WO2007125916A1 - 移植用臓器の調製方法 - Google Patents

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WO2007125916A1
WO2007125916A1 PCT/JP2007/058845 JP2007058845W WO2007125916A1 WO 2007125916 A1 WO2007125916 A1 WO 2007125916A1 JP 2007058845 W JP2007058845 W JP 2007058845W WO 2007125916 A1 WO2007125916 A1 WO 2007125916A1
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mesenchymal stem
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transplantation
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Akira Fukui
Takashi Yokoo
Masataka Okabe
Tatsuo Hosoya
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Stemcell Institute Inc.
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    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention provides a method for preparing a mammal transplant organ, particularly a kidney.
  • Organ regeneration has recently attracted much attention as a new treatment strategy.
  • the possibility of regenerative medicine is the discovery of various tissue stem cells and the use of these neurons (Non-patent document 1), ⁇ cells (Non-patent document 2), muscle cells (Non-patent document 3), and blood vessels (non-patent document).
  • the therapeutic effects of regeneration such as 4) have been reported and are gradually being recognized.
  • examples of success using such strategies are limited to cells and simple tissues.
  • anatomically complex organs such as kidneys and lungs have several different cell forces, and have advanced three-dimensional structures and cell information transmission systems. It may be difficult to respond.
  • Non-Patent Document 1 J. Neurosci. Res. 69,925-933 (2002)
  • Non-Patent Document 2 Nat. Med. 6, 278-282 (2000)
  • Non-Patent Document 3 Nature 410,701-705 (2001)
  • Non-Patent Document 4 Nat. Med. 5, 434-438 (1999)
  • Non-Patent Document 5 Transplantation 77, S41-S43 (2004)
  • Non-Patent Document 6 Science 276, 71-74 (1997)
  • Non-Patent Document 7 birth Defects Res. 69, 250-256 (2003)
  • Non-Patent Document 9 Exp. Nephrol. 10, 102-113 (2002)
  • Non-Patent Document 10 Am. J. Kidney Dis. 31, 383-397 (1998)
  • Non-Patent Document 11 J. Neurosci. Res. 60, 511-519 (2000)
  • Non-Patent Document 12 Blood 98, 57-64 (2001)
  • Non-Patent Document 13 J. Am. Soc. Nephrol.l 1, 2330-2337 (2001)
  • Non-Patent Document 14 Methods 24, 35-42 (2001)
  • Non-Patent Document 15 J. Clin. Invest. 105, 868-873 (2000)
  • Non-Patent Document 16 J. Neurol. Sci. 65, 169-177 (1984)
  • Non-Patent Document 17 Kidney Int. 64, 102-109 (2003)
  • Non-Patent Document 18 Cytometry 12, 291-301 (1991)
  • Non-Patent Document 19 Dev. Growth Differ. 37, 123-132 (1995)
  • Non-Patent Document 20 Am. J. Physiol. 279, F65-F76 (2000)
  • Non-Patent Document 21 Eur. J. Physiol. 445, 321-330 (2002)
  • Non-Patent Document 22 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7515-7520 (2000)
  • Non-Patent Document 23 Nature 418, 41-49 (2002)
  • Non-Patent Document 23 Am. J. Physiol. 280, R1865-1869 (2001)
  • Non-Patent Document 24 Methods 24, 35-42 (2001)
  • An object of the present invention is to provide means for achieving the creation of complex organs such as kidneys using mesenchymal stem cells derived from mammals.
  • kidney represents a complex organ, it consists of several different cell types, has a high degree of three-dimensional structure, and its developmental process in the embryo has been well studied.
  • Development of the kidney begins when the metanephric mesenchyme guides the nearby Wolff tube at the tail of the nephrogenic cord (Non-patent Document 8) to generate a ureteric bud (Non-patent Document 9). Growth proceeds as a result of reciprocal epithelial-mesenchymal signaling between the ureteric bud and the metanephric mesenchyme (10).
  • hMSCs Human mesenchymal stem cells
  • transplanting mesenchymal stem cells into the metanephric mesenchyme allows differentiation into mesangial cells, tubular epithelial cells, and glomerular epithelial cells. It is possible to disseminate into ureteral bud collecting and ureters by transplanting into ureters.
  • the present invention provides:
  • Transplanting a mesenchymal stem cell derived from a mammal into a fetus in a pregnant mammal host or the host power of a pregnant mammal and separating the mesenchymal stem cell into a separated fetus A method for preparing an organ for mammalian transplantation, characterized in that the mesenchymal stem cell transplantation site into the fetus is the intermediate mesoderm, and the time of transplantation is still in the immune tolerance stage of the host immune system. To prepare an organ for transplantation.
  • Transplantation of mammalian mesenchymal stem cells into the fetus is performed by separating the fetus from uterine force, transplanting the cell into the fetus, and then further developing in vitro using whole embryo culture 1 The method according to any one of -7.
  • mammalian mesenchymal stem cell is a human mesenchymal stem cell. It consists of.
  • the present invention has provided a new means for autotransplantation of autologous organs, particularly kidneys.
  • the mesenchymal stem cells are collected and transplanted to the desired site of the fetus in the pregnant mammal host or the fetus of the pregnant mammal, and the fetus is separated, and the kidney is created, It was then possible to return the developed kidney to self.
  • FIG. 1-2 is a diagram showing extrauterine division of the renal primordia using relay culture.
  • hematoxylin Zeosin staining (b) and whole mount in situ hybridization (c) for C-ret are shown.
  • FIG. 2 is a diagram showing the proportion of donor-derived cells in the culture-derived metanephros and evaluation of their DNA ploidy.
  • M is a peak with a large amount of information.
  • FIG. 3-1 is a diagram showing the distribution of transplanted hMSCs into kidney constituent cells. X-gal assembly of the metanephros generated after relay culture was followed for transplanted hMSCs.
  • FIG. 3-2 is a diagram showing the distribution of transplanted hMSCs into kidney constituent cells.
  • B The serial sections were searched with an optical microscope.
  • C Tissue sections were subjected to two-color immunofluorescence staining of ⁇ -gal (left) and WT-1 (right).
  • FIG. 3-3 is a diagram showing the distribution of transplanted hMSCs into kidney constituent cells.
  • the metanephros produced after relay culture were digested and single cells were FACS-galactosidase assayed.
  • FIG. 4 is a diagram showing infusion and culture of hMSCs in the separated metanephros.
  • A X-gal assembly of the metanephros obtained after 6 days of organ culture.
  • B shows RNA extracted and subjected to RT-PCR.
  • FIG. 5-1 is a diagram showing therapeutic kidney reconstitution in a-gal A-deficient Fabry mice. As described above, the bioactivity of the resulting metanephric a-gal A enzyme was evaluated using a fluorometer.
  • Fig. 5-2 is a diagram showing therapeutic kidney reconstitution in a-gal A-deficient Fabry mice.
  • organ culture was performed in the presence of Gb3, and accumulation in the metanephros was evaluated by immunostaining for Gb3.
  • FIG. 6 shows the appearance of the metanephros transplanted into the greater omentum.
  • FIG. 7 shows a systematic analysis of the metanephros (2 weeks) transplanted into the greater omentum.
  • FIG. 8 is a diagram showing transplantation (2 weeks) of kidney primordia at different stages to the greater omentum.
  • Figure 9 shows a new kidney produced by improved relay culture (2 weeks).
  • FIG. 11 shows an electron micrograph of a new kidney transplanted into the greater omentum.
  • LacZ-positive human mesenchymal stem cell strength is also produced in LacZ rats by improved relay culture (2 weeks) It is a figure which shows the tissue findings of the manufactured new kidney.
  • FIG. 13 is a view showing a new kidney produced by improved relay culture (4 weeks).
  • FIG. 14 is a diagram showing a urine-like liquid with new kidney strength.
  • FIG. 15 Time-laboratory observation with a fluorescent stereomicroscope, and the movement of the substance labeled on the intermediate mesoderm.
  • sorted mesenchymal stem cells are collected and transplanted into a fetus in a pregnant mammalian host or a fetus isolated from a pregnant mammalian host.
  • This is a method for preparing kidneys for transplantation of mammals, particularly humans, by inducing ⁇ .
  • mammals include, for example, humans, pets, such as monkeys, mice, hidges, pigs, goats, horses (especially horses), inu. Organs such as cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats and mice can be prepared.
  • the host include, for example, pigs, and other suitable animals include transgenic pigs such as transgenic, knockout, and knockin.
  • Other examples include ungulate animals such as ushi, hidge, pigs, goats and horses.
  • a mouse or the above-mentioned ungulate genetically modified animal, particularly a transgenic animal is preferably exemplified.
  • the mesenchymal stem cells are preferably mesenchymal stem cells derived from the recipient to be transplanted.
  • the recipient is a human, it is isolated from human bone marrow, blood or umbilical cord blood.
  • mesenchymal stem cells (hMSCs) collected from the recipient's bone marrow, blood, or umbilical cord blood are preferred.
  • the sorting method is based on a general surgical medical technique. Sorted cells are selected at optimal conditions, preferably in culture for 2-5 cell passages.
  • a medium kit exclusively for human mesenchymal stem cells manufactured by Cambrex BioScience is preferably used for the purpose of continuing the culture without transformation of hMSCs.
  • a mesenchymal stem cell is introduced with a desired gene using a procedure such as adenovirus and / or retrovirus, if desired.
  • a gene is introduced so that glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) is expressed for the purpose of assisting kidney formation.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • This transformation has been confirmed to increase the formation rate of injected stem cell-derived kidneys from 5.0 ⁇ 4.2% to 29.8 ⁇ 9.2%.
  • the prepared mesenchymal stem cells are then transplanted into a fetus in a pregnant mammalian host.
  • hMSCs can be transplanted directly into an in vivo fetus to form a kidney in the uterus.
  • Transplantation is performed using a general surgical medical technique, such as a micropipette under an echo.
  • the amount of cells to be transplanted is 0.5 to 1.0 ⁇ 10 3 .
  • a mesenchymal stem cell is directly transplanted into an in vivo embryo of a large pregnant mammal such as a pig by a transuterine approach, and the growth is continued in vivo as it is to grow into a transplanting kidney.
  • the subsequent steps of “whole embryo culture” or “organ culture” can be added.
  • the kidney for transplantation is sufficiently grown and is not particularly necessary!
  • the prepared hMSCs are transplanted to a fetus isolated from a pregnant mammalian host (uterus), and then used for organ formation (transplantation kidney) in vitro using whole embryo culture. It can be matured in the fetus until the initial stage is completed and then further cultured in organ culture to become a transplant kidney. In addition, transplant kidneys are transplanted into the greater omentum of mammals including humans.
  • the timing of implantation of the prepared hMSCs into the fetus is selective.
  • E9-12, in particular 10-12, more preferably E10-11.5 was suitable.
  • the same stage embryo can be suitably used even in large mammalian pigs. However, before and after that, it can be applied by selecting conditions. However, it is important that at least the time of transplantation, the stage of embryo development is still the stage of immune tolerance of the host immune system.
  • the present invention has established a method for generating autologous organs from autologous mesenchymal stem cells using an endogenous growth system of an immunocompromised heterologous host.
  • a feature of the present invention is the selection of the site of transplantation of mesenchymal stem cells into the fetus.
  • the site of transplantation of mesenchymal stem cells into the fetus is the site corresponding to kidney development in the host. For this reason, the transplantation needs to be performed at a time when it can be determined that it is an equivalent part of the kidney, but it is preferable that the kidney blast is in a budding state before the start of development.
  • mesenchymal stem Cells can be transplanted into metanephric mesenchyme and differentiated into mesangial cells, tubule epithelial cells, and glomerular epithelial cells. Can be differentiated into ducts and ureters.
  • “Whole embryo culture” in the present invention is performed when hMSCs are transplanted into a fetus isolated from a pregnant mammalian host (uterus).
  • the overview of whole embryo culture is that hMSCs are transplanted into a fetus obtained by separating the uterus from the mother and removing the fetus separated from the outer membrane layer including the uterine wall, decidua, and Reichert membrane. Culture in a culture bottle.
  • some improvements and Z or some steps may be omitted from the above culture method. Good. More specifically, it is as follows, but is not particularly limited.
  • E stage embryo date
  • E 9-12, especially E10-12, more preferably E10-11.5, most preferably El 1.5 rat embryos are separated from the outer membrane layer including the eclampsia wall, decidua and Reichert membrane.
  • Sarahko opens the yolk sac and amniotic membrane so that hMSCs can be injected, but leaves the chorion allantoplacenta intact.
  • Embryos that have been successfully injected with hMSCs are cultured in a culture bottle containing 3 ml of culture medium (glucose, benicillin G, streptomycin, and amphotericin B) in centrifuged rat serum.
  • the culture bottle rotates in an incubator (model number RKI10-0310, Ikemoto, Tokyo).
  • the cultivation time is 12 hours to 60 hours, preferably 24 hours to 48 hours, and most preferably 48 hours.
  • the morphological and functional evaluation is performed to confirm the organ organ of the kidney for transplantation. After this confirmation, the organ prototype is separated from the fetus, and preferably the following organ culture is performed.
  • organ culture in the present invention, the organ prototype is placed on a filter, and DMEM is added to the dish below. Then, the dish is cultured in a 5% CO incubator.
  • the culture time is 12 hours to 168 hours, preferably 18 hours to 72 hours, more preferably 24 hours to 48 hours, and most preferably 24 hours. In other words, transplanting to the greater omentum at about 24 hours is the most efficient.
  • the culture temperature is 20 ° to 45 °, preferably 25 ° to 40 °, and most preferably 37 °.
  • the purpose of “organ culture” in the present invention If it is possible to achieve the purpose of culturing the transplanted kidney, some improvements and Z or some steps may be omitted from the above culture method. Details are described in J. Clin. Invest. 105, 868-873 (2 000) (Non-patent Document 15), but are not particularly limited.
  • the outline of “relay culture” in the present invention is that the whole embryo culture is performed for 2 to 60 hours, and then the organ culture is performed for 12 to 168 hours.
  • the outline of the “improved relay culture” in the present invention is that the whole embryo culture is performed for 2 hours to 60 hours, then the organ culture is performed for 12 hours to 36 hours, and further transplanted to the greater omentum.
  • the host Since the size of the organ is similar to the organ originally held by the host animal, for example, in order to form a kidney that can function sufficiently in humans, the host is approximately the size of a human organ. It is preferable that the mammal has a thickness. However, if the kidney does not need to be completely homologous, dialysis can be performed sufficiently if it has one-tenth of the total function, and it can maintain sufficient life. For this reason, the optimal host is a pig, and the organ size of a miniature pig is considered sufficient.
  • the force of the kidney that has grown forcefully is confirmed from its function, and then is separated from the host and supplied to the recipient.
  • This transplantation site is preferably an example in the greater omentum of the recipient. In the case of the kidney, this transplant completes the formation of a clonal kidney that continues to grow in vivo and exerts kidney function.
  • the method of “transplanting a kidney for transplantation into a greater omentum of a mammal including a human” in the present invention is a force that can be performed by a normal surgical prescription, for example, picking up a tissue to be transplanted with a sharp insulator, In this method, a slight cut is made in the surface of the omentum fat yarn and weaving, and the yarn and weaving is embedded in it. It can also be transplanted to the greater omentum using an endoscope.
  • the formed kidney In order to prevent the formed kidney from contaminating the host-derived antigenic substance, it is effective to convert the transplanted cells into the following traits.
  • cells derived from mesenchymal stem cells and cells derived from the host animal are mixed. Since mixed host-derived cells may cause immune rejection when the kidney is transplanted into a recipient, it is necessary to thoroughly remove the host-derived cells after kidney formation.
  • a host animal that can induce programmed cell death in a controlled manner was created. Form kidneys in animals. After transplanting mesenchymal stem cells into this part of the host animal embryo and creating a kidney, induce cell death specifically for the host cells and completely remove the host-derived cells before transplanting to the recipient .
  • mice wild-type Sprague-Dawley rats were purchased from Sankyo Lab Service (Tokyo) and used.
  • a breeding colony of Fabry mice was established from a mating pair donated by R.O. Brady (National Institute of Health, Bethesda) at the Experimental Animal Center of Jikei University School of Medicine. The midpoint of the day when the vaginal plug was observed was 0.5 days.
  • the animals were housed in a ventilation (positive pressure air flow) rack and mated and bred in the absence of pathogenic bacteria. All experimental procedures were approved by the Jikei University University Animal Experiment Committee.
  • HMSCs obtained from the bone marrow of healthy volunteers were used.
  • a replication-deficient recombinant adenovirus having human GDN FcDNA (AxCAhGDNF) was prepared and purified as described above (Non-patent Document 11).
  • Packaging cells that produce recombinant retroviruses containing the bacterial LacZ gene (MFG-LacZ) were donated by H. Hamada (Sapporo Medical University). Adenovirus infection and retrovirus infection were performed as described above (Non-patent Documents 12 and 13). Cells are labeled with ⁇ , ⁇ '-dioctadecy ⁇ 3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine (Dil (Molecular Probes; 0.25%, wt / vol) in 100% dimethylformamide and urine using a micropipette. Injection into the germination site of tube buds.
  • Dil Molecular Probes
  • Non-patent Document 15 kidney primordia were isolated and cultured.
  • Gb3 globotriaosylceramide
  • the cultured post-renal kidney was cultured in the presence of ceramide deoxyside (1 nmol, Sigma) (Non-patent Document 16).
  • the enzymatic activity of the metanephros ⁇ -galatatosidase A (a-gal A) was evaluated by fluorescence analysis as described above (Non-patent Document 17).
  • the metanephros produced by relay culture were digested in collagenase type I (lmg / ml) for 30 minutes and labeled with fluorescein 'digalatatoside (Molec ular Probes) using temporary permeability due to hypotonic shock.
  • Non-patent Document 18 FACS-Gal Atsey. LacZ positive cells Fractionation was performed using a cell sorter (Becton Dickinson). Aquaporin-1 (AQP-1), parathyroid hormone (PTH) receptor 1, 1 a hydroxylase, Na + -HCO—cotransporter 1 (NBC1),
  • RT-PCR glomerular epithelial protein l
  • the cells were stained with propidium iodide and the amount of DNA was evaluated using a flow cytometer.
  • kidney primordia In order to examine the optimal conditions for the growth of kidney primordia in the greater omentum, rat post-renal tissue was divided according to the growth stage and whether or not a nephrectomy was performed, and the degree of growth after transplantation was evaluated. In accordance with the optimum conditions, the kidney primordia prepared above were further transplanted into the greater omentum of the recipient. Two weeks later, it was confirmed by immunostaining and electron microscopy whether or not the tissue was highly classified.
  • the recipient's blood flow was poured into the new kidney, it was transplanted into the greater omentum of a LacZ transgenic rat, and the blood vessels in the new kidney were confirmed to be derived from the recipient. Furthermore, the LacZ gene was also introduced into the human mesenchymal stem cells to be injected, and the blood vessel and donor-derived nephron were integrated to confirm the strength.
  • the recipient's bloodstream circulates, and the recipient's blood is filtered for the recipient's blood to grow urine for 4 weeks in order to examine the possibility of producing urine.
  • the urea nitrogen concentration and creatinine concentration in the liquid accumulated inside were measured and compared with the serum concentration to confirm the presence or absence of urine production ability.
  • Non-patent Document 14 The whole embryo culture system was optimized so that a constant oxygen concentration could be continuously supplied to a rotating culture bottle to improve fetal growth outside the uterus.
  • rat embryos E11.5 were mixed with yolk sac, amniotic membrane, and chorionic allantoplacenta with glucose (10 mg / ml) in a culture bottle containing 100% freshly centrifuged rat serum medium.
  • rat embryos were evaluated for eclampsia by comparison with embryos grown in E11.5, E12.0, E12.5, El 3.0, E13.5 in the pupae.
  • the fetuses were evaluated for heart rate, general blood circulation, and general morphology.
  • the metanephros were isolated from fetuses and organ-cultured for 6 days. Using this combination (relay culture), the kidney primordium continues to differentiate and grow in vitro, and repeats tubule formation and ureteric bud branching. This was confirmed by hole mount in sit u hybridization diagram 2 (c) for ret. This indicates that the metanephros can continue to grow until the kidney is completed outside the uterus, even if the fetus is removed from the uterus before the ureteric buds reach the germination stage.
  • HMSCs were injected into the kidney formation site of rat embryos using the system described in A.
  • hMSCs forcibly expressing the LacZ gene using retrovirus and fluorescently labeled with Dil can further transduce GDNF using adenovirus ( Figure 2 (b)), or Without injection (Fig. 2 (a)), it was injected into the germination site of the ureteral bud of the rat embryo.
  • a total of 1 x 10 fetal hMSCs were then injected into the mesoderm between the somite and lateral plate, at the level of segment 29 for rats and at the level of segment 26 for mice.
  • Non-patent Document 15 We estimated these levels to be ureteric bud germination sites by in situ hybridization for the previous c-ret (Non-patent Document 15). The success of the injection was confirmed by the fact that the injected hMSCs were detected along the Wolff tube by an in situ hybridization method that detects the human genome AluI / II that identifies only human cells.
  • Non-Patent Document 10 This transient GDNF expression significantly increased the number of donor-derived LacZ-positive cells in the kidney (29.8 ⁇ 9.2%, Fig. 2 (b)), which was revealed by FACS-Gal Atsey. This LacZ positive cell was sorted and its DNA content was evaluated using the intensity of propidium iodide. As a result, 68.8 ⁇ 11.4% of LacZ-positive cells in newly produced kidney primordia were euploid (Fig. 2 (c)).
  • LacZ-positive cells The number of LacZ-positive cells was significantly increased (2.84 ⁇ 0.49 X 10 5 / kidney primordia) compared to the initial number of cells injected (1 X 10 embryos), which is the remaining multiple. Somatic cells suggest that most undergo cell division. Furthermore, in the fluorescence in situ hybridization method using human Y chromosome and rat Y chromosome, cells with two or more Y chromosomes were not recognized. These data indicated that host cells and donor cells are very unlikely to fuse.
  • kidney primordium was X-gal assembled. LacZ-positive cells are dispersed throughout the metanephric primordia and are morphologically identical to glomerular epithelial cells (panel 1), tubular epithelial cells (panel 2), and stromal cells (panel 3) (Fig. 3-1).
  • kidney primordium serial sections of the kidney primordium were searched with an optical microscope.
  • the glomerular epithelial cells bound to the ureteral epithelial cells (arrows), and some of these cells were continuous tubules in the direction of the medulla (arrow).
  • Fig. 3-2 (b) gl: glomerulus).
  • hMSCs are not only separated into individual kidney cells but also form nephrons (basic units for filtration and resorption) after transplantation.
  • double immunofluorescence staining of ⁇ -gal (left) and WT-1 (right) was performed to confirm differentiation into glomerular epithelial cells.
  • WT-1 is known to be strongly expressed in glomerular epithelial cells at this stage (Non-patent Document 20). Both are positive for the same cell (middle). Some LacZ-positive donor cells are It shows that the differentiation to the spherical epithelial cells is completed (Fig. 3-2 (c)).
  • Kidney primordia generated after relay culture were digested, and single cells were FACS-Gal assembled. Lac Z-positive cells are sorted, RT-PCR is performed, Kir6.1, SUR2, AQP-1, PTH receptor 1, 1 a hydroxylase, NBC-1, nephrin, podosin, GLEPP1, human specific j8 2 Microglobulin (MG) and rat GAPDH expression were analyzed. Lane 1 is the metanephros of control rats, lane 2 is hMSCs, and lanes 3-5 are kidneys formed by three different experiments.
  • Donor-derived LacZ-positive cells are glomerular epithelial cell-specific genes (nephrin, podosin, GLEPP-1) and tubular epithelial cell-specific genes (AQP_1, 1 ⁇ -hydroxylase, sputum receptor 1, and NBC-1) (Fig. 3-3).
  • ⁇ sensitive ⁇ + channel subunit, Kir6.1 / SUR2 Non-patent Document 21
  • GDN F was further introduced into hMSCs expressing the LacZ gene using retrovirus using adenovirus, cultured, and then injected into the kidney (E13).
  • the obtained metanephros were X-gal assembled (Fig. 4 (a)).
  • the inset shows LacZ positive cells at high magnification.
  • the injected hMSCs-derived cells remain aggregated and do not form a high-dimensional structure of the kidney.
  • RNA was extracted and RT-PCR was performed.
  • the newly generated kidney primordium before (lane 2) and after (lane 3) organ culture is shown.
  • the mixture of metanephros and hMSCs before (lane 4) and after (lane 5) organ culture is shown.
  • Lane 1 is the marker ( ⁇ X174 / HaeIII). As shown in the figure, it was confirmed that even when hMSCs were injected into cultured tissues that had already differentiated to the metanephros, no kidney-specific gene was expressed (Fig. 4 (b)). Due to the above events, only hMSCs injected before the ureteric buds germinate can be transformed to integrate into the kidney primordium and express kidney-specific genes during organ culture. Other articles The results indicated that these genes could not be expressed. Thus, according to the above, hMS Cs completes the first essential step involved in renal fate during whole embryo culture, and during organ culture further transition to stromal force epithelium, or stromal production It shows that they will receive a share for
  • hMSCs-derived nephrons were transplanted into E9.5 embryos of knockout mice that do not express ⁇ -gal A gene (Fabry mice) and relay culture was performed (non- Patent Document 22).
  • This a-gal A deficiency is known as Fabry disease in humans and causes abnormal accumulation of glycosphingolipid (Gb3) mainly in glomerular and tubular epithelial cells, resulting in renal failure after birth .
  • Gb3 glycosphingolipid
  • the a-gal A enzyme biological activity of the human mesenchymal stem cell-derived kidney primordia prepared by the above-described method was evaluated with a fluorometer as described above (Non-patent Document 19).
  • wild type mice (left) and Fabry mice (right) were compared with the same protocol using the same protocol, and compared with wild type mice (655.0 ⁇ 199.6 nmol / mg / hour),
  • the a-gal al bioactivity in the group is very low (19.7 ⁇ 5.5 nmol / mg / h), but the kidney primordium with human mesenchymal stem cell-derived nephrons injected in comparison with this has a significantly higher amount of a -gal A bioactivity was expressed (204.2 ⁇ 98.8 nmol / mg / hour, p ⁇ 0.05, Figure 5-1).
  • hMSCs can be involved in the fate of an organ by growing the hMSCs at a specific position of the organ in whole embryo culture.
  • hMSCs By injecting hMSCs into which the GDNF gene has been introduced into the fetus and then performing relay culture, it becomes possible to form nephrons rather than individual kidney constituent cells.
  • These hMSC-derived cells are functional as indicated by their Gb3 metabolic capacity test.
  • the hMSCs can be reprogrammed to other fate and organ structures as they enter and depend on the embryonic environment.
  • An additional advantage of using hMSCs is that they are mesoderm in the primordial, but have the potential to distribute to cell types usually derived from ectoderm or endoderm. Patent Document 23).
  • the host immune system does not grow well at this stage of whole embryo culture. Therefore, it is tolerant to heterologous cells.
  • the present invention is the establishment of a method for generating autologous organs from autologous mesenchymal stem cells using an endogenous growth system of an immunocompromised heterologous host.
  • FIG. 7 shows the histological analysis of the grown kidney.
  • the blood vessels of the kidney were filled with red blood cells that were not found before transplantation, and histologically it was shown that the blood circulation was open.
  • glomerular mesangial cells desmin positive
  • WT-1 and synaptopodin positive cells highly differentiated glomerular epithelial cells that could not be confirmed before transplantation to the greater omentum were confirmed.
  • Fig. 8 transplantation to the greater omentum of different stages of the metanephros.
  • transplantation of immature metanephric thread and tissue up to E12.5 did not cause subsequent growth, but it was shown that the kidney was grown in metanephric tissue after E13.5. .
  • rat embryos E11.5 were cultured in whole embryos (48 hours), organ-cultured for 24 hours until they were able to continue growing in the greater omentum, and transplanted into the greater omentum (improved relay culture).
  • a single nephrectomy was performed to further promote growth.
  • Figure 9 shows the newborn kidney that grew after 2 weeks. Histological examination also confirmed that the blood circulation was open as described above, maintaining a highly differentiated glomerular structure.
  • FIG. 12 shows the new kidneys produced in the LacZ rat omentum by this improved relay culture (2 weeks). Tubular tubules connected only to the vasculature in the kidney were also LacZ-positive, indicating that the injected nephrons derived from human mesenchymal stem cells and recipient-derived blood vessels were integrated.
  • Fig. 13 shows the morphology of the new kidney grown for 4 weeks in the greater omentum. It was determined that hydronephrosis was formed by the urine produced because the kidney had no ureteral opening. Therefore, when the liquid stored in the ureter was collected and the force of urine was examined, it was found that the urea nitrogen concentration and creatinine concentration were significantly higher than those of serum, and that the urine was filtered through glomeruli. Was suggested. During the 2 to 4 weeks when the kidney grows and urine is formed, the urinary tract of the cloned kidney is opened to the recipient's ureter, bladder, rectum, or skin to form the urine outlet. It is effective to make it.
  • Figure 14 shows urine-like fluid from a new kidney.
  • Shiroyama Chicken Farm (Tsukui-gun, Kanagawa Prefecture)
  • a chick sperm egg (Hipeko 'Nera species) that has also obtained force is generated for 34 to 35.5 hours in an incubator at 38 ° C, and it reaches the stage 9 to ll of Milton. Lengthened.
  • the intermediate mesoderm was selected as the transplantation site, and a labeling substance was introduced here to track the movement associated with development.
  • Dil Molecular Probes
  • This dye is lipophilic and is incorporated into the cell membrane, and has the property of emitting strong fluorescence, so it is effective for tracing the lineage of labeled cells.
  • Dil was dissolved in absolute ethanol to 0.5% (wt / vol), and further diluted 10-fold with 0.3M sucrose.
  • the labeling substance is introduced by opening a hole in the eggshell and approaching the embryo at each stage of development under a stereomicroscope-a small amount of Dil is micropipetted into the surrounding tissue of the middle mesoderm of the chick avian embryo. Injected so as not to damage.
  • -Panett-Compton salt solution which is a physiological saline used for chick embryos, was appropriately applied to the embryos to prevent drying.
  • the holes were closed with cellotape (registered trademark), and the development was continued in a 38 ° C incubator kept at a sufficient humidity, and the movement of Dil-labeled cells and the formation of ureteric buds were monitored with a fluorescent stereomicroscope. Imlabs observation was performed.
  • stagelO which is the Tuol tube primordium (about 35 hours incubation)
  • stagelO which is the Tuol tube primordium
  • Dil was incorporated into the epithelial cells of the Wolf tube.
  • the present invention enables a new development of kidney transplantation.
  • a patient who has undergone dialysis due to kidney disease sorts his / her own mesenchymal stem cells, and uses this for the fetus or pregnant mammal of a pregnant host animal.
  • Animal host power If transplanted to a separate fetus and transplanted to itself after a certain growth of the organ, the creation of an organ carrying the original function can be achieved.

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Abstract

　本発明は、哺乳動物用移植用臓器、特に腎臓の調製方法を提供することに関する。 　本発明は、自己の間葉系幹細胞を分取し、これを妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物の宿主から分離した胎児の所望部位に移植し分化を導き、その後発達した臓器を自己に戻すことを特徴とする自己臓器特に腎臓の自己移植のための手段を提供する。

Description

明 細 書
移植用臓器の調製方法
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳動物移植用臓器、特に腎臓の調製方法を提供するものである。
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号 2006-1187 99からの優先権を請求する。
背景技術
[0002] 臓器再生は、最近新 、治療戦略として多くの注目を集めて 、る。再生医療の可 能性は、各種組織幹細胞の発見と、それらを用いたニューロン (非特許文献 1)、 β 細胞 (非特許文献 2)、筋細胞 (非特許文献 3)、血管 (非特許文献 4)などの再生によ る治療効果が報告されると共に、しだいに認識されるようになっている。しかし今日ま でこのような戦略を用いて成功した例は、細胞及び単純な組織に限定されている。特 に腎臓や肺臓など解剖学的に複雑な臓器は、いくつかの異なった細胞力 成ってお り、高度な 3次元的構造及び細胞情報伝達系を有するために、幹細胞ベースの再生 技術ではより対応が困難であることが考えられる。
[0003] 一方、これらの複雑な臓器は、移植医療の進歩とともにこれまで改善が期待できな い臓器障害に対し移植により完治が期待できるようになった。しかし世界的に慢性的 なドナー不足であり、また移植がうまくいった場合でも拒絶反応回避のための免疫抑 制剤の長期服用が必要となり、これに伴う副作用と戦 、続けなければならな!/ヽ (非特 許文献 5)。
[0004] 従って究極的な治療目的の一つは自己組織幹細胞から自己臓器を作製し、自己 移植片として in vitro由来の臓器を再び個々のドナーに移植して戻すことである。 成人骨髄に認められるヒト間葉系幹細胞 (hMSCs)は最近、その微小環境に依存し て可塑性を維持し、いくつかの異なった細胞型に分ィ匕することが明ら力となった (非 特許文献 6)。 hMSCsは、胚性幹細胞 (ES細胞）と比較して、自己骨髄から分離するこ とができ、重大な倫理的問題も免疫学的結果も伴わずに治療に応用が可能である（ 非特許文献 7)。 非特許文献 1: J. Neurosci. Res.69,925-933(2002)
非特許文献 2: Nat. Med.6, 278-282(2000)
非特許文献 3: Nature 410,701-705(2001)
非特許文献 4: Nat. Med.5, 434-438(1999)
非特許文献 5: Transplantation 77, S41-S43(2004)
非特許文献 6: Science 276, 71-74(1997)
非特許文献 7: Birth Defects Res.69, 250-256(2003)
非特許文献 8 organogenesis of the Kidney (Cambridge Univ.Press, Cambridge, U.K. ) (1987)
非特許文献 9: Exp. Nephrol.10,102-113(2002)
非特許文献 10: Am. J. Kidney Dis.31, 383-397(1998)
非特許文献 11 :J. Neurosci. Res.60, 511-519(2000)
非特許文献 12: Blood 98, 57-64 (2001)
非特許文献 13: J. Am. Soc. Nephrol.l 1, 2330-2337(2001)
非特許文献 14: Methods 24, 35-42(2001)
非特許文献 15: J. Clin. Invest.105, 868-873(2000)
非特許文献 16: J. Neurol. Sci.65, 169-177(1984)
非特許文献 17: Kidney Int.64, 102-109(2003)
非特許文献 18: Cytometry 12, 291-301(1991)
非特許文献 19: Dev. Growth Differ.37, 123-132(1995)
非特許文献 20: Am. J. Physiol.279,F65-F76(2000)
非特許文献 21: Eur. J. Physiol.445, 321-330(2002)
非特許文献 22:Proc. Natl. Acad.Sci.USA 97, 7515-7520(2000)
非特許文献 23: Nature 418, 41-49(2002)
非特許文献 23: Am. J. Physiol.280,R1865-1869(2001)
非特許文献 24: Methods 24, 35-42(2001)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] 本発明は、哺乳動物由来の間葉系幹細胞を利用して、腎臓などの複雑な器官の 創生を達成する手段を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明の対象とする臓器の一つは、腎臓である。腎臓は複雑な器官を代表するも ので、いくつかの異なった細胞型からなり、高度の三次元構造を有しており、また胚 内での発生経過が十分に研究されている。腎臓の発生は、腎形成索 (非特許文献 8 )の尾部で後腎間葉が近接のゥオルフ管を誘導し、尿管芽 (非特許文献 9)を生成す るときに開始する。成長は尿管芽と後腎間葉 (非特許文献 10)との間の相互の上皮- 間葉シグナル伝達の結果として進行する。哺乳動物由来の間葉系幹細胞が腎の成 長に関与しうるかどうかを検討するために、先ず、齧歯類の腎原基形成直前の胚段 階で抽出したゥオルフ管、または確立した後腎原基とともにヒト間葉幹細胞 (hMSCs) を共培養した。しかし、この方法は腎の臓器形成、または成長中の齧歯類後腎への h MSCsの統合を達成するには十分ではな力つた。この検討により、臓器形成のために 必要な全てのシグナルに暴露できるように、 hMSCsは特定の胚ニッチに置かなけれ ばならないことを認識した。そして、本発明者は、 hMSCsを成長中胎児の腎形成部位 に移植することにより最もよく臓器形成を達成することができることを見出し、本発明 の一を完成した。つまり、間葉系幹細胞を後腎形成間葉に移植することで、メサンジ ゥム細胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞に分化させることが可能であり、さらに 間葉系幹細胞を中間中胚葉に移植することで、尿管芽由来の集合管及び尿管に分 ィ匕させることが可會である。
[0007] 出生前に経子宫アプローチによって細胞を器官形成の正確な部位に移植すること は困難である。また細胞移植のために一旦胎児を単離すると、胎児を再び子宮に戻 して成長させることはできない。本発明者らは細胞移植のために、胎児を子宮から分 離し、全胚培養を用いて in vitroにて胎児が器官形成の初期段階を完了するまで成 熟させ、その後器官培養およびレシピエントの腹腔内でさらに成長させた。本発明の その他において、この培養の組合せを用いることにより hMSCsは形態的に本来の腎 細胞と同じ細胞に分化し、複雑な腎構造に寄与できることを見出し、さらにこの新規 腎臓はろ過機能を持ち、レシピエントの血流を受け入れ尿を生成することが可能であ ることを示し、本発明を完成した。
[0008] すなわち本発明は、
「1.分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊 娠哺乳動物の宿主力 分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分ィ匕を導くことに よる哺乳動物移植用の臓器の調製方法であって、該間葉系幹細胞の胎児への移植 部位が中間中胚葉であり、移植時期は宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であるこ とを特徴とする移植用臓器の調製方法。
2.前記臓器が、腎臓である前項 1に記載の方法。
3.前記哺乳動物由来の間葉系幹細胞を別途後腎形成間葉に移植し、メサンジゥム 細胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞に分化させる前項 2に記載の方法。
4.哺乳動物由来の間葉系幹細胞の中間中胚葉への移植によって、尿管芽由来の 集合管及び尿管に分化させる前項 1〜3の何れか一に記載の方法。
5.前記宿主が、ヒトの腎臓と近似した大きさをもつ哺乳動物である前項 1〜4のいず れか一に記載の方法。
6.前記宿主が、ブタである前項 5に記載の方法。
7.哺乳動物由来の間葉系幹細胞の胎児への移植が、経子宫アプローチによって該 細胞を宿主に移植する前項 1〜6のいずれか一に記載の方法。
8.哺乳動物由来の間葉系幹細胞の胎児への移植が、胎児を子宮力 分離し、該細 胞を該胎児に移植し、その後、全胚培養を用いて in vitroでさらに発達させる前項 1 〜7のいずれか一に記載の方法。
9.哺乳動物由来の間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、前項 1〜8に記載の 方法。」からなる。
発明の効果
[0009] 本発明は、自己臓器特に腎臓の自己移植のための新たな手段を提供した。つまり 、 自己の間葉系幹細胞を分取し、これを妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳 動物の宿主力も分離した胎児の所望部位に移植し分ィ匕を導き、腎臓を創生、その後 発達した腎臓を自己に戻すことが可能となった。
図面の簡単な説明 圆 1-1]リレー培養を用いた腎臓原基の子宮外分ィ匕を示す図である。
圆 1-2]リレー培養を用いた腎臓原基の子宮外分ィ匕を示す図である。尿細管形成お よび拡大尿管芽の分岐の程度を確認するため、へマトキシリン Zェォジン染色 (b)及 び C- retに対するホールマウント in situハイブリダィゼーシヨン (c)を示す。
[図 2]培養由来の後腎におけるドナー由来細胞の割合及びその DNA倍数性の評価 を示す図である。 Mは情報量の多いピークである。
[図 3-1]移植 hMSCsの腎臓構成細胞への分ィ匕を示す図である。リレー培養後に生じ た後腎を X-galアツセィして、移植 hMSCsを追跡したものである。
[図 3-2]移植 hMSCsの腎臓構成細胞への分ィ匕を示す図である。（b)連続切片を光学 顕微鏡で検索したものである。（c)組織切片にっ 、て、 β -gal (左）、 WT-1 (右）の 2色 免疫蛍光染色を行ったものである。
[図 3-3]移植 hMSCsの腎臓構成細胞への分ィ匕を示す図である。リレー培養後に生じ た後腎を消化し、単一細胞を FACS-ガラクトシダーゼアツセィしたものである。
[図 4]分離した後腎における hMSCsの注入及び培養を示す図である。（a)は、 6日間の 器官培養後、得られた後腎を X-galアツセィしたものである。（b)は、 RNAを抽出し、 RT - PCRを行つたものである。
[図 5-1] a - gal A欠損 Fabryマウスにおける治療的腎の再構成を示す図である。生じ た後腎の a -gal A酵素生物活性を既述の通りフルォロメターで評価したものである。
[図 5-2] a - gal A欠損 Fabryマウスにおける治療的腎の再構成を示す図である。得ら れた後腎の Gb3クリアランス能を確認するため、 Gb3存在下で器官培養を実施し、後 腎における蓄積を Gb3に対する免疫染色により評価したものである。
[図 6]大網中に移植された後腎の出現を示す図である。
圆 7]大網中に移植された後腎 (2週)の組織的分析を示す図である。
圆 8]異なるステージの腎臓原基の大網への移植 (2週)を示す図である。
圆 9]改良リレー培養 (2週)で生成した新規腎臓を示す図である。
圆 10]新規腎臓内にレシピエントからの血管が構築されていることを示す図である。
[図 11]大網中に移植した新規腎臓の電子顕微鏡写真を示す図である。
圆 12]改良リレー培養 (2週)によって、 LacZ陽性ヒト間葉系幹細胞力も LacZラットに作 製した新規腎臓の組織所見を示す図である。
[図 13]改良リレー培養 (4週)によって、生成した新規腎臓を示す図である。
[図 14]新規腎臓力もの尿様液を示す図である。
[図 15]蛍光実体顕微鏡でタイムラブス観察を行い、中間中胚葉に標識した物質の動 きを追跡した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞特にヒト間葉系幹細胞 (hMSCs )を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物の宿主から分離した胎児に移植 して分ィ匕を導くことによる哺乳動物特にヒト移植用の腎臓の調製方法である。
[0012] 本発明の移植用臓器の調製方法では、哺乳動物には例えば、ヒト、愛玩動物、例 えばサル、ゥシ、ヒッジ、ブタ、ャギ、ゥマ（特に競馬ゥマ）、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ハムス ター、モルモット、ラット、マウスなどの臓器を調製可能である。宿主の好適な例として は、例えばブタが例示され、その他の好適な動物としては、遺伝子組換えされた、例 えばトランスジエニック、ノックアウト、ノックイン等のブタが例示される。その他、有蹄 動物、例えばゥシ、ヒッジ、ブタ、ャギ、ゥマ等が例示される。さらに、マウスもしくは上 記有蹄動物の遺伝子改変動物、特にトランスジ ニック動物等が好適に例示される。
[0013] 間葉系幹細胞 (hMSCs)は、移植対象のレシピエント由来の間葉系幹細胞が好まし い。例えば、レシピエントがヒトである場合には、ヒト骨髄、流血中又は臍帯血から分 取される。特にレシピエント本人の骨髄、流血中又は臍帯血から分取される間葉系幹 細胞 (hMSCs)が好ましい。分取法は、一般的な外科的医学手法による。分取された 細胞は、最適条件を選択し、好適には培養を 2〜5細胞継代にする。さらに、好適に は hMSCsの形質転換させないまま培養を継続する目的で Cambrex BioScience社製 のヒト間葉系幹細胞専用培地キットを用いる。
間葉系幹細胞は、所望により、アデノウイルス及び/又はレトロウイルス等の手技を 使い所望の遺伝子を導入される。例えば腎臓を所望する場合、腎臓形成を補助する 目的にてグリア細胞由来神経栄養因子（Glial cellline- derived neurotrophic factor- G DNF)を発現するように遺伝子導入させる。これは腎臓が形成される直前の間葉組織 は GDNFを発現するようになり、その受容体である c-retを発現する尿管芽を引き込む ことで腎臓発生の最初の重要なステップを完了させるからである。この形質転換によ り、注入幹細胞由来腎臓の形成率を 5.0±4.2%から 29.8±9.2%に上昇させることを 確認している。
[0014] 調製された間葉系幹細胞は、次いで妊娠哺乳動物宿主中の胎児に移植される。す なわち、生体内の胎児に直接 hMSCsを移植し、子宮内で腎臓の形成をさせることが できる。移植の手法は一般的な外科的医学手法、例えばエコー下にてマイクロピぺ ット等を使い行う。移植する細胞量は 0.5〜1.0 X 103個で十分である。すなわち、ブタ などの大型の妊娠哺乳動物の生体内の胚に、経子宮アプローチによって、直接間葉 幹細胞を移植し、そのまま生体内で成長を続けさせ、移植用腎臓への成長をさせる。 また、その後、以下に示す「全胚培養」又は「器官培養」の工程を追加することもでき る力 移植用腎臓は十分に成長して 、るので特に必要がな!、。
[0015] また、好ましくは、調製された hMSCsは、妊娠哺乳動物宿主 (子宮)から分離した胎 児に移植し、その後、全胚培養を用いて in vitroにて器官形成 (移植用腎臓)の初期 段階を完了するまで胎児の体内で成熟させ、その後器官培養でさらに培養して、移 植用腎臓となることができる。さらに、移植用腎臓をヒトを含む哺乳類の大網に移植 する。
[0016] 調製された hMSCsの胎児への移植の時期は、選択的である。ラットを使った実験で は E9〜12、特に 10〜12、より好ましくは E10〜11.5が好適であった。大型の哺乳動物 のブタ等でも、同様のステージ胚が好適に利用できる。しかし、その前後も条件を選 定することによって適用可能である。しかし、重要なことは少なくとも移植時期は、胚 の成長段階が、宿主の免疫系が未だ免疫寛容の段階であることである。
[0017] なお、ホスト免疫系は全胚培養のこの段階では十分には成長しない。従って異種 細胞に対して寛容性を有する。本発明は、免疫無防備の異種ホストの内在的な成長 系を用いて自己間葉系幹細胞から自己器官を生成する方法を確立した。
[0018] 本発明の特徴は、間葉系幹細胞の胎児への移植の部位の選択である。つまり、間 葉系幹細胞の胎児への移植部位が宿主における腎臓発生相当部位である。そのた め、移植は、腎臓の相当部位であることが確定できる時期であることが必要となるが、 腎臓の芽細胞が発達開始前の萌芽状態であることが好ましい。例えば、間葉系幹細 胞を後腎形成間葉に移植し、メサンジゥム細胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞 に分化させることができ、間葉系幹細胞の中間中胚葉への移植によって、尿管芽由 来の集合管及び尿管に分化させることができる。
[0019] 本発明における「全胚培養」は、 hMSCsを妊娠哺乳動物宿主 (子宮)から分離した 胎児に移植する場合に行う。全胚培養の概要は、子宮を母体から分離し、そこから胎 児を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離したものを取り出して得 た胎児に hMSCsを移植し、これを培養瓶内等で培養する。しかしながら、本発明にお ける「全胚培養」の目的である移植用腎臓を培養するとの目的を達成できるなら、上 記培養方法に一部の改良及び Z又は一部の工程を削除してもよい。より詳しくは、 以下の通りであるが特に限定はされない。
若干変形を加えた以外は既述通りの方法 (非特許文献 24)で全胚を in vitroで培養 する。実体顕微鏡等を用いて、子宮を麻酔下母体より摘出する。（E:ステージ胚日） E 9〜12、特に E10〜12、より好ましくは E10〜11.5、最も好ましくは El 1.5のラット胚を子 宫壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離す。さら〖こ、 hMSCsを注入できる ように卵黄嚢及び羊膜を開くが、絨毛膜尿膜胎盤はそのままの形で残す。 hMSCsの 注入の成功が確認できた胚を、遠心分離したラット血清に培養培地 (ブドウ糖、ベニ シリン G、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシン B) 3mlを入れた培養瓶内で培養す る。培養瓶はインキュベータ（型番号 RKI10-0310、 Ikemoto、東京）内で回転する。培 養時間は、 12時間〜 60時間、好ましくは 24時間〜 48時間、最も好ましくは 48時間 である。なお、好適には、一定培養時間後に、形態的 ·機能的に評価し、移植用腎臓 の器官原器を確認する。この確認の後、該器官原器を胎児より分離し、好適には以 下の器官培養を行う。
[0020] 本発明における「器官培養」の概要は、上記器官原器をフィルター上に置き、その 下の dishに DMEMを加える。そして、該 dishを 5%CO インキュベータ一中で培養する
2
。培養時間は、 12時間〜 168時間、好ましくは 18時間〜 72時間、より好ましくは 24 時間〜 48時間、最も好ましくは 24時間である。すなわち、約 24時間の時点で大網に 移植するのが一番効率が良い。また、培養温度は、 20度〜 45度、好ましくは 25度〜 40度、最も好ましくは 37度である。しかしながら、本発明における「器官培養」の目的 である移植用腎臓を培養するとの目的を達成できるなら、上記培養方法に一部の改 良及び Z又は一部の工程を削除してもよい。詳細は、 J. Clin. Invest.105, 868-873(2 000) (非特許文献 15)に記載されているが、特に限定はされない。
[0021] 本発明のおける「リレー培養」の概要は、上記全胚培養を 2時間〜 60時間行い、次 に上記器官培養を 12時間〜 168時間行うことである。
また、本発明における「改良型リレー培養」の概要は、上記全胚培養を 2時間〜 60 時間行い、次に上記器官培養を 12時間〜 36時間行い、さらに大網に移植すること である。
[0022] 器官の大きさは、宿主動物の本来保持する器官に相同するので、例えばヒトにおい て十分な機能を発揮させうる腎臓を形成させるためには、宿主が、ヒトの臓器と近似 の大きさをもつ哺乳動物であることが好ましい。ただし、全く相同の大きさを持つ必要 はなぐ腎臓であれば全体の 10分の 1の機能があれば十分透析を行うことができ、十 分生命を維持できる。この理由より最適な宿主はブタであり、ミニチュアブタの臓器の 大きさで十分と判断される。
[0023] 力べして成長した腎臓は、機能確認がされた後、宿主から切り離され、レシピエント に供与される力 この移植部位は、好ましくはレシピエントの大網中が好適な一例で ある。腎臓の場合、この移植によって、器官は生体内成長を継続し、腎臓機能を発揮 するクローン腎臓の形成が完成する。
なお、本発明における「移植用腎臓をヒトを含む哺乳類の大網に移植する」方法は 、通常の外科的処方により行うことができる力 例えば、鋭利な鑷子で移植する組織 をつまみ、鑷子の先で大網の脂肪糸且織の表面にわずかに切り口を作りその中に糸且織 を埋め込む方法である。また、内視鏡を利用して大網に移植することができる。
[0024] なお、形成された腎臓が、宿主由来の抗原性物質を夾雑しないようにするためには 、移植細胞を、以下のような形質に変換しておくことが有効である。つまり形成された 腎臓内には間葉系幹細胞由来の細胞と宿主動物由来の細胞が混在する。混在した 宿主由来細胞は腎臓をレシピエントに移植した際に、免疫拒絶反応を引き起こす可 能性があるために、腎臓形成後、宿主由来細胞を徹底的に取り除く必要がある。これ を解決するために、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物を作成し、こ の動物において腎臓を形成する。この宿主動物胚の当該部位に間葉系幹細胞を移 植し、腎臓を作成した後、宿主細胞特異的に細胞死を誘導し、レシピエントに移植す る前段階で宿主由来細胞を完全に取り除く。
実施例
[0025] 以下、本発明の代表例としてラットを使用した腎臓の系により説明するが、本発明 はこれに限定されるものではな!/、。
[0026] 実験例 1
(使用材料と方法）
1)実験動物
動物は、野生型 Sprague-Dawleyラットを三共ラボサービス (東京)より購入し、使用し た。東京慈恵会医科大学の実験動物センターにおいて、 R.O. Brady氏（National Ins titute of Health, Bethesda)より寄贈された交配ペアから Fabryマウスの繁殖コロニー を確立した。膣栓を認めた日の中間点を 0.5日とした。動物は換気（陽圧気流)ラック の中に収容し、病原菌のない状態下で交配、飼育した。全ての実験的手順は東京慈 恵医科会大学動物実験委員会により承認された。
[0027] 2) hMSCsの培養及び操作
健常志願者の骨髄から得られた hMSCsを使用した。 CD105、 CD166-、 CD29-、 CD 44-陽性及び CD 14-、 CD34-、 CD45-陰性と確認された骨髄由来の hMSCsを Cambre X Bioscience社 (Walkers ville、 MD)力 購入し、製造者の提供するプロトコールに従 い、培養した。 hMSCsは形質変化を避けるために 5細胞継代以内で用いた。ヒト GDN FcDNA (AxCAhGDNF)を有する複製欠損組み換え型アデノウイルスを既述の通り作 成し、精製した (非特許文献 11)。細菌性 LacZ遺伝子 (MFG-LacZ)を有する組み換 え型レトロウイルスを産生するパッケージング細胞（ψ- crip)は H. Hamada (札幌医科 大学)より寄贈された。アデノウイルス感染及びレトロウイルス感染を既述の通り実施 した（非特許文献 12、 13)。細胞は 100%ジメチルホルムアミド中で Ι,Ι'-dioctadecy卜 3,3,3 ,3 -tetramethylindocarbocyanine (Dil (Molecular Probes; 0.25%、wt/vol)を用 ヽ て標識し、マイクロピペットを用いて尿管芽の発芽部位に注入した。
[0028] 3)全胚培養及び器官培養 若干変形を加えた以外は既述通りの方法 (非特許文献 14)で全胚を in vitroで培養 した。実体顕微鏡を用いて、子宫を麻酔下母体より摘出した。（E:ステージ胚日） E11. 5のラット胚および E9.5マウス胚を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切 り離した。注入できるように卵黄嚢及び羊膜を開いたが、絨毛膜尿膜胎盤はそのまま の形で残した。注入が成功した胚を、直ちに 100%遠心分離したラット血清にブドウ糖 (10mg/ml)、ペニシリン G ( 100単位/ ml)、ストレプトマイシン（100 μ g/ml)、及びアンフ ォテリシン B (0.25 μ g/ml)をカ卩えた培養培地 3mlを入れた 15- mlの培養瓶内で培養し た。培養瓶はインキュベータ（型番号 RKI10-0310、 Ikemoto,東京）内で回転させた。 ラット胚の ex vivoの成長は 24時間一 48時間の培養期間後に評価し、 E12.5及び E1 3.5のラット胚と比較した。 48時間後、胎児を心拍、全身血液循環、及び全身の形態 にっき評価した。既述の通りに腎臓原基を単離し、培養した (非特許文献 15)。腎臓 原基内のグロボトリアオシルセラミド (Gb3)の蓄積を高めるため、培養した後腎をセラ ミデトリへキソシデ（1 nmol、 Sigma)の存在下で培養した (非特許文献 16)。後腎の α -ガラタトシダーゼ A ( a -gal A)の酵素活性を既述の通りに蛍光分析法で評価した（ 非特許文献 17)。
[0029] 4)組織学
後腎の二重染色を、第一次抗体としてマウス抗 β -gal (Promega社)及びラビット抗ヒ ト WT-1 (Santa Cruz Biotechnology社）を用いて、原則として既述通り（非特許文献 17 )に実施した。モノクロナールマウス抗 -Gb3抗体 (生化学社、東京)も用いた。ジゴキ シゲニン UTP-標識 c-retリボプローブを用いたホールマウント in situハイブリダィゼー シヨンを既述通り実施した (非特許文献 15)。組織切片の in situハイブリダィゼーショ ンもピオチン標識ヒトゲノム AluI/IIプローブ（Invitrogen社）を用いて製造者のプロトコ ールに従い実施した。既述通り、 LacZ遺伝子の発現を評価するために X-galアツセィ を用いた (非特許文献 13)。
[0030] 5) hMSC由来 LacZ陽性細胞の同定
リレー培養により生成された後腎を 30分間コラゲナーゼ I型（lmg/ml)内で消化し、 低張性ショックによる一時的な透過性を用いて、フルォロセイン'ジガラタトシド (Molec ular Probes社)で標識した (非特許文献 18) (FACS- Galアツセィ)。 LacZ陽性細胞を 、セルソータ（BectonDickinson社）を用いて分別した。アクアポリン- 1 (AQP- 1)、副甲 状腺ホルモン（PTH)受容体 1、 1 aヒドロキシラーゼ、 Na+-HCO—共輸送体 1 (NBC1)、
3
ネフリン、ポドシン、糸球体上皮蛋白質 l (GLEPP-l)の発現を分析するために、総 RN Aを抽出し RT-PCRにかけた。細胞の倍数性を分析するために、 propidium iodideを 用いて細胞を染色し、 DNA量をフローサイトメーターを用いて評価した。
[0031] 6)機能的ドナー由来クローン腎臓の作製
大網内での腎臓原基の成長の最適条件を検討するため、ラット後腎組織を成長段 階、片腎摘出の有無で分けて移植後の成長程度を評価した。その最適条件に則り、 上述で作製した腎臓原基をさらにレシピエントの大網に移植した。 2週間後に腎臓の 高度に分ィ匕した組織所見であるカゝ否かを免疫染色、電子顕微鏡にて確認した。
[0032] 7)レシピエントの血管とクローン腎臓の統合の確認
レシピエントの血行が新生腎臓に注がれて 、ることを確認するため、 LacZトランスジ エニックラットの大網に移植し、新生腎臓内の血管がレシピエント由来であることを確 認した。さらに注入するヒト間葉系幹細胞も LacZ遺伝子導入し、血管とドナー由来ネ フロンが統合して 、る力確認した。
[0033] 8)尿生成能の有無の確認
大網内で成長し、レシピエントの血流が廻っている新生腎臓がレシピエントの血液 をろ過し、尿を生成することが可能力検討するために大網内で 4週間成長させ、尿管 内に溜まった液体中の尿素窒素濃度、クレアチニン濃度を測定し、血清の濃度と比 較することにより尿の生成能の有無を確認した。
[0034] 9)統計解析
データは平均士標準偏差で示した。統計解析は、異なる 2群のデータを比較するた めに、 2標本 t検定を用いて実施した。 Pく 0.05を統計的に有意とみなした。
[0035] (結果）
A.リレー培養システムを用いた腎臓原基の子宮外成長
全胚培養システムは一定の酸素濃度が回転する培養瓶に連続的に供給できるよう に最適化し、子宮外で胎児の成長を改善するようにした (非特許文献 14)。本システ ムを用いて、ラット胚 (E11.5)を卵黄嚢、羊膜、絨毛膜尿膜胎盤と共にブドウ糖 (10mg /ml)を加えた 100%新鮮遠心分離ラット血清培地を入れた培養瓶中で 37°Cで培養し た。培養 24時間及び 48時間後にラット胚の子宫外成長を、 E11.5、 E12.0、 E12.5、 El 3.0、 E13.5にっき子宫内で成長した胚と比較することにより評価した。 48時間後、胎 児を心拍、全身の血液循環、一般的な形態につき評価した。得られた体節数、及び 一般的な形態に基づき、本法で培養したラット胚の成長年齢は子宮内で成長した E1 3胚と一致する成長段階に達した (図 1-1)。この段階で、尿管芽は伸長し、最初の分 岐を完了したが、それは培養中に後腎間葉が刺激を受け、腎形成に向けて第一歩 を踏み出したことを示している。しかし、胎児はそれ以上成長することができず、 in vit roで胎盤の成長が不十分なため 48時間後直ちに死亡した (非特許文献 19)。この限 界を克服するため、全胚培養後に器官培養を行った。 48時間の全胚培養後、後腎 を胎児より単離し、 6日間器官培養を行った。この組み合わせ (リレー培養)を用いて 、腎臓原基は in vitroで分化成長を続け、尿細管形成及び尿管芽分岐を繰り返したこ と力 へマトキシリン Zェォジン染色図 l-2(b)及び c-retに対するホールマウント in sit uハイブリダィゼーシヨン図卜 2(c)によって確認された。このことにより、後腎は尿管芽 が発芽段階に達する前に胎児を子宮力 取り出した場合でも、子宮外で腎臓完成ま で成長を継続することができることが示された。
[0036] B.培養由来の後腎におけるドナー由来細胞の割合及び細胞融合の可能性の評価
A.に記載のシステムを用いて hMSCsをラット胚の腎臓形成部位に注入した。ホスト 細胞と区別するために、レトロウイルスを用いて LacZ遺伝子を強制発現させ、また Dil で蛍光標識した hMSCsは、さらにアデノウイルスを用いて GDNFを遺伝子導入するか (図 2(b))、またはせずに（図 2(a))、ラット胚の尿管芽の発芽部位に注入した。次に総 数 1 X 10 胎児の hMSCsを、ラットについては体節 29のレベル、マウスについては体 節 26のレベルで、体節と外側板との中間にある中胚葉に注入した。これらのレベル を我々は以前の c-retに対する in situノヽイブリダィゼーシヨンにより尿管芽発芽部位で あると推定していた (非特許文献 15)。注入の成功は、ヒト細胞のみを特定するヒトゲ ノム AluI/IIを検出する in situハイブリダィゼーシヨン法により、注入された hMSCsがゥ オルフ管に沿って検出されたことにより確認された。
[0037] リレー培養後、新しく生成された腎臓原基をコラーゲナーゼで消化し、単一細胞を F AC-Galアツセィしたところ、 5.0±4.2%の LacZ陽性細胞が腎臓原基組織内に検出さ れた (図 2(a))。注入部位が 1体節を超える長さで変更された場合、分離した後腎中 に LacZ陽性細胞は検出されな力つた。対照胚において、 hMSCsの代わりに標識をつ けたマウス線維芽細胞を注入した力 LacZ陽性細胞はほとんど認められな力つた。 注入したドナー由来細胞率を上げるため、注入前の hMSCsにアデノウイルス AxCAh- GDNFを用いて一過性に GDNFを発現させた（非特許文献 11)。これは GDNFが通常 この段階で後腎間葉にお 、て発現するようになり、この GDNFとその受容体 c-retとの 間の相互作用による上皮-間葉シグナルが腎臓形成に必須である力 である (非特 許文献 10)。この一過性 GDNF発現によって腎臓内のドナー由来 LacZ-陽性細胞数 が有意に増加したことが（29.8±9.2%、図 2(b)) FACS-Galアツセィにより明らかとなつ た。この LacZ陽性細胞を分別し、その DNA量を、 propidium iodideの強度を用いて評 価したところ新しく生成された腎臓原基における LacZ-陽性細胞の 68.8± 11.4%が正 倍数体であった（図 2(c))。また LacZ-陽性細胞数は注入した細胞の最初の数（1 X 1 0 胚）と比較して有意に増加（2.84±0.49 X 105/腎臓原基)していたが、これは残り の倍数体細胞はほとんどが細胞分裂を受けていることを示唆している。さらにヒト Y染 色体及びラット Y染色体を用いた蛍光 in situハイブリダィゼーシヨン法では、 Y染色体 を二つ以上持つ細胞は全く認められな力つた。これらのデータにより、ホスト細胞とド ナー細胞が細胞融合する可能性が極めて少ないことが示された。
C.移植 hMSCsの腎細胞への分化
リレー培養後に生じた腎臓原基中の移植した hMSCsの動態と形態変化を追跡した 。器官培養中に蛍光顕微鏡下にて成長中の腎臓原基を経時的に観察したところ、 Di I陽性 hMSCsは髄質の方に移動し、腎臓原基の中に分散していく像が確認された。こ れらの細胞が腎臓の構造に寄与したことを検討するために、腎臓原基を X-galアツセ ィした。 LacZ-陽性細胞は後腎原基の全体に分散しており、糸球体上皮細胞 (パネル 1)、尿細管上皮細胞 (パネル 2)、及び間質細胞 (パネル 3)と形態的に同一であること が示された (図 3-1)。さらに腎臓原基の連続切片を光学顕微鏡で検索したところ、糸 球体上皮細胞は尿管上皮細胞 (矢印）と結合し、これらの細胞の一部は髄質 (矢印） の方向に連続的な尿細管の伸長を形成していた（図 3-2(b)、 gl:糸球体)。この像は 移植後 hMSCが個々の腎臓細胞に分ィ匕するのみでなくネフロン (ろ過再吸収の基本 単位)を形成していることを示すものである。さらに糸球体上皮細胞への分化を確認 するため β -gal (左）と WT-1 (右）の二重免疫蛍光染色を行った。 WT-1はこの段階 で糸球体上皮細胞において強く発現することが知られており（非特許文献 20)、両者 が同一細胞に陽性であることより（中央) LacZ陽性ドナー細胞の一部は糸球体上皮 細胞まで分化を完了して 、ることを示して 、る（図 3-2(c))。
[0039] リレー培養後に生じた腎臓原基を消化し、単一細胞を FACS-Galアツセィした。 Lac Z陽性細胞を分別し、 RT-PCRを行って、 Kir6.1、 SUR2、 AQP-1、 PTH受容体 1、 1 a ハイドロキシラーゼ、 NBC- 1、ネフリン、ポドシン、 GLEPP1、ヒト特異的 j8 2ミクログロブ リン (MG)、及びラット GAPDHの発現を解析した。レーン 1は対照ラットの後腎、レーン 2は hMSCs、レーン 3-5は異なる 3回の実験によって形成された腎臓である。ドナー由 来 LacZ-陽性細胞が糸球体上皮細胞特異的遺伝子 (ネフリン、ポドシン、 GLEPP-1) 及び尿細管上皮細胞特異的遺伝子 (AQP_1、 1 αヒドロキシラーゼ、 ΡΤΗ受容体 1、 及び NBC-1)を発現していることが示された（図 3-3)。一方内因性腎細胞と対照的に 、 ΑΤΡ感受性 Κ+チャンネルサブユニット、 Kir6.1/SUR2 (非特許文献 21) (hMSCs内で 発現される）はリレー培養後に依然として発現していた。
[0040] D.分離した後腎における hMSCsの注入及び培養
レトロウイルスを用いて LacZ遺伝子を発現した hMSCsにさらにアデノウイルスで GDN Fを遺伝子導入し、培養した後腎 (E13)に注入した。 6日間の器官培養後、得られた 後腎を X-galアツセィした（図 4(a))。差込図は高拡大率で LacZ陽性細胞を示す。注 入した hMSCs由来細胞は凝集したままで、腎臓の高次元構造を形成していない。さ らにこの LacZ陽性細胞を分別した後 RNAを抽出し、 RT- PCRを行った。器官培養前（ レーン 2)及び後 (レーン 3)の新たに生成した腎臓原基を示す。また器官培養前 (レー ン 4)及び後（レーン 5)の後腎及び hMSCsの混合物を示す。レーン 1は、マーカー（φ X174/HaeIII)である。図に示すようにすでに後腎まで分化した培養組織に hMSCsを 注入しても腎特異的遺伝子を発現しな ヽことが確認された（図 4(b))。以上の事象に より、尿管芽が発芽する前に注入された hMSCsのみが、器官培養中に腎臓原基に統 合され腎特異的遺伝子を発現するように形質転換することが可能であり、その他の条 件ではこれらの遺伝子発現能を獲得できないことが示された。つまり上記により、 hMS Csは全胚培養中には腎の運命に関与する本質的に重要な最初のステップを完了し 、器官培養中にはさらに間質力 上皮への移行、または間質生成のための分ィ匕を受 けることを示している。
[0041] E. a - gal A欠損 Fabryマウスにおける治療的腎の再生
hMSCs由来ネフロンが機能的であるかどうかを検討するため、 hMSCsを α -gal A遺 伝子を発現しないノックアウトマウス（Fabryマウス）の E9.5胚中に移植し、リレー培養 を行った (非特許文献 22)。この a - gal A欠損はヒトにおいて Fabry病として知られ、 主として糸球体上皮細胞及び尿細管上皮細胞にお!ヽてスフインゴ糖脂質 (Gb3)の異 常な蓄積をきたし、出生後に腎不全をもたらす。
[0042] 前述の方法で作製したヒト間葉系幹細胞由来腎臓原基の a -gal A酵素生物活性を 既述の通りフルォロメターで評価した (非特許文献 19)。対照として、野生型マウス（ 左)及び Fabryマウス (右）の後腎を同じプロトコールで比較したところ、野生型マウス（ 655.0± 199.6 nmol/mg/時間）と比較して、 Fabryマウスからの腎臓原基における a -g al A生物活性は極めて低いが（19.7±5.5 nmol/mg/時間）、これに比較して注入した ヒト間葉系幹細胞由来ネフロンを持つ腎臓原基は有意に高い量の a -gal A生物活 性を発現した（204.2 ±98.8 nmol/mg/時間、 p〈0.05、図 5-1)。
[0043] 得られた腎臓原基の Gb3クリアランス能を確認するため、 Gb3存在下で器官培養を 実施し、後腎における Gb3の蓄積を野生型マウス (左)及び Fabryマウス (右）と比較す ることにより解析した。 Fabryマウスの腎臓原基中の尿管芽及び S字体内（図 5_2の右 )の Gb3の蓄積は、リレー培養により形成されたヒト間葉系幹細胞由来ネフロンと統合 することにより著明にクリアランスされることが確認された（図 5-2の中央)。この結果は 新しく生成されたネフロンが生物学的に機能していることを示すものである。
[0044] ここまでの発明により、 hMSCsを全胚培養で器官の特異的位置にぉ 、て生長させる ことによって、 hMSCsをその臓器の運命に関与させることが可能であることを見出した 。 GDNFを遺伝子導入した hMSCsを胎児に注入した後にリレー培養を行うことにより、 個々の腎臓構成細胞ではなくネフロンの形成が可能となる。これらの hMSC由来細胞 は、その Gb3代謝能試験が示す通り機能的である。 [0045] hMSCsは、それらが入って 、く胚環境に依存して、他の運命及び器官構造に再プ ログラム化することができる。さらに hMSCsを用いることの利点は、それらは始原にお いて中胚葉であるが、通常外胚葉または内胚葉に由来する細胞型に分ィ匕していく潜 在能力を有して 、る (非特許文献 23)。
[0046] ホスト免疫系は全胚培養のこの段階では十分には成長しない。従って異種細胞に 対して寛容性を有する。本発明は、免疫無防備の異種ホストの内在的な成長系を用 いて自己間葉系幹細胞から自己器官を生成する方法の確立である。
[0047] 上述までのシステムは、腎臓原基の最終的な成長のために器官培養を使っている ため、形成された腎臓は血管構造を持たない。このため腎臓の基本機能である血液 ろ過の機能については確認できないので、さらにシステムの改良を行った。ラット後 腎組織は大網内に移植した場合、成長を継続できることが報告されているため（非特 許文献 24)、 E15胚力 後腎組織を単離し、ラットの大網に移植し、 2週間後に開腹し たところ、移植した後腎は大網内でさらに成長を続けその腎臓には大網カも血管系 が進入して 、ることが確認された（図 6)。この成長は腎不全状態 (片腎摘出術後)で も低下せず、逆にさらに加速することが示された（図 6)。この成長した腎臓の組織的 解析を図 7に示した。腎臓の血管内には移植前には認められない赤血球が充満して おり、組織学的にも血行が開通していることが示された。さらに大網に移植する前に は確認できなつた糸球体メサンギゥム細胞 (デスミン陽性)及び高度に分化した糸球 体上皮細胞 (WT-1及びシナプトポジン陽性細胞）が確認された。次に移植の最適な タイミングを検討するために、異なるステージの後腎の大網への移植を行った（図 8) 。図に示すように、 E12.5までの未熟な後腎糸且織を移植してもその後の成長は起こら ないが、 E13.5以降の後腎組織では腎臓が成長されることが示された。
[0048] 以上の事象を踏まえてリレー培養をさらに改良した。つまりラット胚 (E11.5)を、全胚 培養 (48時間)し、大網内で成長を継続できる段階まで 24時間器官培養し、これを大 網へ移植した (改良型リレー培養)。成長をさらに促すため片腎摘出を行った。 2週間 後成長した新生腎臓を図 9に示した。組織学的検討でも前述と同様に血行が開通し 、高度に分化した糸球体構造を維持して ヽることが確認された。
[0049] この血液が、移植したレシピエントの血管力も供給されていることを確認するため、 レシピエントの血管が LacZで青く染まる LacZラットの大網に腎臓原基を移植した。肉 眼的にも大網の血管が新たに形成された腎臓に入り込んでいることが示され（図 10 上図）、組織の LacZ染色により、この腎臓内の血管がレシピエント由来の青い細胞で 形成されて ヽることが示された（図 10下図)。電子顕微鏡にても糸球体血管内に赤血 球が確認され、さらに高度に分化した糸球体上皮細胞の足突起や内皮細胞、メサン ギゥム細胞の構築が確認された（図 11)。
[0050] これらの事象を基に、改良型リレー培養によりヒト間葉系幹細胞由来クローン腎臓 力 レシピエントの尿が作れるか確認した。ラッ HE11.5)胚に、レトロウイルスで LacZ 遺伝子導入、アデノウイルスを使って GDNF遺伝子導入を行った hMSCsを腎臓形成 部位に注入した。 24時間の全胚培養、そして 24時間の器官培養をした。この改良型 リレー培養 (2週)によって LacZラット大網内で生成した新生腎臓を図 12に示した。腎 臓内の血管系のみでなぐ尿細管も LacZ陽性となり、注入したヒト間葉系幹細胞由来 のネフロンとレシピエント由来の血管が統合したことが示された。
[0051] さらに大網内で 4週間成長させた新生腎臓の形態を図 13に示した。その像はこの 腎臓は尿管の開口部がないため作製された尿により水腎症が形成されたものと判断 された。そこでこの尿管に貯留した液体を回収し、尿である力検討したところ、その組 成は血清より有意に尿素窒素濃度、クレアチニン濃度が上昇しており、糸球体でろ過 された尿であることが示唆された。そこで腎臓が成長し、尿が形成される 2週から 4週 の間にクローン腎臓の尿管をレシピエントの尿管、膀胱、または直腸、皮膚に開口さ せる処置を行い、尿の出口を形成させることは有効である。図 14に、新規腎臓からの 尿様液を示した。
[0052] 実験例 2
次に、尿管芽由来の集合管及び尿管への細胞分ィ匕のための hMSCsの移植部位を 決定のための実験を以下のようにおこなった。
(材料と方法）
1) -ヮトリ胚
城山鶏園 (神奈川県津久井郡)力も入手したニヮトリ有精卵 (ヒペコ'ネラ種)を 38°C の孵卵器内で 34〜35.5時間発生させ、ハンバーガ一'ノ、ミルトンの stage9〜llまで成 長させた。
2)移植部位の決定
移植部位として、中間中胚葉を選択し、ここに標識物質を導入し、発生に伴う移動 を追跡した。 hMSCsの移植部位を決定のための標識物質として Dil (Molecular Probes )を使用した。この色素は親脂質性で細胞膜に取り込まれ、強い蛍光を発する性質を 持っため、標識した細胞の系譜を追跡するために有効である。 Dilを 0.5% (wt/vol)に なるように無水エタノールで溶解し、さらに 0.3Mショ糖で 10倍に希釈して使用した。 標識物質の導入は、卵殻に孔を開けて胚にアプローチし、実体顕微鏡下で各発生 段階における-ヮトリ胚の中間中胚葉の当該部位に、ごく少量の Dilをマイクロピぺッ トで周辺の組織を損傷しな 、ように注入した。 -ヮトリ胚に用いる生理食塩水である Pa nett-Compton塩類溶液を胚に適宜かけて乾燥を防止した。
孔をセロテープ (登録商標)で閉じ、十分な湿度を保った 38°Cの孵卵器内で発生を 継続させ、 Dilで標識された細胞の移動や尿管芽の形成過程を蛍光実体顕微鏡でタ ィムラブス観察を行った。
3)結果
ゥオルフ管原基とされている stagelO (孵卵約 35時間）における 10番目の体節に隣接 する中間中胚葉を Dilで標識した後、約 24時間発生を継続させた-ヮトリ胚を 4%パラ ホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作成して蛍光顕微鏡で観察したところ、ゥォ ルフ管の上皮細胞に Dilが取り込まれていることが確認できた。
Dilで標識する stageや部位を様々に変えてみたところ、 7番目から 12番目の体節形 成時期（およそ stage9〜l lに相当）において、形成されたば力りの 7番目力 12番目 の体節近傍にある中間中胚葉を標識した場合にも、 Dilがゥオルフ管に取り込まれる ことを確認できた。ゥオルフ管原基は、過去の報告より、時間的にも空間的にも広範 囲であることが明ら力となった。
ゥオルフ管原基に Dilが取り込まれた-ヮトリ胚を、さらに約 24時間発生を継続させる と、ホールマウントの蛍光実体顕微鏡像では、尿管芽に Dilが取り込まれているように 観察された（図 15)。図中、 Injは標識物質注入部位を、 WDはゥオルフ管を、 UBは尿 管芽を意味する。 この結果を受けて実験例 1と同様に、選定された時期 [stagelO (孵卵約 35時間)〕に 選定された部位（10番目の体節に隣接する中間中胚葉）に hMSCsを移植し、目的の 器官の分化を達成可能である。
産業上の利用可能性
本発明は、腎臓移植の新たな展開を可能とし、例えば腎臓疾患により透析を受け ているような患者は、自身の間葉系幹細胞を分取し、これを妊娠宿主動物の胎児又 は妊娠哺乳動物の宿主力 分離した胎児に移植し、臓器の一定成長後に自身に移 植すれば、本来の機能を担持した臓器の創生が達成できる。

Claims

請求の範囲
[1] 分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠 哺乳動物の宿主力 分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分ィ匕を導くことによ る哺乳動物移植用の臓器の調製方法であって、該間葉系幹細胞の胎児への移植部 位が中間中胚葉であり、移植時期は宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であることを 特徴とする移植用臓器の調製方法。
[2] 前記臓器が、腎臓である請求項 1に記載の方法。
[3] 前記哺乳動物由来の間葉系幹細胞を別途後腎形成間葉に移植し、メサンジゥム細 胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞に分化させる請求項 2に記載の方法。
[4] 哺乳動物由来の間葉系幹細胞の中間中胚葉への移植によって、尿管芽由来の集 合管及び尿管に分ィヒさせる請求項 1〜3の何れか一に記載の方法。
[5] 前記宿主が、ヒトの腎臓と近似した大きさをもつ哺乳動物である請求項 1〜4のいず れか一に記載の方法。
[6] 前記宿主が、ブタである請求項 5に記載の方法。
[7] 哺乳動物由来の間葉系幹細胞の胎児への移植が、経子宮アプローチによって該 細胞を宿主に移植する請求項 1〜6のいずれか一に記載の方法。
[8] 哺乳動物由来の間葉系幹細胞の胎児への移植が、胎児を子宮力 分離し、該細 胞を該胎児に移植し、その後、全胚培養を用いて in vitroでさらに発達させる請求項
1〜7のいずれか一に記載の方法。
[9] 哺乳動物由来の間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項 1〜8に記載の 方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010001951A1 (ja) * 2008-07-02 2010-01-07 株式会社大塚製薬工場 人工腎臓前駆体およびその製造方法
JP2012508691A (ja) * 2008-11-12 2012-04-12 テンジオン， インク． 単離した腎細胞およびその使用
US11066666B2 (en) 2010-05-12 2021-07-20 Inregen Bioactive renal cells

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3222298A4 (en) * 2014-12-19 2018-10-17 BIOS Co., Ltd Organ for transplantation and organ structure
CN107041807B (zh) * 2016-02-06 2022-08-02 复旦大学附属妇产科医院 一种磁性宫腔内装置
US11123372B2 (en) 2016-07-29 2021-09-21 Prokidney Bioactive renal cells for the treatment of chronic kidney disease
IL281561A (en) 2021-03-16 2022-10-01 Yeda Res & Dev Methods and devices for growing mouse embryos outside the uterus
CN114891737B (zh) * 2022-04-25 2023-05-12 中山大学 一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529509A (ja) * 1998-11-13 2002-09-10 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド ヒト間葉幹細胞の子宮内移植で胎児を処置し間葉幹細胞を移植し移植器官を調製する方法と調製された雑種器官
JP2006118799A (ja) 2004-10-21 2006-05-11 Denso Corp 冷凍サイクル
WO2006117889A1 (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Stemcell Institute Inc. 移植用臓器の調製方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529509A (ja) * 1998-11-13 2002-09-10 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド ヒト間葉幹細胞の子宮内移植で胎児を処置し間葉幹細胞を移植し移植器官を調製する方法と調製された雑種器官
JP2006118799A (ja) 2004-10-21 2006-05-11 Denso Corp 冷凍サイクル
WO2006117889A1 (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Stemcell Institute Inc. 移植用臓器の調製方法

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Organogenesis of the Kidney", 1987, CAMBRIDGE UNIV. PRESS
AM. J. KIDNEY DIS., vol. 31, 1998, pages 383 - 397
AM. J. PHYSIOL., vol. 279, 2000, pages F65 - F76
AM. J. PHYSIOL., vol. 280, 2001, pages RI865 - 1869
BIRTH DEFECTS RES., vol. 69, 2003, pages 250 - 256
BLOOD, vol. 98, 2001, pages 57 - 64
CYTOMETRY, vol. 12, 1991, pages 291 - 301
DEV. GROWTH DIFFER., vol. 37, 1995, pages 123 - 132
EUR. J. PHYSIOL, vol. 445, 2002, pages 321 - 330
EXP. NEPHROL., vol. 10, 2002, pages 102 - 113
J. AM. SOC. NEPHROL., vol. 11, 2001, pages 2330 - 2337
J. CLIN. INVEST., vol. 105, 2000, pages 868 - 873
J. NEUROL. SCI., vol. 65, 1984, pages 169 - 177
J. NEUROSCI. RES., vol. 60, 2000, pages 511 - 519
J. NEUROSCI. RES., vol. 69, 2002, pages 925 - 933
KIDNEY INT., vol. 64, 2003, pages 102 - 109
METHODS, vol. 24, 2001, pages 35 - 42
MORIGI M. ET AL.: "Mesenchymal Stem Cells Are Renotropic, Helping to Repair the Kidney and Improve Function in Acute Renal Failure", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, vol. 15, 2004, pages 1794 - 1804, XP002995076 *
NAT. MED., vol. 5, 1999, pages 434 - 438
NAT. MED., vol. 6, 2000, pages 278 - 282
NATURE, vol. 410, 2001, pages 701 - 705
NATURE, vol. 418, 2002, pages 41 - 49
PROC. NATL. ACAD.SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 7515 - 7520
SCIENCE, vol. 276, 1997, pages 71 - 74
TRANSPLANTATION, vol. 77, 2004, pages S41 - S43
YOKOO T. ET AL.: "Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 102, no. 9, 2005, pages 3296 - 3300, XP002995075 *
YOKOO T. ET AL.: "Xenobiotic kidney organogenesis from human mesenchymal stem cells using a growing rodent embryo", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, vol. 17, no. 4, 8 March 2006 (2006-03-08), pages 1026 - 1034, XP003018963 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010001951A1 (ja) * 2008-07-02 2010-01-07 株式会社大塚製薬工場 人工腎臓前駆体およびその製造方法
JP5388138B2 (ja) * 2008-07-02 2014-01-15 株式会社大塚製薬工場 人工腎臓前駆体およびその製造方法
US9758766B2 (en) 2008-07-02 2017-09-12 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Artificial kidney precursor and process for production thereof
JP2012508691A (ja) * 2008-11-12 2012-04-12 テンジオン， インク． 単離した腎細胞およびその使用
JP2016028578A (ja) * 2008-11-12 2016-03-03 テンジオン， インク． 単離した腎細胞およびその使用
US11066666B2 (en) 2010-05-12 2021-07-20 Inregen Bioactive renal cells

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