CN1997732B - 分泌肝分泌因子的细胞的培养和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养能分泌肝分泌因子的肝细胞和非肝细胞的改进方法以及这些细胞在用于治疗有需要的患者中的肝疾病和病症的可植入组合物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及分泌用于与一或多种肝分泌因子缺乏和/或肝功能缺陷有关的疾病的治疗的因子VIII和其它肝分泌因子的细胞的培养和用途。
利用本申请所描述的方法，分离的细胞保留了长期分泌因子VIII和其它肝分泌因子的能力并且因此可以具有广泛的应用，包括但不限于通过例如移植而增强、替代和/或重建功能缺陷型肝的用途。
背景技术
许多疾病、缺陷和病症可通过给患者提供由活细胞产生和/或分泌的一或多种生物学活性因子而治疗。多数情况下，这些因子可修复或弥补器官或组织功能的损伤或丧失。
然而，器官或组织功能的损伤或丧失可导致多种代谢功能的丧失。例如，已报道在暴发性肝功能衰竭中，肝组织变得不能排除毒素、排泄细胞代谢的产物以及分泌必需因子如白蛋白和因子VIII(Bontempo，et al.，Blood，69，pp.1721-1724(1987))。
在许多疾病或病症中，受影响的器官或组织为通常通过例如响应特定代谢物和/或生理学重要物质的波动水平从而维持体内稳态而对生理学状态产生应答的方式起作用的器官或组织。传统的因子补充疗法不能弥补正常组织对这些波动的响应，并且不能提供对这种生理状态的协调反应性可能导致该疾病状态的并发症。
因此，许多研究者已试图通过移植完整的器官或器官组织以提供分泌产物或实现代谢功能而重建器官或组织功能。例如肝移植是为末 期肝疾病建立的疗法，如Starzl，et al.，N.Eng.J.Med.321：1014-1022(1989)所述。在另一个实例中，患有血友病A的患者由于血源性因子VIII获得的肝炎导致的肝功能衰竭而经受肝移植。这些情况中，血友病被彻底治愈。然而，移植疗法的应用受可用于移植的器官不足的限制。例如，已报道美国每年有超过25,000人死于肝疾病(Murphy，SL.Deaths：数据至1998年.Natl.Vital Stats.Rep.2000；48：1-105)，并且在2001年列入移植的患者中有11％在等待器官过程中死亡(Annualreport of the U.S.Organ Procurement and Transplant Network and theScientific Registry of Transplant Recipients，2003)。
通常，患者必须经受免疫抑制或免疫调节以避免移植体的免疫排斥，其导致移植体功能的丧失并最终导致移植器官或组织的坏死。然而，免疫抑制或免疫调节疗法通常损害患者的整体免疫防御，这可能提高患上多种严重的并发症(包括肾毒性、神经毒性、高血压，对感染和骨质疏松症的易感性提高)的易感性。此外，该方法对改变排斥反应的进程和发生频率并不总是有效的。典型地，移植体必须在很长一段时期内保留功能，甚至是患者的余生。长期将患者维持在免疫抑制或免疫调节状态是不需要的，也是昂贵的。
移植细胞可以为治疗各种疾病的提供更大潜力，因为这种细胞可提供因子以替代或补充天然因子，所述天然因子由于其功能不全或缺乏引起疾病。细胞植入疗法优于传统的因子补充疗法方案，因为移植细胞可响应受体中特定的代谢物和/或生理学重要物质的波动水平。可适当地调节治疗因子从移植细胞的释放使得移植细胞具有必要的受体以及应答内源调节物的能力。
细胞植入疗法优于传统的器官移植疗法，体现在适于植入的细胞的可获得性不像来自尸体或活器官供体的合适的器官那样受限制。
此外，有时待植入的细胞相对于宿主可能是外源的，已开发了各种方法以避免宿主免疫系统的攻击并从而引起植入细胞的死亡，例如 将细胞置于提供细胞与宿主免疫系统之间的物理屏障的装置中。
然而，由于肝细胞很容易被损伤且难以培养，用于植入以分泌因子VIII和其它肝分泌因子的肝细胞的分离和培养是困难的。因此一旦植入，不能完全表征其长期培养和效力。
因此，希望拥有用于植入患者后能分泌肝分泌因子的肝细胞和其它非肝细胞长期培养的方法，由此该方法产生适于长期植入的耐用的细胞。还希望拥有用于从肝细胞外的细胞产生因子VIII和其它肝分泌因子并且适于在有需要的患者中进行植入的方法。
本发明的一个目的是推动实现这些迫切需要和/或给公众提供有益的选择。
发明综述
本发明的第一个方面提供了用于长期培养肝细胞的方法，包括以下步骤：
在冷DMEM中交换肝细胞组织并于4℃温育达24小时；
在利多卡因存在的条件下，用0.2mg/ml浓度的释放酶 消化两次；
分离消化的肝细胞；和
在包含同种异基因血清的培养基中进行培养。
优选地，所述肝细胞为新生儿肝细胞。
在第二个实施方式中，本发明提供了用于长期培养能分泌一或多种肝分泌因子的至少一或多种非肝细胞细胞类型的方法，所述方法包括以下步骤：
在冷DMEM中交换非肝细胞组织并于4℃温育达24小时；在利多卡因存在的条件下，用释放酶 (0.2mg/ml)消化两次，每次达10分钟；
分离消化的非肝细胞；和
在包含同种异基因血清的培养基中进行培养，
其中所述至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞。
任选地，该方法进一步包括非肝细胞与肝细胞共培养的步骤。
优选地，当使用时，所述非肝细胞和肝细胞为新生儿细胞。
所述一或多种肝分泌因子可包括白蛋白、凝血因子如因子VIII或因子IX、生长和/或分化因子如生长激素及其类似物、胰岛素样生长因子及其类似物、肝细胞生长因子及其类似物或成纤维细胞生长因子及其类似物、或激素如皮质类固醇。
非肝细胞与肝细胞的共培养有助于维持每种细胞类型的表型。
另一方面，本发明提供了从至少一种非肝细胞细胞类型体外产生一或多种肝分泌因子的方法，所述非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞，所述方法包括以下步骤：
分离所述至少一种非肝细胞细胞类型；
在补充了同种异基因血清的培养基中培养所述至少一种非肝细胞细胞类型足以允许所述一或多种肝分泌因子分泌到培养基中的一段时间；
收集所述培养基；和
任选地分离或纯化所述肝分泌因子。
任选地，所述至少一种非肝细胞细胞类型可与肝细胞共培养。
优选地，所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞分离自新生儿组织。
本发明的另一方面提供了一种可植入组合物，其包含在植入受体后能分泌一或多种肝分泌因子或能给所述受体提供一或多种肝代谢 功能和/或生理功能的至少一种非肝细胞细胞类型，其中所述一或多种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞。
任选地，所述组合物进一步包含肝细胞。
优选地，所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞是新生儿细胞。
本发明的另一方面提供了在体内产生一或多种肝分泌因子的方法，包括将本发明的组合物植入有需要的患者的步骤。
优选地，所述组合物在植入后长期提供肝分泌因子或提供肝代谢功能或生理功能。
本发明的另一方面提供了一种可植入组合物，其包含在植入受体后能产生和/或分泌一或多种肝分泌因子的至少一种非肝细胞细胞类型的一或多种聚集体(aggregates)，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞。
任选地，所述聚集体进一步包含肝细胞。
优选地，用于本发明的方法和组合物中的所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞是猪或人的细胞。
优选地，用于本发明的方法和组合物中的所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞是新生的猪或人的细胞。
本发明包括肝细胞的用途，所述肝细胞可以分离自永生或非永生细胞培养物的商品化细胞培养物如可从Cell Dynamics LLC(Smyrna，Georgia，USA)获得的细胞培养物，或可以根据上述方法进行培养。
所述至少一种非肝细胞细胞类型优选为胆囊细胞，最优选胆囊内皮细胞和/或上皮细胞。
本发明优选涉及包含比率为0.5∶2至2∶0.5、优选为1∶1的胆囊上皮 细胞和肝细胞的组合物。
在一个实施方式中，一种肝分泌因子为凝血因子。
优选地，所述凝血因子为因子VIII或因子IX。
或者，所述凝血因子为因子VIII和IX。
当所述凝血因子为因子VIII时，还分泌冯·维勒布兰德因子(vonWillebrand factor)，更优选，冯·维勒布兰德因子与所述因子VIII结合和/或复合。
在另一实施方式中，所述一或多种肝分泌因子为生长和/或分化因子。
优选地，所述生长和/或分化因子选自生长激素及其类似物、胰岛素样生长因子及其类似物、肝细胞生长因子及其类似物、或成纤维细胞生长因子及其类似物。
在另一实施方式中，所述一或多种肝分泌因子是酶。
在一个实施方式中，所述非肝细胞细胞类型源自作为受体的相同物种。
本发明的另一方面提供了治疗患有或易患与肝分泌因子缺陷或缺乏有关的疾病或病症的患者的方法，包括给有需要的患者植入有效量的本发明的一或多种可植入组合物。
优选地，所述一或多种可植入组合物包含比率为0.5∶2至2∶0.5、优选为1∶1的胆囊上皮细胞和肝细胞。
优选地，所述疾病或病症为慢性肝功能不全、肝功能衰竭、肝疾病或酒精性肝病。
在一个实施方式中，所述功能不全、衰竭或疾病由感染，尤其是由甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染引起。
本发明的另一方面提供了治疗患有或易患凝血疾病或病症的患者的方法，包括给有需要的患者植入有效量的本发明的一或多种可植入组合物。
本发明的另一方面提供了治疗患有或易患血友病和/或凝血疾病或病症的患者的方法，包括给有需要的患者植入有效量的本发明的一或多种可植入组合物。
优选地，所述血友病为血友病A。
优选地，所述可植入组合物包括猪或人的细胞。
优选地，所述可植入组合物包括新生儿细胞。
优选地，本发明的可植入组合物包含包囊化于合适的生物相容性材料(如藻酸盐)中的细胞；
限制于合适的装置(如血管化管或TheracyteTM装置)中的细胞；
包囊化于基质制剂中的细胞，所述制剂例如为明胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物；和/或
限制于血浆凝血酶凝块中的细胞，所述凝块包括同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
本发明的另一方面提供了给有需要的患者使用凝血因子的方法，其中所述凝血因子与能增强所述凝血因子的活性、稳定性、生物利用率和/或效力的一或多种因子复合和/或结合，其中该方法包括给所述患者植入有效量的本发明的一或多种可植入组合物。
所述可植入组合物可包含猪或人的细胞。
所述可植入组合物可包含新生儿细胞。
优选所述凝血因子为因子VIII，更优选所述凝血因子为因子VIII并且能增强所述凝血因子的活性、稳定性、生物利用率和/或效力的所述一或多种因子为冯·维勒布兰德因子。
本发明的另一方面提供了治疗患有或易患与肝代谢和/或生理功能缺陷有关的疾病或病症的患者的方法，所述方法包括给该患者植入有效量的本发明的一或多种可植入组合物。
优选地，所述组合物包括猪或人的细胞。
优选地，所述组合物包括新生儿细胞。
所述疾病或病症可包括慢性肝功能不全、肝功能衰竭、肝疾病或酒精性肝病。
在一个实施方式中，所述功能不全、衰竭或疾病由感染，尤其是由甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染引起。
本发明的另一方面提供了选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞的至少一种非肝细胞细胞类型在制备用于治疗患有或易患与肝分泌因子的缺陷或缺乏有关的疾病或病症的患者的药物中的用途。
优选地，所述药物进一步包含肝细胞。更优选地，所述药物包含一种可植入组合物，该可植入组合物包含比率为0.5∶2至2∶0.5、优选为1∶1的胆囊上皮细胞和肝细胞。
优选地，所述疾病或病症是慢性肝功能不全、肝功能衰竭、肝疾病或酒精性肝病。
在一个实施方式中，所述功能不全、衰竭或疾病由感染，尤其是由甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染引起。
本发明的另一方面提供了选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞的至少一种非肝细胞细胞类型在制备用于治疗患有或易患凝血疾病或病症的患者的药物中的用途，所述疾病或病症例如是血友病，尤其是血友病A。
本发明的另一方面，提供了选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞的至少一种非肝细胞细胞类型在制备用于治疗患有或易患与肝代谢和/或生理功能的缺陷有关的疾病或病症的患者的药物中的用途。
所述疾病或病症可包括慢性肝功能不全、肝功能衰竭、肝疾病或 酒精性肝病。
在一个实施方式中，所述功能不全、衰竭或疾病由感染，尤其是由甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染引起。
优选地，此处描述的所述药物是一种可植入组合物并且包含猪或人的细胞。
优选地，所述药物包含新生儿细胞。
优选地，该药物包含包囊化于合适的生物相容性材料(例如藻酸盐)中的细胞；
限制于合适的装置(如血管化管或TheracyteTM装置)中的细胞；
包囊化于基质制剂中的细胞，所述制剂例如为明胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物；和/或
限制于血浆凝血酶凝块中的细胞，所述凝块包括同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
根据本发明的另一方面提供了用于植入患有或易患与肝分泌因子缺陷或缺乏有关的疾病的受体的装置，该装置包括本发明的一或多种可植入组合物。
所述疾病可包括凝血疾病或病症，如血友病。
该装置可包含猪或人的细胞。
该装置可包含新生儿细胞。
该装置可包含：
包括合适的生物相容性材料(如藻酸盐)的胶囊；
血管化管或室，更优选可从TheraCyte，Inc.，CA得到的TheraCyteTM装置；
包含凝胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物的基质制剂；或
包括同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块的血浆凝血酶凝块。
本发明还可以被宽泛地描述成存在于本申请说明书中分别或概括提及或指明的部分、组成要素和特征，以及任何两种或多种所述部分、组成要素或特征的任何或所有组合，并且其中特定的整体在此提及，其具有本发明涉及的本领域已知的等同物，所述已知的等同物认为在此就如分别阐述一样引入。
附图说明
图1：描述通过实施例1中所述的肝细胞制剂制备因子VIII和白蛋白的图示；
图2：通过实施例2.1中所述的肝细胞制剂制备白蛋白的图示，其中ARF+FBS指在丝裂霉素阻滞的成纤维细胞(ARF)存在下在补充了10％胎牛血清(FBS)的培养基中生长的肝细胞，ARF+PS指在ARF存在下在补充了10％猪血清(PS)的培养基中生长的肝细胞，ARFNO S指在ARF存在下在无血清培养基中生长的肝细胞，COLL+PS指在胶原涂覆的培养瓶中在补充了10％PS的培养基中生长的肝细胞，C+PS+F指在胶原(C)涂覆的培养瓶中在补充了5％PS和5％成纤维细胞-条件生长培养基(F)的培养基中生长的肝细胞，C+PS+S指在胶原涂覆的培养瓶中在补充了5％PS和5％Sertoli-条件生长培养基(S)的培养基中生长的肝细胞；
图3：描述如实施例2.4中所述的，通过于补充了猪血清(F+PS)的生长培养基中的成纤维细胞、于补充了猪血清(Hep+PS)的生长培养基中的肝细胞、于补充了胎牛血清(Hep+FBS)的培养基中的肝细胞制备白蛋白的图示；
图4：描述如实施例4中所述，通过本申请的标准方法并通过冷缺血方法分离的肝细胞细胞数的图示；
图5：描述了如实施例4所述，通过本申请的标准方法并通过冷缺血方法分离的肝细胞制备白蛋白的图示；
图6：描述了如实施例4所述，通过本申请的标准方法并通过冷缺血方法分离的肝细胞以及通过胆囊细胞产生因子VIII的图示；
图7：表示如实施例6中所述，体外维持的白蛋白从掺入TheraCyte装置的肝细胞的释放；
图8：表示如实施例6中所述，体外维持的因子VIII从掺入TheraCyte装置的肝细胞的释放；和
图9：表示移植到血友病小鼠中的包囊化的猪的细胞的效应。
发明详述
首次令人惊奇地发现非肝细胞能分泌肝分泌因子。更具体地，已发现选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞的非肝细胞能体外分泌肝细胞因子。预期当这些细胞被移植到宿主体内时也将产生所述肝分泌因子，并可用于治疗与降低的肝分泌功能有关的肝疾病和病症。本发明还涉及至少一种能分泌肝分泌因子的非肝细胞细胞类型与肝细胞结合在用于植入人类宿主以治疗肝疾病和病症的组合物中的用途。
还令人惊奇地发现能分泌肝分泌因子的肝细胞和非肝细胞可利用冷缺血步骤进行分离以产生能在长期培养中产生因子VIII和其它肝分泌因子的更耐用和更有活力的细胞。这种细胞随后适于掺入可植入装置中，用于植入患者以治疗肝疾病和病症。
本发明的方法、组合物和装置可用于有需要的个体的各种生物学活性的肝分泌因子的长期、生理学-应答性供给，和/或提供给需要其的个体所需的肝代谢和/或生理功能。用于本发明的方法中的生物学活性因子包括通常由肝分泌的多种分子。例如，因子VIII可投递给A型血友病症者，α1-抗胰蛋白酶可投递给患有α1-抗胰蛋白酶缺乏的患者。
本申请所述的方法、组合物和装置还可以用于恢复或增强重要的肝介导的代谢和/或生理功能，如通过至少一种非肝细胞细胞类型(其令人惊讶地显示出肝细胞样特性)从血液清除毒素或有害代谢物(例如，胆固醇)。具体地，至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞。本发明的组合物和装置使得整个治疗持续期间无需伴随免疫抑制受体的细胞移植成为可能。通过使用本发明方法、组合物和装置，特定物质的体内稳态度和/或代谢和/或生理功能可恢复和长期维持。
肝功能的丧失或衰退产生大量疾病、病症和缺陷。例如，单独地与肝有关的先天性代谢缺陷个体很罕见，但总起来说是常见的。与肝有关的大部分先天性代谢缺陷的生物学基础是单基因缺陷，其导致蛋白质、碳水化合物或脂肪的合成或分解代谢的异常。与肝有关的绝大多数先天性代谢缺陷归因于生物学因子如酶或蛋白质的缺乏，其导致代谢途径的阻断。病理生理学影响最常见是由阻断前有毒的底物的累积，来自替代代谢途径的中间体的累积，和/或由于阻断后产物缺乏引起的能量产生和利用的缺陷而导致。
例如，血友病A由通常由肝产生的凝血因子VIII的遗传缺陷导致。当血液中存在小于1％的正常因子VIII的活性时，发生应答微小损伤的严重的出血发作。
血友病影响全世界约1/10,000的婴儿安全出生。这些病例的约1/3为严重类型。
已建立的治疗通过注射缺少的FVIII进行替代。分离的FVIII最初来自血液的半纯化形式，因此产生了与血液来源产品相关的问题，如成为传染剂的潜在来源，如HIV或乙型肝炎和丙型肝炎。源自血液的FVIII已部分由重组的因子VIII替代。
理想情况是，预防性地给予FVIII，但治疗非常昂贵的(约 $100,000/年)。此外，在患者体内可能产生中和抗体，抑制被注射的因子的活性。
有时，血友病A患者由于从来源于血液的FVIII患上肝炎从而导致肝功能衰竭而经受肝移植。这些情况中，已有血友病的完全治愈。
适于用本发明的方法、组合物和装置治疗的疾病或病症的实例包括以肝细胞死亡或机能障碍为特征的疾病或病症，包括但不限于例如由感染如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染引起的慢性肝功能不全、肝功能衰竭或肝疾病，以及酒精性肝病。
适于用本发明的方法、组合物、装置和聚集体治疗的疾病或病症的其它实例包括以下：以细胞死亡或机能障碍为特征的疾病(包括但不限于内分泌疾病、糖尿病、先天性肾上腺增生和肾上腺功能不全、甲状腺机能减退疾病、甲状旁腺机能减退疾病、性腺功能减退症、尿崩症、生长激素缺乏)、亚氨基酸代谢紊乱(包括但不限于血脯氨酸过多症、羟脯氨酸血症)、色氨酸代谢紊乱(包括但不限于黄尿酸尿症、羟基犬尿酸症、类癌综合征、犬尿酸尿症、二氢蝶呤还原酶缺乏(Dihydropleridine reductase deficiency))、γ谷氨酰基循紊乱(包括但不限于谷氨酸脱羧酶缺乏、谷氨酸盐脱氢酶缺乏、5-羟脯氨酸尿症(焦谷氨酸尿症)、谷胱甘肽血症、γ-谷氨酰基-半胱氨酸合成酶缺陷)、有机酸尿(包括但不限于甲基丙二酸血症，丙酸血症包括但不限于甲基巴豆酰基甘氨酸尿症、甲基-羟丁酸尿症、羟甲基谷氨酸尿症、琥珀酰-CoA)、3-酮酸CoA-转移酶缺乏、乳酸和丙酮酸中毒、苏氨酸敏感的酮酸中毒包括酮硫解酶缺乏、非酮二羧酸尿、血浆铜蓝蛋白缺乏(金尼埃-威尔逊病)、C′1-酯酶抑制剂缺乏、转铁蛋白血症、1-抗胰蛋白酶缺乏、淀粉样变性、无纤维蛋白原血症、凝血因子缺乏)、酶缺乏病(包括但不限于过氧化氢酶缺乏症(Acutalasia)、葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶缺乏、假胆碱酯酶缺乏、低磷酸酯酶症)、免疫球蛋白(抗体)缺乏综合征(包括但不限于先天性低丙球蛋白血症、具有淋巴细 胞减少和胸腺淋巴细胞形成的X-连锁的隐性性状、无淋巴细胞减少的X-连锁的隐性性状、有或无淋巴细胞减少的偶发先天性、共济失调性毛细血管扩张症、维-奥二氏综合征、包括瞬时的丙种球蛋白异常血症、包括先天性的丙种球蛋白异常血症、包括获得性的丙种球蛋白异常血症、腺苷脱氨基酶缺乏、嘌呤核苷酸焦磷酸酶缺乏)、氨基酸病症(包括血丙氨酸过多)、蛋白质代谢的先天性障碍(包括但不限于白蛋白血症、先天性低蛋白血症、无征状蛋白质缺乏)、红血球病症(包括但不限于丙酮酸激酶缺乏、己糖激酶(HK)缺乏、己糖磷酸(PHI)异构酶缺乏、磷酸丙糖异构酶(TPI)缺乏、2，3二磷酸甘油酸异构酯变位酶缺乏、磷酸甘油酸激酶(PGK)缺乏、腺苷三磷酸酶(ATP-ase)缺乏、葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶(G-6-PD)缺乏、还原性谷胱甘肽缺乏、谷胱甘肽还原酶缺乏、谷胱甘肽过氧化物酶缺乏、谷胱甘肽合成缺陷、正铁血红蛋白还原酶)、半乳糖血症、过氧化氢酶缺乏症、精胺琥珀酸尿、色素代谢病症(包括但不限于白化病、卟啉症包括先天性红血球生成紫质症、红细胞生成原卟啉症、肝性卟啉症包括急性间歇性(Swedish型)卟啉症、遗传性类卟啉症、混合的或多样化的正卟啉症、皮肤肝卟啉症(tarda)、血胆红素过多，非结合的的血胆红素过多包括：葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶缺乏、克-纳二氏综合征、结合的血胆红素过多包括：杜-约二氏综合征、罗托尔氏疾病、正铁血红蛋白血症、低血色素症、黑色素色素沉着病症)、嘌呤代谢病症(包括但不限于黄嘌呤尿、血尿酸过多、痛风、莱-纳二氏综合征、继发尿酸血症)、糖代谢病症(包括但不限于半乳糖血症、半乳糖激酶缺乏、二磷酸尿苷半乳糖-4-差向异构酶缺乏、遗传性果糖不耐症(HFI)、果糖-1，6-二磷酸酶缺乏)、多糖代谢病症-糖原贮存疾病(糖原病)(包括但不限于I型糖原贮积病(肝肾GSD)、Ib型(肝肾GSD)、II型糖原贮积病(普通GSD)、III型糖原贮积病(局限性糊精聚积病)、IV型糖原贮积病(支链淀粉病)、V型糖原贮积病、VI型糖原贮积病、VII型糖原贮积病、 VIII型糖原贮积病、糖原合成酶缺乏(糖原贮积病)、肌肉己糖磷酸异构酶缺乏)、粘多糖代谢紊乱(包括但不限于I型粘多糖病、II型粘多糖症、III型粘多糖病(A、B和C)、IV型粘多糖病(A和B)、VI型粘多糖症病、VII型粘多糖病)、糖蛋白贮存疾病(包括但不限于甘露糖苷过多症、Fucidosis、Aspartylgucoaminuria)、氨基酸代谢病症(包括芳香族氨基酸代谢病症包括但不限于苯酮尿、二氢蝶啶还原酶缺乏、甲基杏仁酸尿、血酪氨酸、酪氨酰基尿、酪氨酸代谢病、里-汉二氏综合征、白化病、黄色素过多症、赫-普二氏综合征、切-东二氏病、克罗斯氏综合征、自主神经功能异常(赖-戴二氏综合征))、含硫氨基酸(胱氨酸、胱硫酮、高胱氨酸、甲硫氨酸)的代谢病症(包括高胱氨酸尿、有甲基丙二酸尿的高胱氨酸尿、N5，10亚甲基酯氢叶酸还原酶缺乏、胱硫醚尿，亚硫酸氧化酶缺乏包括β缩硫醇乳糖酶-半胱氨酸二硫化物尿、胱氨酸尿、胱氨酸过多症、甲硫氨酸尿过多症、蛋氨酸吸收不良(Oast-house综合征))、与血氨过多有关的病症(包括但不限于精胺琥珀酸尿、Citullinaemia、血鸟氨酸过多、精氨酸过多、N-乙酰基谷氨酸合成酶缺乏、氨基甲酰磷酸合成酶缺乏、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏、血鸟氨酸)、赖氨酸代谢病症(包括但不限于血赖氨酸过多、具有血氨过多的周期性血赖氨酸过多、酵母氨酸尿、血哌可酸、α-酮己二酸尿、戊二酸尿、巴豆酸尿、羟赖氨酸血症、羟赖氨酸尿、埃-丹二氏综合征(VI型))、支链氨基酸代谢病症(包括但不限于槭糖尿疾病、血亮氨酸-异亮氨酸过多、甲基丙二酸尿、丙酸尿、甲基巴豆酰基甘氨酸尿、α甲基羟丁酸尿、甲基谷氨酸尿、羟甲基谷氨酸尿、异戊酸血、血缬氨酸过多)、组氨酸代谢病症(包括但不限于：血肌肽、尿刊酸尿；叶酸代谢病症(环水解酶和亚胺甲基转移酶缺乏)、谷氨酸盐亚胺甲基转移酶缺乏)、甘氨酸代谢病症(包括但不限于血甘氨酸过多、D-甘氨酸血、草酸盐沉着症、肌氨酸血、三甲基氨尿)、脂代谢紊乱(包括但不限于血脂蛋白过多，包括家族性血乳糜微过多(I型)、家族性 血脂蛋白过多(家族性血胆固醇过多)(IIA型)、复合血脂过多IIB型、Broad-疾病(III型)、前血脂蛋白(IV型)、具有前血脂蛋白的血乳糜微滴过多(V型))、血脂蛋白过少(包但不限于血脂蛋白(棘红细胞增多症)、家族性(原发)血β脂蛋白过少、家族性α脂蛋白缺乏(丹吉尔病)、家族性卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏(LCAT))、脂贮积疾病(包括但不限于粘脂贮积病I型(脂粘多糖贮积病)、粘脂贮积病II型(I细胞疾病)、粘脂贮积病III型(假胡尔勒氏多种营养不良)、GM1常见神经节苷脂贮积病、GM1青少年神经节苷脂贮积病、具有己糖氨酶A缺乏的GM2神经节苷脂贮积病(泰-萨二氏病)、具有己糖氨酶A和B缺乏的GM2神经节苷脂贮积病(Sandhoff病)、尼-皮二氏病(鞘磷脂贮积)、异染色性脑白质障碍症(硫脂贮积)、高歇氏病(脑苷贮积)、法布里氏病(神经酰胺三己糖脂沉积)、酸酯酶缺乏(沃耳曼氏病))、钙、磷、镁和其它矿物质的病症(包括但不限于高血钙状态包括降钙素缺乏、维生素D-耐受(高磷酸盐尿)佝偻病)、维生素D-依赖的佝偻病、其它矿物质如铜的缺乏或过量例如威尔逊氏病、门克氏钢发综合征(Menkes steely hair syndrome)、铁(例如血转铁蛋白、低血色素、先天性铁过多)、锌(例如肠病性肢皮炎)等等。
如其它器官的许多疾病，肝移植常常为与肝代谢缺陷有关的疾病的优选疗法。例如，肝移植为已建立用于末期肝疾病的治疗。然而，如大多数其它的移植疗法，肝移植受合适的供体器官不足的限制。
已建议将肝细胞的移植作为用于肝疾病完整器官移植的替代方案(Asonuma，et al.，J.Ped.Surg.，27：298-301(1992))。该作者报道单一代谢缺陷可用肝体积(liver mass)的12％替代而治愈，表明一个肝可用于数个患者，或活供体的肝的部分切除能提供必需的肝块以治疗他人。
移植的细胞制造和分泌有治疗价值的物质或提供所需代谢功能，并因此提供完整器官移植的替代方案的能力已引导开发用于维持需 要治疗的个体体内的细胞的可植入装置。
为了利用肝细胞移植替代或增强肝功能，不考虑细胞投递的方法，关键是确保移植细胞的存活和生长。之前对肝细胞移植的研究已报道门腔分流(PCS)与肝细胞移植一起进行改善肝细胞的移植(Uyama，et al.，Transplantation 55：932-935(1993))。然而，需要肝功能替代的患者，如血友病症者或肝功能衰竭患者，已处于受损害的情况，而PCS的负载可能对该群体不可行。
本发明提供了用于培养肝细胞并且进一步培养当植入受体时能分泌一或多种肝分泌因子和/或提供一或多种肝代谢功能和/或生理功能的至少一种非肝细胞细胞类型的改进的方法。本发明还涉及与肝细胞结合的至少一种非肝细胞细胞类型的用途，包括所述非肝细胞和肝细胞的共培养。
改进为肝细胞和非肝细胞的细胞分离过程中使用冷缺血步骤并且产生更实用和更有活力的细胞，其中当在包含同种异基因血清的培养基中培养时能在长期培养中分泌因子VIII和其它的肝分泌因子。所述细胞随后适于植入受体患者用于肝疾病和病症的治疗。
本发明因此涉及当利用改进的方法单独培养的肝细胞在植入有需要的患者时在治疗肝疾病或病症中的用途。或者，本发明涉及单独的或与所述肝细胞结合的非肝细胞在治疗肝疾病和病症中的用途。
在一优选的实施方式中，本发明公开的非肝细胞，例如胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和非实质细胞涉及新生儿细胞的组合物或掺入新生儿细胞的装置的制备和用途，所述新生儿细胞包括例如，至少一种新生儿非肝细胞细胞类型如新生儿胆囊细胞的“聚集体”。或者，该聚集体可包含非肝细胞的细胞和肝细胞的组合。
其中共培养一种以上的细胞类型，例如一种以上的非肝细胞细胞类型，或至少一种非肝细胞细胞类型和肝细胞，所述细胞可以例如通 过细胞与细胞的接触直接地相互作用，或例如通过分泌的因子包括激素、细胞因子或生长和/或营养因子而间接地相互作用。这种相互作用可通过在同种异基因血清存在的条件下培养所述细胞促进和/或增强。
在形成不同细胞类型之间的相互作用或在聚集体的形成中，优选包含至少一种非肝细胞细胞类型和肝细胞，共培养使得该细胞在移植到宿主中之前能够在存在由该细胞在体外产生的生长因子的条件下而生长的时间。例如，本申请人已发现非肝细胞细胞如果与肝细胞培养和/或与肝细胞相互作用和/或与肝细胞聚集，则将更好地维持其分泌功能和/或表型。
在一些实施方式中，至少一种非肝细胞细胞类型以及当存在时的肝细胞，优选源自与受体相同的物种。在其它的实施方式中，至少一种非肝细胞细胞类型和/或当存在时的肝细胞，来自不同于受体的物种。
本申请人还发现，对于制备包含至少一种非肝细胞细胞类型例如新生儿胆囊细胞的聚集体，在同种异基因血清存在的条件下培养使得该胆囊细胞在该细胞移植进入受体宿主之前，能够在体外存在同种异基因血清中的生长因子的条件下生长的时间。
本申请所使用的“聚集体”指如本申请所定义的至少一种非肝细胞细胞类型的聚集，当其植入受体时，处于一种免疫学上(但优选非生理学上)的隔离和/或豁免状态。聚集体可包含一种以上非肝细胞细胞类型。聚集体还可包含与肝细胞一起的至少一种非肝细胞细胞类型。
“非肝细胞细胞类型”指来自与肝相关的器官的细胞，所述器官包括胆囊、胆管和肝血管，所述细胞包括例如肝脏非实质细胞、胆囊细胞包括胆囊上皮细胞和胆囊内皮细胞、肝血管内皮和上皮细胞，以及能进行通常由肝和/或相关器官进行的代谢或生理功能和/或表达和 /或产生和/或分泌生物学活性分子的细胞(包括遗传修饰的细胞)。所述生物学活性分子在本申请中也称为因子。所述生物学活性分子可选自但不限于以下一或多种分子：凝血因子(例如因子VIII、因子IX、冯·维勒布兰德因子)、生长和/或分化因子(例如，生长激素及其类似物、胰岛素样生长因子及其类似物、肝细胞生长因子及其类似物、成纤维细胞生长因子及其类似物)以及酶(如戊二酰辅酶A，其缺乏引起I型戊二酸尿症)。
在优选的实施方式中，所述至少一种非肝细胞细胞类型为新生儿细胞类型。
“新生儿的”指即为或源自新生的和/或刚生的哺乳动物和/或指定为或与刚出生后的时期有关，其中所述时期在物种之间不同。例如，在人中新生儿期被为是出生后的第一个四周，例如在猪中则被认为是出生后第一个七至十天。
“同种异基因血清”指源自与细胞来源的物种相同的物种的适于细胞培养的血清。在本发明的实施例中，其中共培养来自不同物种的分泌细胞和伴细胞，同种异基因血清源自与分泌细胞来源的物种相同的种。
“因子”指由细胞产生的生物学活性分子。
“长期”指一周以上的时期，典型地延长至2-6周或以上。
“延长的时期”指一周以上，优选两、三、四、五或六周或以上的时期。
至少一种新生儿非肝细胞细胞类型，任选地与肝细胞一起的移植已研究作为实现长期维持肝细胞表型和/或功能例如产生和/或分泌一或多种因子和/或提供一或多种代谢和/或生理功能的能力的方式。本发明的方法、组合物和装置使新生儿非肝细胞当被移植入受体时能生存、生长、增殖并分泌肝分泌因子。
本申请的研究表明选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮 细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞的至少一种非肝细胞细胞类型，尤其是新生儿胆囊细胞，当利用本申请所述的方法进行分离时可体外分泌一或多种肝因子和/或维持肝代谢和/或生理功能。当根据本申请公开的方法进行培养时所述细胞生存并确实增殖。此外，预期所述细胞，当利用本申请所述的方法进行分离和培养时，将能在体内维持细胞表型以及长期移植入受体时肝分泌因子的分泌。
不希望受理论的束缚，本申请人认为至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞的分离和/或利用同种异基因血清的培养至少部分导致观察到的细胞表型和/或肝因子分泌功能的维持。
还涉及作为实现以下的方法的非肝细胞与肝细胞的共移植：
(a)防止免疫排斥；和
(b)非肝细胞的存活、生长和有丝分裂速率的刺激使其当被移植到受体中时释放生理学上适当的和/或有效量的一或多种肝分泌因子，和/或维持提供一或多种代谢和/或生理功能、生存更长和/或增殖的能力。
不希望受理论的束缚，本申请人认为通过所述肝细胞提供生长和/或营养和/或分化因子和/或功能至少部分导致非肝细胞细胞表型、生长、存活、肝分泌因子的分泌和/或防止移植的非肝细胞的免疫排斥的维持。
本发明进一步涉及至少一种非肝细胞细胞类型的用途，所述细胞类型包括至少一种新生儿非肝细胞细胞类型，所述非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞，任选地与肝细胞在以下聚集体或组合物中各自或相互作用地在一起：
■藻酸盐-胶囊形式-为移植的细胞提供额外的免疫防护。微胶囊化新生儿非肝细胞细胞和移植其的可行性在本申请实施例 5和6中被证实。肝细胞的移植在实施例6中被证实。
■皮下移植装置-其允许用于放置移植细胞的预血管化同种异基因胶原贮存器的开发。优选地，该移植装置为细胞不能渗透但蛋白质或分泌因子可渗透的，如可从TheraCyte，Inc.，Irvine，Calfornia获得的“TheraCyte”装置。
■基质制剂-其中待移植的细胞在补充天然碳水化合物聚合物的明胶、胶原和/或其它基质上培养。
■血浆凝血酶凝块-作为用于待移植的细胞的生物相容性容器装置的用同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
本申请证实了通过肝细胞和通过至少一种非肝细胞细胞类型对肝分泌因子分泌的维持。例如，本申请实施例2公开了非实质细胞以及胆囊和肝血管的上皮和内皮细胞中分泌细胞表型的维持。
本申请还描述了非肝细胞，尤其是胆囊细胞在同种异基因血清存在的条件下的培养。本申请还公开了具有含细胞来源的因子的成纤维细胞或支持细胞(已知的饲养细胞)的条件培养基的用途。不希望受理论束缚，申请人认为通过供给生长和/或营养和/或有丝分裂因子，同种异基因血清使肝因子分泌功能增强和/或体外细胞表型和/或寿命的维持，其可在体内持续。类似地，不希望受理论束缚，申请人认为条件培养基能增强肝因子分泌功能和/或维持体外细胞表型和/或寿命，其可在体内持续。
本申请证实了在补充了同种异基因血清的培养基中培养肝细胞对肝细胞功能的维持和肝细胞存活的增强的作用。例如，本申请实施例2公开了在补充了猪血清的培养基中培养猪肝细胞对因子VIII分泌细胞表型的维持的影响。
本申请还描述了条件培养基对肝细胞功能的维持和肝细胞存活的增强的影响。
提供以下实施例以举例说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：肝和胆囊细胞的分离和培养条件的优化
1.1肝细胞的分离
如下从新生猪的肝分离肝细胞。手术切除后，供体肝转移入净化室设备用于在含有添加0.2％人血清白蛋白(HAS)的冷Hank′s平衡盐溶液(HBSS)的50ml试管中在低温塑料容器中进一步处理。通过标准(Ricordi′s)胶原酶消化方法的主要改进对切碎的肝进行消化从而分离肝细胞。利用无菌技术，将所述肝除去过量脂肪、血管和结缔组织，切碎并且用 
(0.2mg/ml)在水浴(120rpm)中振荡消化10分钟。重复该消化步骤两次。用与 溶液混合的利多卡因进行消化以避免消化期间的细胞损伤。消化处理后，将细胞通过无菌的400mm网眼进入无菌烧杯中。分离后，将肝细胞在如本申请所述的各种培养基中进行组织培养。
1.2培养条件的优化
为了优化用于肝细胞存活和肝细胞表型维持的培养条件，评估补充各种添加剂的不同的培养基。
培养基：肝细胞在不同液体培养基中，在许多不同的表面上和涂有不同基质的表面上生长。用补充了0.5U/ml胰岛素(Novo Nordis，Denmark)、7ng/ml胰高血糖素(Novo Nordis，Denmark)、7.5μg/ml氢化可的松(Pharmacia，USA)、1ml/0.5L Cyproxin 200(Bayer，Germany))，加上添加剂例如cyproxin、烟酰胺(10mmol/L)和同种异基因血清(10％体积)的培养基DMEM/F 12(1∶1体积；InvitrogenCorporation，USA)发现最佳生长。胶原被发现是肝细胞生长的最佳表面基质。
1.3肝细胞环境
如下评估其中培养肝细胞的环境对肝细胞体外生长和功能的影响。
细胞-细胞外基质相互作用：使用胶原作为例证性细胞外基质评估肝细胞和细胞外基质之间的相互作用对细胞存活力和体外细胞特异性功能的维持的影响。
根据本申请的标准方法分离肝细胞。将等份肝细胞放入胶原涂覆的培养瓶和未涂覆的培养瓶中。使用补充了胰岛素0.5U/mL、胰高血糖素(7ng/mL)、氢化可的松(7.5μg/mL)和10％(体积)猪血清(PS；Invitogen Corporation，USA)的DMEM生长培养基(GM)。利用在缺乏猪血清的生长培养基中涂覆胶原的培养瓶中培养的肝细胞作为对照，评估同种异基因血清补充对肝细胞-细胞外基质相互作用存在下的细胞存活力和功能影响。
培养15天和18天后拍取细胞培养物的显微照片。
在培养的15和18天，在胶原细胞外基质存在下培养的肝细胞形成会合的单细胞层，而不管所述生长培养基中是否存在同种异基因血清。相反，在无胶原细胞外基质存在的条件下培养的肝细胞形成多个群落。用对肝细胞功能进行的检测评估所观察到的不同体外形态的功能重要性。每四天从每个培养瓶收集生长培养基用于白蛋白产生的分析以检查培养期间肝细胞的功能。白蛋白产生的结果显示于本申请实施例2中。
细胞与细胞间相互作用：将人成纤维细胞用作伴细胞研究在成纤维细胞-肝细胞共培养中细胞与细胞间的相互作用的功能。生长停滞的成纤维细胞和非停滞的成纤维细胞与肝细胞在下列实验条件下共培养：补充了10％的胎牛血清(FBS)或10％PS的GM中700000非停滞的成纤维细胞：250000肝细胞；补充了10％FBS或10％PS的GM中用 丝裂霉素C停滞的成纤维细胞：250000肝细胞的会合单细胞层。
共培养10、16、30和37天后通过显微照相评估细胞形态。对于每一细胞制备物，其中将细胞在无血清GM中培养的培养瓶用作对照。利用在以丝裂霉素-停滞的人成纤维细胞涂覆的尼龙网眼上培养的肝细胞还研究了3-维支持结构对细胞与细胞间相互作用的影响。简言之，尼龙网眼成功地涂覆有人成纤维细胞。随后用丝裂霉素停滞成纤维细胞。将肝细胞置于具有网眼的培养瓶中。5天后用新鲜培养基洗涤网眼并且放入新的培养瓶中。
未停滞的成纤维细胞很快生长超过肝细胞。细胞甚至在无血清GM中形成会合的单细胞层。具有在无血清GM中培养的肝细胞的对照培养瓶在培养7天后是空的(数据未显示)，这表明这些条件无法支持肝细胞存活。
补充了10％PS的GM中与停滞的成纤维细胞一起培养的肝细胞与补充了10％FBS的GM中的细胞相比呈现出更好的形态。通过形态学评估的细胞存活力在培养2-3周后最佳。
生长培养基的优化：评估添加具有不同血清的生长培养基对肝细胞生长和功能的影响。肝细胞(每个培养瓶250,000个细胞)在下列实验条件下在胶原涂覆的培养瓶中培养：补充了5％猪血清(PS)和5％的按照下述制备的支持-条件生长培养基的GM，具有5％PS和5％按照下述制备的猪皮肤成纤维细胞-条件生长培养基的GM，和10％PS。
支持-条件生长培养基如下制备：在收集生长培养基和过滤通过8微米滤器以除去细胞之前培养支持细胞至少24小时。过滤的培养基随后在使用前与DEEM以1∶1的比率稀释。
如以上制备支持-条件生长培养基那样制备猪皮肤成纤维细胞-条件生长培养基，其中用成纤维细胞替代支持细胞。如下分离猪皮肤成纤维细胞：将猪皮肤浸泡在加入cyproxin和两性霉素B的DMEM中 20分钟，然后用解剖刀切成小片。随后将组织片置于具有补充了10％PS的DMEM培养基的标准培养瓶中。培养一周后，除去组织片，洗涤粘附在培养瓶上的剩余细胞，并且添加新鲜的生长培养基。
补充了10％PS或5％PS以及5％猪皮肤成纤维细胞-条件生长培养基的生长培养基较补充了5％PS和5％支持-条件生长培养基的生长培养基产生更好的肝细胞存活力。通过形态学评估的细胞存活力在培养两至三周后最佳。
对培养中的细胞形态学分析表明对于肝细胞存活力和体外生长而言，生长培养基用同种异基因(猪)血清的补充优于用胎牛血清的补充。此外，生长培养基用10％PS，或5％PS和5％成纤维细胞-条件生长培养基的补充优于用5％猪血清和5％支持-条件培养基的补充。
1.4肝脏非实质细胞和胆囊细胞的分离
根据Gerlach et al.，(2001)的方法，经过以下修饰分离非-实质肝细胞(NPC)。简言之，将肝切成小片，并洗涤三次以除去红细胞。随后用 (0.2mg/ml)消化组织30分钟。用10％猪血清终止消化。肝细胞在50g沉淀5分钟。肝脏非实质细胞在600g沉淀10分钟，并且随后在PBS中洗涤三次。计数细胞，并且如上所述通过台盼蓝排阻检查其存活力。以10,000个细胞/瓶加入细胞。培养第7天，再次细胞计数并检查存活力。收集上清用于白蛋白ELISA和因子VIII功能检测。
从同一个新生猪肝分离10,000个NPC。分离后的即刻细胞存活力为100％。培养5天时因子VIII凝血的最大速率为0.2％。
从猪胆囊和肝血管分离上皮和内皮细胞。简言之，胆囊用无菌DMEM充分洗涤以除去胆汁，切成片，并且用 
(0.2mg/ml)消化30分钟。然后，用DMEM洗涤细胞三次。分离后立即进行细胞计数和存活力检测，并且在培养第7天、第16天和第28天再次进行细胞计 数和存活力检测。将细胞以15×106个细胞/瓶加入25cm2的培养瓶中。在培养第7天进行白蛋白和FVIII释放功能检测。
从猪胆囊和肝血管分离31×106个细胞。分离后的即刻细胞存活力为100％。培养第16天，细胞存活率为120％。最大白蛋白产量为2.27μg/ml/4h，而因子VIII凝血的最大速率为3.7％。
实施例2：细胞的表征：分泌功能和细胞标记
为了确定培养的肝细胞和非肝细胞是否保持了肝因子分泌功能，进行下列实验。
白蛋白分泌
白蛋白是肝细胞分泌的主要的血浆蛋白质。在常规的培养法中，白蛋白的分泌速率在培养过程中迅速下降。肝细胞白蛋白分泌在此用于检测例如在培养中的正常肝细胞功能的维持，以及由此检测肝细胞表型的维持。
因子VIII
肝和网状内皮组织系统被认为是因子VIII产生的原始部位。在患有血友病的人中肝移植补偿了因子VIII的缺乏。因子VIII作为糖蛋白被分泌进入异源二聚体的循环中。因子VIII的产生可用于表征肝细胞。利用Dade-Behring凝结系统(Coatest VIII；来自Chromogenix的c/4)测量过滤的上清中存在的因子VIII。
2.1通过肝细胞产生白蛋白和因子VIII
根据上述方案从新生猪肝分离的肝细胞如上所述在优选的液体培养基中在胶原基质上培养5周。随后如下测定因子VIII和白蛋白的产生。
每瓶250,000个肝细胞在补充了添加剂的培养基中培养。除去和丢弃来自培养细胞的上清，培养物用PBS洗涤两次。然后，将5ml无血清培养基添加至该培养瓶中。立即从该瓶移出1ml等份的培养基并且用于基线测量。然后，于37℃温育细胞4小时。温育后，收集上清并过滤以除去细胞碎片。使用猪白蛋白ELISA Core Kit(Komabiotech)，根据厂商的方案测量过滤的上清中存在的白蛋白。利用Dade-Behring凝结系统测量过滤的上清中存在的因子VIII。
观察到因子VIII的产生，培养2周后细胞产生相当多的量并且维持因子VIII的产量5周(参见图1)，此时结束实验。
250,000个肝细胞超过4-小时的产量产生大约8％正常血液水平的因子VIII值。由于人血液中因子VIII的半衰期为36小时，该产率非常大。还应注意通过这些肝细胞制剂产生白蛋白与因子VIII的产生很好地相关。白蛋白为典型的肝产物，且白蛋白的产生指示肝细胞是健康的。
这些结果表明新生儿肝细胞能在培养过程中长期维持分泌的肝细胞表型。
在另一个实验中，收集自在以上实施例1中所述不同条件下培养的肝细胞收获的培养基(并且在底下再制备)作为肝细胞功能决定因素分析白蛋白含量。
1-在补充了10％FBS的生长培养基中丝裂霉素停滞的成纤维细胞上的肝细胞；
2-在补充了10％PS的生长培养基中丝裂霉素停滞的成纤维细胞上的肝细胞；
3-在无血清生长培养基中丝裂霉素停滞的成纤维细胞上的肝细胞，参见；
4-在补充了10％PS的生长培养基中胶原涂层上的肝细胞；
5-在补充了5％PS和5％成纤维细胞条件生长培养基的生长培养基中胶原涂层上的肝细胞；
6-在补充了5％PS和5％支持条件细胞生长培养基中的胶原涂层上的肝细胞。
如下分析白蛋白含量：在培养的第5、7、10、13、32和54天取出等份上清。首先，除去和丢弃来自培养细胞的上清，用PBS洗涤培养物。然后，添加5ml无血清生长培养基。立即从该培养瓶取走1ml等份的该生长培养基，并用于白蛋白产生的基线测量。随后将细胞在37℃温育四小时。温育后，收集上清并且过滤以除去细胞碎片。利用猪白蛋白ELISA Core Kit(Komabiotech)，根据制造商的方案测量过滤的上清中存在的白蛋白。根据最初的培养条件制备生长培养基，然后添加至培养瓶中用于继续培养。
如图2所示，在补充了猪血清(PS)的培养物中观察到最高的白蛋白产量。在补充了PS的培养基中在停滞的成纤维细胞上培养的肝细胞在培养第10天产生19.5μg/ml的最大白蛋白释放4小时(参见图2)。在补充了PS的GM中胶原基质上培养的肝细胞在培养第32天呈现38.3μg/ml的最大白蛋白释放4小时。
在补充了PS并且具有成纤维细胞-条件生长培养基的GM中培养的肝细胞的最大白蛋白产量为培养第32天的3.76μg/ml。在补充了PS并且具有支持-条件生长培养基的GM中培养的肝细胞的最大白蛋白产量为培养第13天的4.56μg/ml。
这些结果证实如通过白蛋白产量评估的肝细胞功能，当肝细胞在胶原涂覆的培养平中，在补充了10％PS的生长培养基中培养时得到最好的维持。肝细胞与细胞外基质之间的相互作用和同种异基因血清的存在对长期组织培养中肝细胞表型的维持很重要。预期类似的条件将在本发明的非肝细胞细胞培养物中产生最大量的肝分泌因子。
在另一个实验中，根据上述方法从雌性和雄性的大白/长白(White/Landrace)杂交新生猪分离肝细胞。将细胞以2×106个活细胞的密度接种在25cm的胶原涂覆的培养瓶(Sigma，USA)中，并于37℃，在95％大气和5％CO2的大气环境下维持在湿润的培养箱中。将细胞在DMEM/P12培养基和10％猪血清中进行培养。48小时后用PBS漂洗细胞，并添加新鲜培养基。根据需要，随后每2-3天添加新鲜培养基。
如上所述在第1、2和3周进行功能测试以测量白蛋白释放和因子VIII释放。还测定了细胞数目和存活力。猪的细胞的存活力在利用当前方法检测的所有时间点都是优良的(＞90％)(参见表2.1)。在分离后最初的24-48小时期间，活细胞数目下降(数据未显示)。然而，有活力的肝细胞的数目从该点直到3周后研究结束时几乎都呈直线增加。
利用白蛋白和因子VIII释放证实分离的肝细胞的肝细胞功能的维持。分离后1周，白蛋白和因子VIII都是可检测的。定量测定证明在每个细胞的基础上，白蛋白和因子VIII的释放从培养的1至3周显著提高(表2.1)。
表2.1分离的新生儿肝细胞的体外表征
| 分离后 的时间 | 细胞成活力 ％ | 细胞数106 (增殖) | 白蛋白释放 (μg/ml) | 因子VIII释放 (mU/ml) |
| 1周 | 91.3(90.0-93.0) | 0.25(0.2-0.3) | 1.7(0-2.8) | 1.1(0.03-1.9) |
| 2周 | 89.8(86.5-93.4) | 1.1(0.9-1.4) | 11.6(8.3-14.8) | 3.3(2.4-3.1) |
| 3周 | 89.2(84.9-93.4) | 2.6(2-3.25) | 29.4(26.3-32.5) | 11.9(11.3-13.4) |
白蛋白和因子VIII释放的数据以每一百万个细胞表示。
2.2靛氰绿的摄取
靛氰绿(ICG)为无毒有机阴离子，其被用于临床试验以评估肝功能，因为其仅通过活体内的肝细胞消除。已将ICG摄取用以鉴定来 自培养的干细胞的分化的肝细胞(Yamada et al.，2002)。本研究中，ICG的细胞摄取被用于鉴定在用以确定长期维持肝细胞功能的最佳培养条件的筛选法中培养的肝细胞。
以1mg/ml的浓度将ICG溶于5ml无菌水和具有10％PS的20ml
DMEM中进行使用。将该ICG溶液添加至细胞培养瓶中，并于37℃温育15分钟。用PBS漂洗培养瓶三次后，通过显微镜方法检测ICG的细胞摄取。检测后，用新鲜的生长培养基重新装满培养瓶。
分离的新生儿肝细胞的显微镜检测显示大约50％的细胞为ICG阳性。
在另一个实验中，通过在胶原涂覆的培养瓶中，在补充了10％PS的培养基中培养的新生猪肝细胞测定ICG的摄取。培养3周后，ICG阳性细胞的百分比非常高并且在80-90％之间的范围。温育4小时后几乎所有细胞都释放已摄取的ICG，其中所述释放为代谢后的释放的标记。
长期组织培养中肝细胞功能的维持可以容易地通过ICG摄取进行评估。此外，给组织培养的肝细胞施用ICG是体外操纵肝细胞功能和控制肝细胞分化的有用方法。
2.3不同细胞类型的分泌功能
利用因子VIII分泌和白蛋白的产生作为分泌的肝细胞功能的标记评估用于从组织分离肝细胞的方法对维持肝细胞功能的重要性。还评估了来自肝的非实质(NPC)细胞和来自胆囊和肝血管的上皮和内皮细胞呈现和维持培养中分泌的肝细胞表型的能力。
将一只新生的(一周龄)小猪和一只大约6月龄的猪用于以下实验。如所示，收获培养细胞的上清，并且进行白蛋白释放和因子VIII功能测试(分别如本申请所述的ELISA和凝血试验)。如所示，还进行ICG摄取试验。
根据本申请所述的标准方法，用LiberaseR(0.2mg/ml)消化两轮，每轮10分钟，从一只新生猪的肝分离肝细胞。分离后，计数细胞并且以4.5×106个细胞/瓶接种25cm2的培养瓶。培养5天后计数细胞，并且如上所述通过台盼蓝排阻检查其存活力。在培养第5天评估白蛋白和因子VIII的释放。
利用因子VIII凝血检测(CoatestVIII：来自Chromogenix的C/4)根据厂商的方案测量因子VIII的产生。因子VIII凝血率的百分比值与因子VIII的正常血液水平时的因子VIII凝血率有关。
如上所述从一只新生猪的肝分离37×106个肝细胞。分离后的即刻细胞存活力为98％。培养5天后，细胞存活率平均为60％。培养5天后培养物中的白蛋白产量为4.45μg/ml/4h。因子VIII凝血最大速率为0.2％。ICG染色被用以确定细胞培养物中肝细胞的百分比。培养4周后，正常肝制备物中43％的细胞为ICG阳性。
肝脏非实质细胞(NPC)分离自用于肝细胞分离的相同的肝。正如之前的报道所期望的那样(Gerlach，2001)，细胞产量低。尽管如此，这样分离的NPC能产生因子，并且甚至以约三分之一的细胞量产生大致与肝细胞相同量的因子VIII(大约0.2％)。
从小猪胆囊和肝血管分离上皮和内皮细胞。这些细胞在培养中呈现良好的生长，在所用的培养条件下增殖，并且呈现3.7％的因子VIII的最高凝血率。
2.4长期培养的肝细胞的增殖和功能的维持
评估细胞分离方法和培养条件对细胞增殖和分泌功能的影响。
细胞增殖：根据本申请所述的标准方法分离新生儿肝细胞。将250,000个细胞接种于培养瓶中，并且在补充了10％FBS的生长培养基中培养。在培养第1天、培养第7天、培养第14天、培养第21天测定细 胞在培养物中的增殖。
相对培养第1天，补充了10％FBS的生长培养基中活细胞数目为第7天的20％、第14天的203％和第21天的287％。
白蛋白释放：在补充了10％PS或10％FBS的生长培养基中培养肝细胞，并如上述在培养第1、2、3、7、8和9周检查白蛋白的释放。将与补充了10％PS或10％FBS的生长培养基中的猪成纤维细胞用作阴性对照。
在第9周观察到在补充了10％猪血清的生长培养基中培养的肝细胞的最大白蛋白释放(19.1μg/ml/4h)。在阴性对照中观察到白蛋白的产量的上升，第3周具有0.67μg/ml的最大白蛋白释放(参见图3)。
培养第7天的低细胞存活力表明肝细胞在分离步骤期间受到损伤。然而，在这些条件下，所述肝细胞能够恢复并且增殖。
培养中白蛋白的产生受到数周的抑制，白蛋白释放显著低于本申请中其它处的描述。然而，在这些培养条件下肝细胞功能再次在培养8-9周后恢复。
如所述可以成功地培养分离和培养的肝细胞以离体维持肝细胞功能(包括肝肝细胞分泌功能)至少9周。
2.5免疫过氧化物酶细胞表征
开发了辨别培养物中的不同肝细胞群体的免疫过氧化物酶方法。用肝细胞特异性抗原对成年猪和新生猪的肝染色，并且针对冯·维勒布兰德因子辨别内皮细胞和肝细胞。使用以下标记：用于成熟肝细胞的肝细胞抗原和细胞角蛋白、用于内皮细胞的冯·维勒布兰德因子、用于间充质来源细胞的波形蛋白、以及鉴定是因子VIII的主要产生者的细胞的因子VIII。
新分离的肝细胞或组织经福尔马林固定、石蜡包埋，并且切成 2μM一段。将未染色的载玻片在二甲苯中脱蜡并在梯度乙醇中水合。用0.5％H2O2处理载玻片5分钟以阻断内源过氧化物酶的活性。利用DAKO EnVision System根据厂商的方案用一抗对切片进行染色。用一抗温育切片30分钟，随后与过氧化物酶-标记的聚合物温育30分钟，并以底物-生色团温育5分钟。载玻片用苏木精复染。
下表概述了细胞群体的表征。
表2.2：细胞类型的表征
| 细胞类型 | 肝细胞 | 胆囊上皮细胞 | 来自肝血管 的内皮细胞 | 来自肝的 NPC |
| 白蛋白分泌 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 因子VIII分泌 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| ICG摄取 | 60-95％ 阳性 | ＜1％阳性 | ＜1％阳性 | ＜30％ 阳性 |
| 免疫过氧化物酶标记 甲甲胎蛋白 细胞角蛋白CK7 波形蛋白 | 阳性 阴性 阴性 | 阴性 10％阳性 阴性 | 阴性 阴性 阳性 | 阴性 阴性 阳性 |
NPC＝肝脏非实质细胞
2.6分泌细胞与伴细胞的共培养
申请人共培养了非肝细胞与肝细胞的各种组合，并研究了其对因子VIII产生的影响。表2.3中概括的数据表明因子VIII分泌通常在非肝细胞与肝细胞的共培养物中显著增强。
表2.3：共培养对因子VIII分泌的影响
| 共培养的组织或细胞组合 | 释放的因子VIII (μU/ml) |
| 试验A | |
| 肺组织 | ＜0.1 |
| 肺组织+肝细胞(0.5×106个细胞) | 0.35 |
| 胆囊上皮细胞(106个细胞) | 1.02 |
| 胆囊上皮细胞(106个细胞)+肝细胞(0.5×106个细胞) | 0.48 |
| 内皮细胞(106个细胞) | ＜0.1 |
| 内皮细胞(106个细胞)+肝细胞(0.5×106个细胞) | 0.97 |
| 肝细胞(106个细胞) | 0.58 |
| 试验B | |
| 胆囊上皮细胞(0.5×106个细胞) | 0.65 |
| 胆囊上皮细胞(0.5×106个细胞)+肝细胞(0.5×106 个细胞) | 1.15 |
| 胆囊上皮细胞(0.5×106个细胞)+肝细胞(1.0×106 个细胞) | 0.94 |
| 胆囊上皮细胞(0.5×106个细胞)+肝细胞(1.5×106 个细胞) | 1.22 |
| 内皮细胞(106个细胞) | 0.15 |
| 内皮细胞(106个细胞)+肝细胞(100,000个细胞) | 0.68 |
| 肝细胞(1×106个细胞) | 0.64 |
实施例3：肝细胞的冷藏
根据上述本申请的标准方法以及另外根据改进的方法分离肝细胞，其中在分离过程中在补充了PS的培养基中用 进行消化。
集合分离的肝细胞，随后根据所述的标准方法在以下三种不同条件下冷冻：于FBS中的10％DMSO、于GM中的10％FBS和10％DMSO、以及于PS中的10％DMSO。将细胞保存在液氮中。贮存一周和三周后，解冻细胞并测定存活力和恢复率。结果概括于表3.1中。
液氮中贮存一至两周后，细胞维持良好的存活力和恢复。根据本申请的改进方法分离并且冷冻于于PS中的10％DMSO中的肝细胞中观察到冷藏的肝细胞最佳的存活力和恢复。预期如上述肝细胞一样，非肝细胞在冷冻贮藏后也将是有活力的并能被培养。
表3.1：肝细胞冷藏
存活力是活细胞的百分比。恢复率是解冻后的活细胞的百分比。
ND＝未检测到。
实施例4：细胞分离过程中的缺血
如下评估细胞分离过程中不同的缺血方式以及分离方法本身对肝细胞功能和肝细胞功能的维持的影响。
4.1冷缺血
如下评估细胞分离过程中，冷缺血对肝细胞功能的影响。将肝切成小片，并将其放入大量冷DMEM中于4℃贮藏24小时。然后，根据本申请所述的标准方法分离肝细胞和NPC。
使用上述冷缺血方法从一头猪的肝分离251×106个肝细胞。分离后的即刻存活力为21％，52×106个细胞分离存活。使用标准方法并利用冷缺血分离的活细胞的数目无显著不同(参见图4)。
从相同的肝分离444×106个非实质细胞(NPC)。分离后的即刻存活力为6.3％。利用冷缺血方法进行分离后，培养物中95％的细胞为ICG阳性。
关于因子VIII和白蛋白分泌，利用冷缺血方法分离的肝细胞在所有时间点较通过标准方法制备的细胞分泌明显更多的白蛋白(参见图5)。因子VIII的产生是可变的，但在通过1天和7天后通过冷缺血产生的肝细胞中明显变少(参见图6)。
不希望受理论的束缚，申请人认为分离过程中的缺血可产生更耐用的和有活力的肝细胞和非肝细胞群体，其中在长期培养中维持肝细胞分泌的肝细胞功能。
4.2上皮细胞和内皮细胞的分离
如下从猪胆囊和肝血管分离上皮细胞和内皮细胞。简言之，用无菌DMEM充分洗涤胆囊以除去胆汁，切成片，并用 溶液(0.2mg/ml)消化30分钟。随后用DMEM洗涤细胞三次。分离后，立即以及在培养第7天、第16天和第28天进行细胞计数和存活力检测。将细胞以15×106/瓶接种于25cm2培养瓶中。
培养4周后观察到相当多的因子VIII通过分离自猪胆囊的上皮细胞和内皮细胞释放(参见图6)。
分离自肝血管的细胞也在培养4周后呈现相当多的量的因子VIII释放(未显示)。
总之，利用低 浓度的标准分离技术提供细胞产量和存 活力的良好结果。在这种情况下，利用本申请人的冷缺血方案分离的细胞的存活力与利用标准方法获得的细胞的存活力相当。然而，如通过更高的白蛋白释放证实的那样，冷缺血分离后培养的这些非肝细胞较通过标准方法分离的那些非肝细胞显示出更好的功能恢复。
无论使用何种分离方法，培养细胞在培养中维持肝因子的分泌功能。申请人的数据表明分离自猪胆囊和肝血管的上皮细胞和内皮细胞在培养中分泌因子VIII，超过在相同的时间点在肝细胞中观察到的。
实施例5：非肝细胞和/或肝细胞的包囊化
开发了包囊化单细胞和细胞簇的非肝细胞和/或肝细胞的方法。
分离自猪胆囊和肝血管的细胞以及肝细胞(如上所述)可通过已知方法利用1.5％的藻酸盐进行包囊化以形成胶囊(WO01/52871)。
可以对单细胞和细胞簇进行包囊化，并且通过显微镜方法确定胶囊的完整性。对于单细胞和细胞簇两者而言，没有细胞应当包埋在胶囊壁中，并且优选大致均匀形状和大小的胶囊(直径200μm)。
小鼠肝细胞在藻酸盐中(1.5％)的包囊化得到良好形状和完整性的胶囊，没有细胞被包埋在胶囊壁中，表明来自猪以外哺乳动物的肝细胞可以形成聚集体和/或包囊化。
实施例6：移植
考虑了两种非肝细胞的移植输送模式：藻酸盐包囊化和掺入TheraCyte装置中。认为所述装置将允许所述细胞维持肝因子的分泌功能并允许在体外和体内释放因子VIII。
藻酸盐包囊化
可通过已知的方法利用不同的藻酸盐浓度(1.5％、1.6％和1.7％)在藻酸盐中对非肝细胞进行包囊化以形成胶囊。也可利用使用聚鸟氨 酸(PLO)或聚赖氨酸(PLL)涂层的包囊化以改善胶囊的完整性和因子VIII的释放。另外，单个细胞和细胞簇都可进行包囊化。
可以将具有单个非肝细胞或细胞簇的胶囊移植到宿主动物中。含有肝细胞的胶囊在移植到CD1小鼠3周后仍然保留活力。预期含有非肝细胞的胶囊也将在类似的时期保留活力。可通过台盼蓝和吖啶橙/丙锭碘酸盐染色检查细胞存活力。恢复的肝细胞的约65％为ICG阳性，这表明大部分恢复的细胞是成熟的肝细胞。
掺入TheraCyte装置
可以将一百万个肝细胞和/或非肝细胞装载入TheraCyteTM装置中。对于体外分析，TheraCyteTM装置可在如上所述补充了10％同种异基因血清的培养基中体外维持。然后，可测量从体外维持的TheraCyteTM释放的白蛋白和因子VIII。可进行因子VIII凝血测定以检查因子VIII以不再培养时释放的量相当的量从TheraCyteTM装置释放。
为了检测体内效力，TheraCyteTM装置可经皮下移植入宿主动物中。可取回TheraCyteTM装置，并如上测量细胞存活力。组织学研究也可有用于确证在移植部位周围的组织中无炎症反应。
在一个实验中，测定了新生猪的肝细胞移植入异种宿主后肝细胞的存活和肝细胞功能的维持。用上述冷缺血步骤进行分离后，在胶原涂覆的培养瓶中，在补充了10％PS的培养基中培养新生猪的肝细胞。利用蛋白酶(TrypLE Select，Gibco，USA)从培养瓶除去细胞并且在3ml PBS中简单漂洗。然后，将细胞以1×106/20μL的浓度进行悬浮，并且利用制造商详述的标准方法装载入20μl免疫隔离的20μL的TheracyteTM装置中。利用氟烷(2％)麻醉CD1小鼠(N＝3)，并且在腹部形成小的1cm的切口。将所述装置小心地置于肝上并且缝合切口。所有过程利用无菌技术进行。八周后，从所述动物移去该装置用于细胞存活力的测定。移去一个装置并且立即在10％缓冲福尔马林中进行 固定。将该装置包埋在石蜡中并且3μM厚的切片用苏木精和伊红染色(H&E)。移去剩下的2个装置并且切开以从该装置冲洗出包囊化的细胞用于存活力测定和ICG分析。
该TheracyteTM装置在所有移植的动物都很耐受。全部三只小鼠在8周的移植期内保持非常健康的和有活力。死后分析未揭示任何如腹膜表面出现的标准的苍白和反光的炎症迹象。如预料的那样，该装置稍微粘附于周围的器官包括肝，但在几乎不干扰周围组织/脉管系统的条件下被移去。
在第8周回收装置的H&E-染色的切片支持腹腔内8周后该装置的生物相容性。粘附于TheracyteTM装置的组织包括组织化的纤维组织。明显缺乏任何急性炎症细胞反应，以及缺乏明显的环形细胞浸润。该装置内有许多随机分布于整个腔内的边界明确的有活力的肝细胞块。从剩下的2个细胞装载装置除去肝细胞，并利用上述ICG测试检测存活力和功能。因为8周后体内ICG-阳性细胞的比例为80-90％，相对移植前的值，没有有活力的/功能细胞的数目的降低。利用台盼蓝排阻的进一步的分析证实大约90％的回收细胞是有活力的。
上述研究表明在移植的藻酸盐胶囊和移植装置如TheraCyteTM装置中，肝细胞的存活力、功能和表型可长期维持。另外，移植的肝细胞不激发免疫反应，且与受体免疫隔离。预期非肝细胞的移植将证实同样地有效。
还在补充了10％PS的培养基中体外检测装载肝细胞的TheraCyteTM装置，并测量从TheraCyteTM装置释放的白蛋白和因子VIII。结果表明TheraCyteTM装置释放白蛋白和因子VIII达六周(参见图7和8)。虽然分泌的因子少于培养物中的游离细胞分泌的，其仍然以生理学有效量分泌(图7和8)。
实施例7
移植入血友病小鼠中的有效包囊化的猪的细胞
在Brown University以Black/6：129混合背景繁殖因子VIII缺乏小鼠的群体。虽然该品系仍然产生正常量的因子VIII，但由于该蛋白质中的点突变其在生物学上是无活性的。
利用上述冷缺血方法分离并且根据本发明制备和培养猪新生儿和成年肝细胞。将全部新生儿细胞或成年细胞稀释至5百万个细胞/mL的浓度，并且在标准的PLO涂覆条件下包囊化于Medipol藻酸盐中。
以同样的方式制备空胶囊。在体外保存胶囊3天，在血清培养基和HBSS中进行洗涤，并植入小鼠IP腔中。中线剖腹术产生约5-8mm的长度，并使用无菌的2mL血清移液管用于导入悬浮于600μl HBSS中的400μL胶囊，在1mL输送载体中含有总共2百万个细胞。用8-0尼龙分别闭合所述切口和底下的肌肉。在控制条件下尾部放血到加入了柠檬酸盐的Eppendorf管中5分钟。在该研究中，利用微量移液管而不是血液裂解测定法定量血液体积。
当与对照组出血率相比时，在移植后第7天和第14天观察到包囊化肝细胞的治疗效应。虽然一周出血量从第0天开始增加，在整个研究中观察到这一现象，这可能归因于与尾部的反复损伤有关并且因此随时间而更有效的出血而造成的血管形成过多。然而，图9中显示的结果证实因子VIII有活性达两周。两个包囊化组相比对照组都显示除减少的出血。
工业应用
本发明涉及用于治疗肝疾病和病症的药物组合物。该组合物包含选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状细胞和肝脏非实质细胞中的至少一种非肝细胞细胞类型，其能在植入受体宿主后分泌因子VIII和 其它肝分泌因子。本发明还提供了用于植入受体宿主的包含该组合物的装置。本发明还提供了用于肝细胞和用于所述非肝细胞细胞类型的长期体外培养方法。所述组合物可额外包含肝细胞。
本申请中参考或提及的全部专利、出版物、科学论文和其它文献及材料为本发明所属领域技术人员技术水平的指示，且每一所述参考文献和材料在此通过引用引入本说明书，达到如同其分别通过引用整体引入或在此整体阐述的相同的程度。申请人保留将来自任何所述专利、出版物、科学论文、网址、电子可获得信息和其它参考资料或文献的任何和全部材料和信息分别完全引入本说明书的权利。
本申请所述的具体方法和组合物为各种实施方式或优选实施方式的代表，并且仅为例证性的而不是意欲对本发明范围的限制。本领域技术人员考虑本说明书后想到得其它目的、方面、实施例和实施方式包括在由权利要求的范围所限定的本发明精神内。对本领域技术人员将显而易见的是在不背离本发明的范围和精神的条件下可对本发明进行各种替换和改进。适当例证性描述的本发明可在无任何元素或限制的条件下实施，这些元素或限制未在此作为必需的东西公开。因此，例如在本申请的每种情况中，在本发明的实施方式或实施例中，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一术语在说明书中可用其它两个术语中的任何一个替换。同样，术语“包含”、“包括”、“含有”等等应被开放性地，无限制地理解。本申请中例证性地描述的方法和程序可以不同的步骤顺序实施，并且其不一定局限于说明书中或权利要求中表明的步骤顺序。除非另外明确指出，说明书和权利要求中所用的单数形式“一”和“该”也包括复数形式。因此，例如“宿主细胞”的引用包括许多这种宿主细胞(例如，培养物或群体)等等。本专利在任何情况下都能被解释为限于说明书中公开的特定实施例或实施方式或方法而解释。本专利在任何情况下都不应解释为受专利商标局的任何审查员或任何其它的官员或雇员作出 的任何陈述的限制，除非这种陈述在申请人的书面答复中被具体地且无限制或保留地明确采用。
已采用的术语和表达用作说明书的术语而非限定，并且在这种术语和表达的使用中并不排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物，但认为在本发明所要求的范围内进行各种修饰是可能的。因此，将能够理解尽管本发明已通过优选的实施方式和可选的特征具体公开，通过本领域技术人员可对本申请所公开的内容进行修饰和变形，并且所述修饰和变形被认为落入权利要求所限定的本发明范围内。
本发明已被广泛地和一般地进行描述。落入一般性公开范围内的各种范围较窄的情况和下位概念也形成本发明的一部分。这包括具有排除来自该类的任何主题的前提条件或否定限定的本发明的一般性描述，而不考虑排除的内容是否在本申请中是否被具体地叙述。
其它的实施方式落入权利要求的范围内。此外，本发明的特征或方面采用马库什组进行描述，本领域技术人员将认识到本发明也因此根据马库什组的任何独立成员或成员的亚组得以描述。
Claims (58)
1.用于肝细胞的长期培养的方法，包括以下步骤：
在冷DMEM中交换肝细胞组织并于4℃孵育达24小时；
在利多卡因存在的条件下，用0.2mg/ml浓度的释放酶
消化两次；
分离消化的肝细胞；和
在包含同种异基因血清的培养基中进行培养，
其中所述肝细胞能在培养过程中长期分泌一或多种肝分泌因子。
2.权利要求1的方法，其中所述肝细胞为新生儿肝细胞。
3.用于长期培养能分泌一或多种肝分泌因子的至少一种非肝细胞细胞类型的方法，所述方法包括以下步骤：
在冷DMEM中交换非肝细胞组织并于4℃孵育达24小时；
在利多卡因存在的条件下，用0.2mg/ml浓度的释放酶
消化两次，每次达10分钟；
分离消化的非肝细胞；和
在包含同种异基因血清的培养基中进行培养，
其中所述至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞。
4.权利要求3的方法，进一步包括将非肝细胞与肝细胞共培养的步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述非肝细胞和/或肝细胞为新生儿细胞。
6.前述权利要求中的任一项的方法，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞为猪或人的细胞。
7.权利要求1或3的方法，其中所述一或多种肝分泌因子选自白蛋白、凝血因子、生长和/或分化因子及其类似物、胰岛素样生长因子及其类似物、肝细胞生长因子及其类似物、成纤维细胞生长因子及其类似物、或激素。
8.权利要求7的方法，其中所述凝血因子是因子VIII或因子IX。
9.权利要求7的方法，其中所述生长和/或分化因子是生长激素。
10.权利要求7的方法，其中所述激素是皮质类固醇。
11.从至少一种非肝细胞细胞类型体外产生一或多种肝分泌因子的方法，所述非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞，所述方法包括以下步骤：
分离所述至少一种非肝细胞细胞类型；
根据权利要求3的方法培养所述至少一种非肝细胞细胞类型；
收获所述培养基；和
任选地分离或纯化所述肝分泌因子。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型与肝细胞共培养。
13.权利要求11或12的方法，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞分离自新生儿组织。
14.权利要求11或12的方法，其中所述至少一种非肝细胞和/或肝细胞为猪或人的细胞。
15.一种可植入组合物，其包含根据权利要求3的方法培养的至少一种非肝细胞细胞类型，所述至少一种非肝细胞细胞类型在植入受体后能分泌一或多种肝分泌因子或给所述受体提供一或多种肝代谢功能和/或生理功能，其中所述一或多种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞，且其中所述细胞通过如下方式被置于可植入组合物中：将所述细胞包囊化于生物相容性材料中；将所述细胞限制于合适的装置中；将所述细胞包囊化于基质制剂中；和/或将所述细胞限制于血浆凝血酶凝块中。
16.权利要求15的组合物，其进一步包含肝细胞。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞为新生儿细胞。
18.权利要求15或16的组合物，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞为猪或人的细胞。
19.权利要求16或17的组合物在制备用于体内产生一或多种肝分泌因子的植入物中的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述植入物在植入后长期提供肝分泌因子或提供肝代谢功能或生理功能。
21.一种可植入组合物，其包含根据权利要求3的方法培养的至少一种非肝细胞细胞类型的一或多种聚集体，所述至少一种非肝细胞细胞类型在植入受体后能产生和/或分泌一或多种肝分泌因子，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞，且其中所述细胞通过如下方式被置于可植入组合物中：将所述细胞包囊化于生物相容性材料中；将所述细胞限制于合适的装置中；将所述细胞包囊化于基质制剂中；和/或将所述细胞限制于血浆凝血酶凝块中。
22.权利要求15或21的可植入组合物，其中所述生物相容性材料是藻酸盐。
23.权利要求15或21的可植入组合物，其中所述合适的装置是血管化管或TheracyteTM装置。
24.权利要求15或21的可植入组合物，其中所述基质制剂选自明胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物。
25.权利要求15或21的可植入组合物，其中所述血浆凝血酶凝块是同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
26.权利要求21的可植入组合物，其中所述聚集体进一步包含肝细胞。
27.权利要求21或26的可植入组合物，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型和/或肝细胞为猪或人的细胞。
28.权利要求12的方法，其中所述肝细胞分离自可商购的细胞培养物中的永生化细胞。
29.权利要求16或26的组合物，其中所述肝细胞分离自可商购的细胞培养物中的永生化细胞。
30.权利要求15或21的组合物，其中所述至少一种非肝细胞细胞类型包含胆囊内皮细胞和/或上皮细胞。
31.权利要求30的组合物，包含胆囊上皮细胞。
32.权利要求31的组合物，进一步包含肝细胞，其中胆囊上皮细胞:肝细胞的比率在0.5:2与2:0.5之间。
33.权利要求32的组合物，其中胆囊上皮细胞:肝细胞的比率为1:1。
34.权利要求15或21的组合物，其中所述一或多种肝分泌因子为凝血因子。
35.权利要求34的组合物，其中所述凝血因子为因子VIII和/或因子IX。
36.权利要求35的组合物，其中当所述凝血因子为因子VIII时，共分泌冯·维勒布兰德因子。
37.权利要求15或21的组合物，其中所述一或多种肝分泌因子为生长和/或分化因子。
38.权利要求37的组合物，其中所述生长和/或分化因子选自生长激素及其类似物、胰岛素样生长因子及其类似物、肝细胞生长因子及其类似物、或成纤维细胞生长因子及其类似物。
39.权利要求15或21的组合物，其中所述一或多种肝分泌因子是酶。
40.权利要求15或21的组合物，其中所述非肝细胞细胞类型源自和受体相同的物种。
41.至少一种能分泌肝分泌因子的非肝细胞细胞类型在制备用于治疗患有或易患与肝分泌因子缺陷或缺乏有关的疾病或病症或患有或易患与肝代谢功能和/或生理功能缺陷有关的疾病或病症的患者的权利要求15或21的可植入组合物中的用途，所述至少一种能分泌肝分泌因子的非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞。
42.权利要求41的用途，其中所述疾病或病症为慢性肝功能不全、肝功能衰竭、肝疾病或酒精性肝病。
43.至少一种非肝细胞细胞类型在制备用于治疗患有或易患凝血疾病或病症的患者的权利要求15或21的可植入组合物中的用途，所述至少一种非肝细胞细胞类型选自胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、肝血管上皮细胞和肝血管内皮细胞。
44.权利要求43的用途，其中所述疾病或病症是血友病。
45.权利要求44的用途，其中所述血友病是血友病A。
46.权利要求41-45中的任一项的用途，所述可植入组合物进一步包含肝细胞。
47.权利要求46的用途，其中所述可植入组合物包含比率为0.5:2至2:0.5的胆囊上皮细胞和肝细胞。
48.权利要求47的用途，其中所述的胆囊上皮细胞和肝细胞的比率为1:1。
49.权利要求41-45中的任一项的用途，其中所述可植入组合物包含包囊化于合适的生物相容性材料中的细胞，
限制于合适的装置中的细胞，
包囊化于基质制剂中的细胞，和/或
限制于血浆凝血酶凝块中的细胞。
50.用于植入患有或易患与肝分泌因子缺陷或缺乏有关的疾病的受体的装置，该装置包括一或多种权利要求15-18和21-27和29-40中的任一项的可植入组合物。
51.权利要求50的装置，其包含含有合适的生物相容性材料的胶囊；
血管化管或室；包含明胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物的基质制剂；或
血浆凝血酶凝块。
52.权利要求49的用途，其中所述生物相容性材料为藻酸盐。
53.权利要求51的装置，其中所述生物相容性材料为藻酸盐。
54.权利要求49的用途，其中所述装置为血管化管或TheracyteTM装置。
55.权利要求49的用途，其中所述基质制剂选自明胶、胶原和/或天然碳水化合物聚合物。
56.权利要求49的用途，其中所述血浆凝块是同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
57.权利要求51的装置，其中所述血浆凝块是同种异基因凝血酶产生的同种异基因血浆凝块。
58.权利要求51的装置，其中所述血管化管或室是从TheraCyte,Inc.,CA获得的TheracyteTM装置。
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