KR101358973B1

KR101358973B1 - 트리할로오스를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법

Info

Publication number: KR101358973B1
Application number: KR1020100117392A
Authority: KR
Inventors: 류범용; 이용안; 어중혁
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2014-02-11
Also published as: KR20120055934A

Abstract

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 동결보존액에 트리할로오스 (trehalose)를 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 정원줄기세포 동결보존 기법을 따르면, 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진을 확인할 수 있기 때문에 효율적인 동결보존을 통해 우수 종축의 형질 보존 연구 분야의 발전뿐 아니라 인간 불임치료와 같은 적극적인 활용법 개발에 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

Description

트리할로오스를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법{Method of cryopreservation of spermatogonial stem cells using trehalose}

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 동결보존액에 트리할로오스 (trehalose)를 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

줄기세포 (stem cells)는 미분화 상태로 오랜 기간 동안 자가분열을 통하여 증식이 가능하며, 적절한 조건하에서 특수한 기능을 수행하는 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 줄기세포는 분리시기에 따라 배아줄기세포 (embryonic stem cells)와 성체줄기세포 (adult stem cells)로 구분된다. 전분화능을 지닌 배아줄기세포와 달리 성체줄기세포는 조직 및 기관에 존재하는 미분화 세포로서 조직 및 기관에서 자가재생 (self-renewal)과 분화 (differentiation)를 통해 적절한 세포를 공급하여 기능적으로 항상성을 유지 할 수 있게 한다.

정자형성과정 (spermatogenesis)을 통해 남성 측 유전정보를 다음 세대에 전달하는 매개체인 정자를 생산하는 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells; SSCs)는 정소 (testis)에 존재하는 성체줄기세포다. 정원줄기세포는 정자형성과정의 토대가 되는 생식선 줄기세포이다. 정자형성과정은 남성의 정소 (testis)에 존재하는 정원줄기세포의 분열과 분화에 의해서 이루지는 과정으로서 남성 생애 전반에 걸쳐 유지된다.

1994년 Brinster (Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, 22;91(24):11303-7) 연구팀은 생쥐 정소 세포의 이식기법을 개발하여 생쥐의 정소에 정원줄기세포가 존재한다는 실증을 보임과 동시에 정원줄기세포의 기능적 특성을 직접적으로 연구할 수 있는 전기를 마련하였다. 이후 정소 세포 및 정원줄기세포 이식기법은 정원줄기세포의 생물학적인 특성과 활용법 개발에 있어서 필수적이고 가장 핵심적인 기술로 사용되고 있다.

일반적으로 줄기세포를 포함한 동물세포를 장기간 보존하는 방법은 체외배양법과 동결보존법이 있다. 설치류의 경우에는 최근에 정원줄기세포의 체외배양법이 개발되어 장기간의 배양증식이 가능하게 되었다. 그러나 현재까지 설치류를 제외한 다른 포유류에 있어서는 정원줄기세포의 효율적인 체외배양기법이 개발되지 못한 상황이다.

1996년 Brinster (Nature medicine. 1996, 2, 693-696) 연구팀은 동결보존 후 융해된 정원줄기세포를 수여동물의 정소에 이식한 후 관찰한 결과 수여동물의 정소에서 공여(donor) 정원줄기세포 유래의 정자세포가 생산되는 것을 확인하였다.

이 결과는 정원줄기세포를 효율적으로 오랜 기간 보존할 수 있는 방법의 개발을 위한 전기를 마련해 주었을 뿐 아니라 정원줄기세포를 이용한 다양한 연구적용의 가능성을 높여주었다.

이 후 2003년 Shinohara (Human reproduction. 2003, 18; 12, 2660-2667) 연구팀은 동결보존 후 융해된 정원줄기세포의 이식을 통해 불임 생쥐로부터 새끼를 생산하였다. 이는 정원줄기세포가 정자와 같이 동결 보존되고 필요 시 후대 생산을 위하여 활용될 수 있음을 검증한 결과이었다.

그러나 위에 기술된 연구들에서 사용한 정원줄기세포의 동결보존법은 기존의 체세포를 대상으로 한 동결보존방법 이었으므로 쉽게 활용될 순 있으나 세포 생존율이 비교적 떨어지고, 정소의 모든 세포군을 동결한 기법이므로 순수한 정원줄기세포의 동결 및 해동 후의 정확한 생존율을 알 수 없다. 따라서 정원줄기세포의 장기간 보존을 위해서는 순수한 정원줄기세포에 최적화된 효율적인 동결보존기술 개발이 절실히 필요하다.

이에 본 발명자는 정원세포의 체외배양을 통해 순수한 정원 세포군을 회수한 후 효율적으로 정원줄기세포를 동결보존 할 수 있는 방법을 개발하기 위한 연구를 계속 한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로 동결보존액에 트리할로오스 (trehalose)를 첨가한 동결보존법을 이용하여 정원줄기세포의 보존성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

동결보존액을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 있어서, 상기 동결보존액은 트리할로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.

상기 동결보존액은 우태아 혈청 5~20%, DMSO 5~20%가 포함된 MEM-α인 것이 바람직하다.

상기 트리할로오스를 0.05 내지 0.2M 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 정원줄기세포 동결보존 기법을 따르면, 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진을 확인할 수 있기 때문에 효율적인 동결보존을 통해 우수종축의 형질 보존 연구 분야의 발전뿐 아니라 인간 불임치료와 같은 적극적인 활용법 개발에 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의한 1개월간 체외 배양된 생쥐 정원줄기세포를 효소처리를 통하여 단일 세포군을 회수하고 trehalose를 이용한 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 및 회수율을 나타낸 도면이다.
- 표내 제시 된 수치 : 3회 이상 독립 실시된 실험 결과의 평균 수치 및 표준오차 수치
- Final concentration (M) of trehalose : 정원줄기세포 동결 시 동결보존액에 포함 된 trehalose의 농도
- Survival rate (%) after freezing & thawing : 정원줄기세포의 동결 및 해동 후 생존율
- Recovery rate (%) after freezing & thawing : 동결 및 해동 된 정원줄기세포의 살아있는 정원줄기세포의 회수율
- * : Trehalose가 포함되지 않은 group과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였음을 나타냄 (p < 0.05)
도 2는 동결 및 해동 후 각각의 처리별로 증식 수를 나타낸 도면이다.
- Trehalose를 처리 하지 않은 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 0.9 x 10⁶개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 54.4%에 해당하는 숫자임.
- 0.05M의 Trehalose를 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.32 x 106개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 79.0%에 해당하는 숫자임.
- 0.1M의 Trehalose를 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.09 x 106개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 65.4%에 해당하는 숫자임.
- 0.2M의 Trehalose를 처리 한 정원줄기세포는 동결 및 해동 후 1주일 배양 시 1.02 x 106개까지 자랐으며 이는 신선한 세포 0.5 x 10⁶개의 세포를 1주일 배양했을 경우에 대해 61.4%에 해당하는 숫자임. 0.05M의 trehalose 처리에서 통계학적으로 유의한 차이가 나타남.
도 3은 본 발명에서 실시되었던 대표적인 기법인 0.05M trehalose가 포함 된 동결보존액을 이용하여 동결 후 체외배양중인 정원줄기세포의 사진이다.
-Fresh : 동결 및 해동 과정을 거치지 않은 정원줄기세포의 체외배양 모습 (화살표는 정원줄기세포의 clump를 나타냄, bar: 100 um)
- 0.05M: 0.05M의 trehalose를 처리를 통해 동결된 정원줄기세포의 체외배양 모습 (화살표는 정원줄기세포 clump를 나타냄, bar: 100 um)

본 발명의 일 목적은 정원줄기세포의 장기간 보존 효율성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 동결보존액을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 있어서, 상기 동결보존액은 트리할로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는,

(ⅰ) 포유류의 정소를 효소 처리함으로써 단일 세포군을 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 단일 세포군으로부터 정원줄기세포를 회수하는 단계;

(ⅲ) 상기 정원줄기세포를 체외배양 후 회수하는 단계; 및

(ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계의 회수된 정원줄기세포를 트리할로오스가 첨가된 동결보존액을 사용하여 동결보존하는 단계;

를 포함한 정원줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.

상기 포유류는 인간을 포함하며, 본 발명에 있어서 생쥐인 것이 바람직하다. 정소는 수컷의 생식세포인 정자를 만드는 기관으로 포유동물의 경우에는 고환이라고도 한다.

상기 정소를 효소 처리함으로써 단일 세포군을 분리할 수 있는데, 상기 효소란 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin), Dnase I 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하다.

상기 분리된 단일세포군은 다음 단계를 수행하기 전에 10% 우태아 혈청과 복합항생제가 첨가된 DMEM 배양액에 보관되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (ⅱ)단계의 정원줄기세포의 회수는 MACS (magnetic activated cell sorting) 기법을 이용하여 회수하는 것이 바람직하다. 단일 세포군을 원심분리한 정소세포를 MACS 기법을 이용하면 고순도의 정원줄기세포의 회수가 가능하다.

본 발명의 용어, “정원줄기세포”란 정조줄기세포 (SSCs, spermatogonial stem cells)라고도 불리며, 정원줄기세포는 정소에 존재하면서 정자형성 (spermatogenesis)에 중요한 기능을 한다. 그 명칭에 있어 포유류 암컷에서 이들의 존재 가능성이 제기되어 이와 구분하기 위해 `남성생식선줄기세포` (雄性, 웅성, male germline stem cells)라고도 불린다. 이 세포는 성체줄기세포 특유의 자가재생능력과 정자세포로의 분화능력을 동시에 가지고 있으나 고환 내에 아주 극소수가 존재한다.

상기 체외배양은 성장인자가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층이 피복된 체외 배양기에서 배양하는 것이 바람직하다. 체외배양은 상기 고순도 정원줄기세포의 대량증식을 위함이다.

상기 성장인자는 GDNF (Glial cell- line derived neurotrophic factor, 신경영양인자), GFRα1 (GDNF family co-receptor α1), bFGF (Basic fibroblast growth factor, 섬유아세포 성장인자)인 것이 바람직하다.

상기 배양은 체외배양기에서 1~2개월간 배양하는 것이 바람직하고, 배양액은 2~4일 간격으로 교체해 주고, 7~9일 간격으로 계대 배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기 체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 트립신 (trypsin) 처리를 통해서 동결보존을 위한 단일 세포로 회수될 수 있다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEMα 배양액에 넣어 원심분리하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일실시예에서의 동결보존액은 우태아 혈청 5~20%, DMSO 5~20%가 포함된 MEM-α인 것이 바람직하다. 상기 동결보존액에 0.05 내지 0.2M의 트리할로오스를 첨가하는 것이 바람직하다. 특히 우태아 혈청 10%, DMSO 10%, 0.05M의 트리할로오스를 사용하여 동결보존 시 남성생식선 줄기세포인 정원줄기세포의 보존성을 효과적으로 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 농도의 트리할로오스를 첨가하여 동결보존하고 7일 이후 해동하여 생존율 및 원심분리 후 회수율과 증식력의 측정이 가능하고, 트리할로오스를 사용하여 장기간 동결보존을 할 수 있다.

본 발명의 “트리할로오스 (trehalose; (D-glucopyranosyl-(1↔1)-D-glucopyranoside, 참조: Manaught, A. D., (1997) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 52, 43-177)"는 하기 구조식 1에서 보는 바와 같이 두 개의 포도당이 각각의 1 번 탄소 위치가 서로 결합된 세 종류의 이성질체를 갖는 비환원성 이당류이다. 대부분 자연계에 많이 존재하는 이성질체는 알파,알파-트레할로스로 많은 종류의 박테리아와 곰팡이, 효모, 곤충들, 동물들 그리고 식물들에 있어 저장 탄수화물의 한 종류이며, 곤충에게 있어 비행을 위한 동력원으로 작용하며, 효모들과 대장균 등에 있어 외부의 물리적 영향에 대한 저항물질로서 작용한다 (참조: Elbein, A. D. (1974) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 30, 227-256; Yoshida, M. 등 (1995) Oyo Toshitsu Kagaku, 42, 19-25; Van Laere, A. (1989) FEMS Microbiol. Rev., 63, 201-210; Kassen, I. 등 (1994) Gene, 145, 9-15).

트리할로오스는 동일 농도의 설탕에 비해 절반 정도에 해당하는 당미를 가진 감미료로서 뿐만 아니라 기초 과학, 의학, 농학 그리고 생전자학 (bio-electronics) 등의 분야에서 생분자 (biomolecules)의 안정화 효과에 대한 다양한 응용성을 가지고 있다 (참조: Colaco, C. 등 (1992) Bio/Technology., 10, 1007-1011). 트리할로오스는 건조 또는 냉동 식품에 있어 안정제로 그리고 진단 시약들과 약제약학상 첨가제로 의약품에 사용될 수 있으며 효소를 포함한 생리활성 단백질의 열응집과 열변성을 방지하는 안정제로서 뿐만 아니라 사람들의 화장품에 있어 보습제로서 다양한 분야에 매우 유용하다.

[구조식 1]

상기 구조식 1에서 a)는 알파, 알파-트리할로오스, b)는 알파, 베타-트리할로오스, c)는 베타, 베타-트리할로오스 이다.

상기 동결보존 방법은 본 발명의 일실시예에서 0.5 x 10⁶ cells/ml 농도의 세포를 각 분자량과 여러 가지 농도의 트리할로오스가 첨가된 동결보존액에 넣고 한 개의 동결용기에 1ml씩 보존한다. 동결 용기는 isopropanol이 담긴 cryocontainer에 넣어 -80℃까지 약 -1℃/min의 속도로 온도를 낮춰 (이후 완만동결법이라 칭함) 하루 동안 보관한다. 이 후 동결 용기는 다시 -196℃ 액체질소로 옮겨 6일간 보관할 수 있다.

이처럼 본 발명의 일 목적은 정소세포군으로부터 고순도 정원줄기세포 회수기법과 체외배양기법을 통해 순수한 정원줄기세포군을 확보하여 정원줄기세포에 최적화 된 동결보존법을 연구함으로써 생식선줄기세포의 장기간 보존법 개발 연구에 적용할 수 있는 방법을 제공하려는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 성체 가축 종 정원줄기세포의 회수 및 순수도 증진 기법에 적용하여 유전능력은 뛰어나지만 질병이나 노화 등으로 정액채취가 불가능한 우수 종축의 정소로부터 순수한 정원줄기세포를 채취하고 효율적으로 보존하여 우수 종축의 생식세포 보존 효율성을 증진 시킬 수 있는 방법을 제공하려는데 있다. 또한 정원줄기세포의 이식기법에 적용하여 젊은 recipient 정소에 이식한 후 recipient 정소로부터 이식된 종모돈의 정원줄기세포에서 유래되는 정자를 생산함에 따른 우수종 모돈의 활용도를 증진 시킬 수 있는 방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 정원줄기세포의 장기간 보존방법으로 확대하여 암 치료나 질병 및 노화 등으로 정자가 결핍되어 수정이 불가능한 환자의 정원줄기세포를 효율적으로 보관하여 남성불임치료 연구에 적용시키고자 하는데 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1. 실험 방법>

본 실험은 생식선줄기세포의 효율적인 동결보존법을 개발하는데 있어서 관리와 정소세포군의 회수가 용이한 생쥐를 대상 동물로 선정하였고, 형광발현 단백질 (green fluorescent protein)유전자를 지닌 C57BL/6-TgEGFP과 정원줄기세포의 체외배양 효율이 가장 높은 종으로 알려진 DBA/2 종을 교배하여 생산된 형광발현단백질 생쥐 (C57GFP X DBA)의 정원줄기세포를 기술개발의 대상으로 설정하였다.

1. 정원줄기세포를 포함하는 정소세포의 회수

생쥐 정소로부터 하기 과정을 통해 정소세포군을 회수하였다.

가. 생쥐 정소의 복합 효소처리를 통한 단일 세포군 회수

생후 7~8 일령의 생쥐로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출한 후 정소의 백막을 제거하고 정소 조직을 trypsin과 Dnase I 등의 효소들을 복합처리 하는 방법으로 정소로부터 정원줄기세포가 포함된 단일 세포들을 분리하였다. 분리된 단일 세포들은 다음 단계의 처리 전까지 10% 우태아 혈청과 복합항생제가 첨가된 DMEM 배양액 (이후 DMEM으로 칭함)에 넣어 보관하였다.

나. Density gradient 를 이용한 죽은 세포 및 세포 외 잔해 제거

1) 등장 Percoll (iso-osmotic Percoll) 용액 준비

30% Percoll 용액 (총 100ml 당 Percoll 원액 30ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수증류수 58.5ml을 혼합함)을 제조하였다.

2) Percoll을 이용한 정원줄기세포 분리

상기 1)에서 제조된 등장 Percoll 용액을 2ml 씩 15ml conical tube에 넣어 Percoll column을 준비하였다. 상기 1에서 분리된 정소 세포를 DMEM으로 세포수가 10x10⁶/ml 되게 조정한 후 2ml의 세포부유액을 Percoll column 상부에 주입하였다. 이후 tube를 600 G에서 10분간 원심분리 하였고 원심분리 후 tube 최하위에 위치한 세포들을 회수하였다. 회수된 단일 세포들은 혈청이 첨가된 식염수 (총 100ml 당 DPBS 99ml, 우태아 혈청 1ml, pyruvate 11mg, glucose 100mg, HEPES 1ml, 복합항생제 0.5ml을 혼합함)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

2. 정소세포로부터 고순도 정원줄기세포의 회수

상기 1에서 회수된 단일 세포군은 600 G에서 7분간 원심분리 하였고 원심분리 후 정소 세포는 Magnetic activated cell sorting (MACS) 기법을 이용해 고순도의 정원줄기세포를 회수하였다.

3. 정원줄기세포의 체외배양 및 대량 회수

상기 2에서 회수된 고순도 정원줄기세포는 대량증식을 위해 체외배양 하였고 동결보존을 위해 회수되었다.

가. 정원줄기세포의 체외배양

상기 2에서 회수된 고순도 정원줄기세포는 성장인자 (10ng/ml GDNF, 75ng/ml GFRα1, 1ng/ml bFGF)가 포함된 무혈청 배지와 지지세포층 피복된 12well plate에 한 well당 0.1 x 10⁶개씩 담겨 체외배양기 (CO2 5%, 37℃)에서 1개월간 배양 하였다. 이때 배양액은 2~3일 간격으로 교체해 주었고, 7일 간격으로 계대 배양해 주었다.

나. 동결보존을 위한 정원줄기세포의 회수

체외배양을 통해 대량 증식된 정원줄기세포는 trypsin 처리를 통해 단일 세포로 회수되었다. 회수된 단일 정원줄기세포는 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEMα 배양액 (이후 MEMα라 칭함)에 넣어 600G에서 7분간 원심분리 하였다.

4. 당물질을 이용한 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 생존율 증진

체외 증식된 정원줄기세포를 대상으로 동결보존시 당물질 중 하나인 trehalose 처리에 따른 세포 생존율의 증진 여부를 확인하였다.

가. Trehalose 를 이용한 정원줄기세포의 동결보존

정원줄기세포의 동결보존 과정에서 trehalose의 영향을 확인하기 위하여 trehalose의 농도에 따른 동결보존 능력을 측정하였다. 우태아 혈청 10%, DMSO 10%가 포함 된 MEM-α (이후 동결보존액이라 칭함)에 trehalose를 0.05M, 0.1M, 0.2M로 첨가하여 동결보존하고 7일 후 해동하여 생존율 및 원심분리 후 회수율과 증식력을 측정하였다.

동결보존 방법은 0.5 x 10⁶ cells/ml 농도의 세포를 각 농도의 trehalose가 첨가된 동결보존액에 넣어 한 개의 동결용기에 1ml씩 보존하였다. 동결 용기는 isopropanol이 담긴 cryocontainer에 넣어 -80℃까지 약 -1℃/min의 속도로 온도를 낮춰 (이후 완만 동결법이라 칭함) 하루 동안 보관하였다. 이 후 동결 용기는 다시 -196℃ 액체 질소로 옮겨 6일간 보관하였다.

나. 동결 보존된 정원줄기세포의 해동 및 회수

동결상태의 정원줄기세포를 37℃ 항온 수조에서 3분간 해동 후 tryphan blue 용액 염색 방법을 통해 각 trehalose의 농도별로 정원줄기세포의 생존율을 확인 (이후 동결 및 해동 직후 생존율 이라 칭함) 하였다. 이 후, 5배 volume의 새 배양액에 옮겨 담아 600G로 2회 원심분리 후 정원줄기세포의 생존율 측정을 통해 살아있는 세포 수를 확인하여 얼린 세포 수 (0.5 x 10⁶개)당 살아있는 세포 수의 비율을 측정 (이후 원심분리 후 회수율 이라 칭함) 하였다.

다. 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포의 체외배양

상기에서 회수된 동결보존 및 해동 후 정원줄기세포는 성장인자가 포함된 무혈청 배양액에 넣어 지지세포들이 피복된 배양 접시에 담아 체외배양 했다. 이때 한 개의 동결용기에서 동결된 정원줄기세포는 한 개의 접시에 모두 담아 trehalose 농도별로 각각 1주일간 배양 후 증식된 세포수를 확인하였고, 이때 동결되지 않은 (이후 신선한 세포라 칭함) 0.5 x 10⁶개의 정원줄기세포의 1주일간 배양 후 증식된 세포 수와 비교하여 증식비율을 측정 (이후 동결 및 해동 후 증식율이라 칭함) 하였다.

< 실시예 2. 실험 결과- 트리할로오스 농도에 따른 효능>

본 발명과정에서 당 물질 처리 농도에 따른 정원줄기세포의 동결 후 생존율 변화는 동결 및 해동 직후와 원심분리 후 tryphan blue 염색법을 통하여 분석하였다.

또한 원심분리 후의 정원줄기세포를 각 각 체외배양 하여 당 물질 처리 농도에 따른 정원줄기세포의 동결 및 해동 후 증식 상태를 각 각 비교하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 이상으로 실시하였다.

1. 정원줄기세포의 동결보존 및 해동 후 생존율 측정

고순도의 정원줄기세포를 대상으로 동결보존을 실시했을 때 trehalose가 포함되지 않은 동결보존액을 이용했을 경우 동결 및 해동 직후의 생존율은 76.1± 8.3% (평균± 표준오차)이었고, 0.05M, 0.1M, 0.2M 농도의 trehalose가 포함된 동결보존액을 이용했을 경우 동결 및 해동 직후의 생존율은 각 각 89.7±4.9%, 82.0±9.4%, 75.8±3.5%으로 세 농도 중 0.05M과 0.1M의 trehalose 처리에서 통계학적인 유의차를 나타내는 결과를 보였으며 가장 높은 생존율을 보인 처리는 0.05M의 trehalose였다.

2. 동결 및 해동된 정원줄기세포의 회수율 측정

Trehalose가 포함되지 않은 동결보존액을 통해 동결 후 해동된 정원줄기세포의 회수율은 trehalose가 첨가되지 않은 경우와 0.05M, 0.1M, 0.2M의 trehalose가 처리된 경우가 각 각 70.3±11.0%, 94.0±7.5%, 82.2±16.6%, 74.7±13.5%으로 0.05M과 0.1M의 처리에서 통계적인 유의차를 나타내는 결과를 보였고 0.05M 처리에서 가장 높은 결과를 보였다.

3. 동결 및 해동된 정원줄기세포의 증식율 측정

동결 후 해동된 정원줄기세포 1주일간 체외배양 후 증식율을 측정한 결과 trehalose를 동결보호제에 첨가하지 않은 경우 증식율은 54.4±6.2이었다. 0.05M, 0.1M, 0.2M 농도의 trehalose 처리의 경우 증식율은 각각 79.0±1.8%, 65.4±1.2%, 61.4±0.2% 으로 0.05M 농도 처리구서 가장 높은 증식율을 보였다. 이때 통계학적 유의차는 0.05M 농도 처리에만 나타났다.

상기 결과는 본 발명에서 개발된 0.05M 농도의 trehalose가 사용된 동결보호 기법이 남성생식선 줄기세포인 정원줄기세포의 보존성을 효과적으로 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

동결보존액을 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법에 있어서, 상기 동결보존액은 0.05M 내지 0.2M의 트리할로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존방법.
제 1항에 있어서, 상기 동결보존액은 우태아 혈청 5~20 % (v/v), DMSO 5~20 % (v/v)가 포함된 MEM-α인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 동결보존 방법.
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