 각 (2.5%-1,200(PEG 농도-분자량), 2.5%-3,000, 2.5%-10,000, 5%-1,200, 5%-3,000, 5%-10,000, 10%-1,200, 10%-3,000, 10%-10,000의 순서로) 91.2± 4.4%, 74.7± 2.9%, 77.5± 11.0%, 77.0± 4.5%, 75.1± 3.7%, 65.7± 10.0%, 43.4± 4.7%, 42.0± 1.0%, 31.4± 6.6으로 분자량 1,200의 PEG을 2.5%의 농도로 사용했을 때 가장 높은 증식율과 통계학적 유의차를 나타내는 결과를 보였다.

상기 결과는 본 발명에서 개발된 분자량 1,200의 PEG이 2.5% 농도로 사용된 동결보호 기법이 남성생식선 줄기세포인 정원줄기세포의 보존성을 효과적으로 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

1. (ⅰ)포유류의 정소를 콜라게나제, 하이아루로니다제, 트립신, Dnase Ⅰ 또는 이의 혼합물을 처리하여 단일 세포군을 분리하는 단계;
   (ⅱ) 상기 (ⅰ)단계의 단일 세포군으로부터 정원줄기세포를 회수하는 단계;
   (ⅲ) 상기 (ⅱ)단계의 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하는 단계;
   (ⅳ) 상기 (ⅲ)단계의 회수된 정원줄기세포를 분자량 1200~10000인 2.5%의 폴리에틸렌 글리콜이 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존하는 단계;를 포함하는 정원줄기세포의 동결보존방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외 배양기에서 배양하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 (ⅲ) 단계의 회수는 트립신(trypsin)처리를 통해서 회수하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 동결보존액은 우태아 혈청 10%, DMSO 10%가 포함된 MEM-α인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법.
6. 삭제
7. 삭제

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