JP4705473B2 - 幹細胞の凍結保存法およびシステム - Google Patents
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Description
M.J.Evans & M.H.Kaufman:Nature,292,154,1981 G.R.Martin:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,7634,1981 Freshney R.I., Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,WIley−Liss,Inc.,pp.255−265、1994 Reubinoff BE, Para MF, Vajta G, Trounson AO.,Hum Reprod. 2001 Oct;16(10):2187−94 幹細胞・クローン 研究プロトコール 中辻編、羊土社(2001)
A)ジメチルスルホキシド(DMSO);
B)プロピレングリコール;および
C)培地(culture medium)、
を含む、媒体を提供する。
A)DMSO;
B)エチレングリコール;および
C)培地(culture medium)、
を含み、
ここで、上記DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、媒体を提供する。
A)a)DMSO;
b)プロピレングリコール;および
c)培地、
を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結させる工程、
を包含する、方法を提供する。
A)a)DMSO;
b)エチレングリコール;および
c)培地(culture medium)、
を含み、
ここで、上記DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、
媒体中で、幹細胞を凍結させる工程、
を包含する、方法を提供する。
A)a)DMSO;
b)プロピレングリコール;および
c)培地、
を含む、媒体;
B)急速凍結する手段、
を備える、システムを提供する。
A)a)DMSO;
b)エチレングリコール;および
c)培地(culture medium)、
を含み、
ここで、上記DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、
媒体;
B)凍結する手段、
を備える、システムを提供する。
a)DMSO;
b)プロピレングリコール;および
c)培地、
を含む、媒体の、幹細胞を急速凍結保存するための、使用を提供する。
a)DMSO;
b)エチレングリコール;および
c)培地(culture medium)、
を含み、
ここで、上記DMSOおよび上記エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、
媒体の、幹細胞を凍結保存するための、使用を提供する。
凍結保存されたヒト受精卵または胚盤胞期までの初期胚を順次解凍して培養を行う。個々の凍結胚容器からは提供者を同定できるものは除去されているため、各回の解凍・培養実験に使用されたヒト受精胚の出自は同定され得ない。しかしながら、各々のヒト受精胚の取扱がおろそかにならないように、凍結胚として受け入れた時点からひとつの凍結容器内に納められたヒト受精胚を樹立研究の過程で個々の存在として尊重し、どのような経過をたどったかを記録する。
胚盤胞期まで到達した胚(受精後の発生期間が14日以内のもの)について、抗ヒト血清による免疫手術などの方法によって内部細胞塊を分離したのち、フィーダー細胞層の上で培養する。フィーダー細胞としては、本実施例において例示されるフィーダー細胞を用いることができる。内部細胞塊を採取した後の残部についても、礼節をもって取扱う。フィーダー細胞の上で増殖した細胞を適時に解離して分割継代し、幹細胞と思われる細胞コロニーの選別培養などを行ないながら、ES 細胞と思われる細胞株を樹立する。この間に、培養維持方法や細胞凍結保存方法などの改良を目指した研究を行う。
ES 細胞であることを確認するために、幹細胞マーカー(アルカリ性フォスファターゼ活性や特異的抗原)の検出を行なう。また核型解析を行なって染色体数や形態が正常かどうかを検定する。
培養下での分化能を検定するために、培養条件の変更や細胞凝集塊作成による細胞分化の誘導と各種機能細胞への分化能の解析を行なう。また免疫不全マウスなどへの移植を行なってテラトーマ形成による組織分化能の解析を行なう。
ヒト凍結胚の一時的保存は専用の液体窒素タンクを用いることによって、樹立計画に用いる以外の細胞や動物胚などに由来するウイルスと微生物による汚染を防ぐ。また細胞培養実験には専用の炭酸ガスインキュベーターを用いることによって、他種類の細胞との混合を防ぎ、ウイルスや微生物による汚染の可能性を小さくする。細胞培養に用いた培養液や培養器具は、実験室内で加圧高温滅菌処理を行なったのちに廃棄する。ヒト受精胚の保存および細胞株樹立を行なう実験室への入室者の管理を厳重に行う。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed. (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatES and Wiley−Interscience; Ausubel, F. M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。なお、本発明の好ましい実施形態において使用される場合、特に言及しない限り、%は重量%を示す。
1つの局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体(medium)であって、A)DMSO;B)プロピレングリコール;およびC)培地(culture medium)、を含む、媒体(本明細書において「DA媒体」とも称する)を提供する。ここで、DMSOは、細胞培養および/または保存に適したものであれば、どのような等級または由来のものであっても使用することができる。プロピレングリコールもまた、細胞培養および/または保存に適したものであれば、どのような等級または由来のものであっても使用することができる。このようなものは、各々の成分が単独で市販されたものを使用することができる。培地としては、細胞培養および/または保存に適したものであれば、どのような等級または由来のものであっても使用することができる。そのような培地としては、例えば、DMEM培地、F12培地、CMK培地(実施例1において説明される)、DMEM/F12(1:1)培地などまたはそれらの混合物を含むものを使用することができるがそれらに限定されない。好ましくは、このような培地としては、CMK培地が使用されるがそれらに限定されず、保存が企図される幹細胞に応じてその培地は変更して使用することができる。このような培地には、ウシ胎仔血清(FBS)、KSRなどの補充物が補充されていてもよい。好ましくは、DMEM/F12(1:1)培地+KSRが使用され、より好ましくは、DMEM/F12(1:1)培地+20%KSRが使用される。
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための媒体(medium)であって、A)DMSO;B)エチレングリコール;およびC)培地(culture medium)、を含み、ここで、該DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、媒体(本明細書において「DE媒体」ともいう)を提供する。この媒体は、スクロースを含む場合にDES媒体とも呼ばれ、ガラス化凍結法で頻繁に用いられているが、本発明では、従来よりも薄いDMSOおよび/またはエチレングリコールを用いることによって、予想外に高い効率で幹細胞を保存することができたということが初めて見出された。特に、DMSOおよびエチレングリコールは、約15%ずつ含まれる場合に、従来のDES媒体(DMSO20%、エチレングリコール15%、スクロース0.5M)よりも顕著に高い保存効率(例えば、0.75×DESの場合約5倍)を達成することができたことは驚くべき発見である。このように、本発明の好ましい媒体では、糖を含むことが有利である。糖を含むことによって、凍結保存効率が上昇することが一般的に知られているからである。この糖としては、例えば、スクロースを含ませることができる。
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、A)a)DMSO;b)プロピレングリコール;およびc)培地、を含む、媒体中で、幹細胞を急速凍結させる工程、を包含する、方法を提供する。ここで、この媒体において含まれるDMSO、プロピレングリコール、培地およびその他の成分についての詳細な説明は、上述のDA媒体の節において詳述されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。ここで、急速凍結もまた、上述のDA媒体の節において説明されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するための方法であって、A)a)DMSO;b)エチレングリコール;およびc)培地(culture medium)、を含み、ここで、該DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、媒体中で、幹細胞を凍結させる工程、を包含する、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、A)a)DMSO;b)プロピレングリコール;およびc)培地、を含む、媒体;B)急速凍結する手段、を備える、システムを提供する。ここで、この媒体において含まれるDMSO、プロピレングリコール、培地およびその他の成分についての詳細な説明は、上述のDA媒体の節において詳述されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。ここで、急速凍結もまた、上述のDA媒体の節において説明されており、本発明の細胞保存法においてもまた、そこで説明される任意の形態を採用することができることが理解される。従って、急速凍結する手段としては、任意の凍結手段(例えば、液体窒素)を用いることができる。本発明の急速凍結手段は、上記「DA媒体を用いた細胞保存法」の節において例示されている任意のものを使用することができる。
別の局面において、本発明は、幹細胞を保存するためのシステムであって、A)a)DMSO;b)エチレングリコール;およびc)培地(culture medium)、
を含み、ここで、該DMSOおよび該エチレングリコールの少なくともいずれか一方は、20重量%未満である、媒体;B)凍結する手段、を備える、システムを提供する。ここで、使用されるDE媒体中のDMSO、エチレングリコールなどは、上述のDE媒体の節において説明される任意の形態を用いることができる。凍結手段は、当該分野において使用される任意の手段を用いることができる。そのような手段としては、例えば、液体窒素、低温フリーザー、冷凍庫、塩を付加した氷、ドライアイスなどが挙げられるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、a)DMSO;b)プロピレングリコール;およびc)培地、を含む、媒体の、幹細胞を急速凍結保存するための、使用を提供する。ここで、DMSO、プロピレングリコール、培地および追加の成分としては、上述のDA媒体の節において説明される任意の形態を用いることができる。凍結保存についてもまた、上述のDA媒体の節において説明される任意の形態を用いることができ、当業者は上述の開示および下記実施例の記載から適宜任意の適切な形態で実施することができることが理解される。
ヒトES細胞の調製は、提供者の合意を得た上で、情報が完全に守られる形で行う。具体的には、本明細書において別の場所において記載されるように、慎重に、かつ、認証された機関で行う。以下に示す実験は京都大学再生医科学研究所において、行われる。
培地組成:(本明細書においてCMK培地ともいう)
DMEM/F12 (Sigma D−6421) 80ml
非必須アミノ酸(Gibco) 0.8ml
200mM L−グルタミン 1ml
KSR(Gibco) 20ml
2−メルカプトエタノール 0.8μl
ヒト白血病阻害因子(huLIF)(10μg/ml) 100μl(10ng/ml)
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(1mg/ml) 0.4μl(4ng/ml)。
0.25% トリプシン(リン酸緩衝化生理食塩水(PBS))
1mM CaCl2
20%KSR。
フィーダーをつくる培養ディッシュは予めゼラチンコートしておく。0.1%ゼラチン溶液(swine skin、Type A:Sigma社製)で覆い、37℃で1 時間以上インキュベートする。培養ディッシュのゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経てばフィーダー細胞として使用可能である。
次に、樹立した細胞の未分化状態を、特異的マーカーによる染色により調べた。ES細胞を、4% PFAで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法(Willingham,M.C.et.al., 1985.An Atlas of Immunofluorescence in Cultured Cell, Academic Press, Orlando, FL, pp.1−13.) に従い免疫染色を行った。ブロッキングは0.1% Triton X/PBS/2%スキムミルクを用い室温で一時間、洗いは0.1% TritonX/PBSを用い室温で5分を4回行った。一次抗体はSSEA−4、TRA−1−60のモノクローナル抗体をそれぞれ200μg/ml(CLONTECH)を1/100希釈したものを、二次抗体はFITC標識goat 抗−mouse IgG(H+L)(ZYMED LABORATORIES,INC)を1/200希釈したものを使用した。二次抗体の反応後はローダミンファロイディン(rhodamine phalloidin)(Molecular Probe)、DAPI(SIGMA)の順に染色を行いシグナルを検出した。
カニクイサルからのES細胞の調製は、実施例1において記載されるヒトのES細胞の調製に準じて行った。カニクイサルは、(株)ケアリーから入手し、施設内では、京都大学において規定される基準に従って動物愛護精神にのっとって維持した。
(1)10% DMSO/CMK培地
9 ml のES細胞培養培地に、1mlのDMSOを加え、−30℃で保存。4℃で使用した。
(2)DES(20%DMSO,20%エチレングリコール,0.5Mスクロース/CMK培地)
スクロースを1.026g量り取り、DMSOとエチレングリコールとをそれぞれ2ml加え、ES細胞培養培地で10mlにメスアップした。−30℃で保存した。4℃で使用した。
(3)DAP(2M DMSO,1Mアセトアミド,3Mプロピレングリコール/CMK medium)
アセトアミドを0.65g量り取り、1.42mlのDMSOと2.24mlのプロピレングリコールを加え、ES細胞培養培地で10mlにメスアップした。−30℃で保存した。4℃で使用した。
実施例2で調製したカニクイザルES細胞を10 cm ディッシュで培養し、それぞれ3分の1量ずつ、緩慢冷却法、ガラス化法、および簡易ガラス化法の3法で凍結保存を行った。−150℃で数日間保存した後、それぞれの方法により、ES細胞を解凍し、その10分の1量および、2分の1量をフィーダー細胞でコートした3.5cmディッシュに解凍した。各凍結保存法の効率については、解凍後4日目のES細胞のコロニー数および、ES細胞数をカウントして求めた。
従来技術として知られる緩慢冷却法は、Geron社から販売されるキットに従って、以下のようにして行った。その概略は非特許文献3に記載されるとおりである。
1)あらかじめ、15 ml遠心チューブに培地を10 ml加えたものを準備しておいた。
ガラス化法もまた、従来技術に基づいて行ったが、使用した管はストロー状ではなく、先が閉じた封入形状のものを用いた。そのほかは、非特許文献4に基づいて行った。
細胞を回収し、遠心分離した。
1)あらかじめ、15ml遠心チューブに培地を10ml加えたものと、37℃に温めた培地を準備しておいた。
プラスチック製ストロー(250μl、IMV,フランス)をホットプレート上でやわらかくして直径がほぼ半分になるまで引き伸ばす。細くした部分でストローを切断する。加工したストローを放射線照射により滅菌する。
解凍は、ストローを液体窒素から取り出した3秒後にストローの細いほうの先端を0.2Mスクロース/DMEM+20%FBSに浸し、ストロー内の液が解けたら反対の端を封じる。これにより、ストロー内の気体部分の温度上昇に伴いストロー内の液は、培地中に移動する。1分間インキュベートし、0.1Mスクロース/DMEM+20%FBSに細胞塊を移し、5分間インキュベートする。DMEM+20%FBSで細胞塊を5分間洗浄し、これを2回行い、フィーダー細胞の上に移し培養する。
本発明の簡易ガラス化法を説明する。
細胞を回収し、遠心した。
簡易ガラス化法で凍結して保存したものを利用する場合、ガラス化法(B1)と同様の方法で解凍することができる。
1)解凍後4日目に、10分の1量まいたディッシュのES細胞のコロニー数を、倒立顕微鏡下でカウントした。
1)ES細胞を0.25%トリプシンで処理した後、ピペッティングし、細胞を一つ一つバラバラにした。
次に、DES媒体(DMSO20%、エチレングリコール20%、スクロース0.5Mを×1溶液とする)の濃度を振って、その効果を確認した。ここでは、0.5×DES,0.75×DES、1.0×DES、1.25×DESおよび1.5×DESの5種類の媒体を調製して、実施例4に記載されるようにガラス化凍結法を行った。その結果を図2に示す。図2に示すように、1×DESに比べて、0.75×DESでの凍結効率が格段に上がっていたことが分かった。これは、従来使用されているDESが、ガラス化凍結法においてもより薄めの物を用いることが良いことを実証する。このような効果は従来知られておらず、従って、本発明において初めて見出された効果を示す。
次に、DA媒体において、DMSOとプロピレングリコールの混合比が凍結保存効率に与える影響を考慮した。
DMSOおよびプロピレングリコールがそれぞれ、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%単独で存在する保存媒体を用いて、その凍結保存効率における効果を確認した。実施例4に記載の通り、簡易ガラス化法を行った。その結果を図4および図5に示す。結果から明らかなように、DMSOは単独では20−40%、プロピレングリコールは40−60%で存在することが好ましいことが明らかになった。しかし、どの存在比でも、DAP媒体には効率は及ばなかった。
実施例7に記載される実験を、DMSOの濃度(0.5M〜5M)、プロピレングリコール(0.5M〜8M)、アセトアミド(0.5M〜3M)の範囲内で0.5Mごとに行う。その結果、DMSOの濃度は、2Mを頂点に1M〜4Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著であり、プロピレングリコールは、1.5M〜6Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著であり、アセトアミドは、0.5M〜2Mの範囲で凍結保存改善効果が顕著であることが確認される。なお、アセトアミドについては、0Mであっても、他の二成分によって凍結保存改善効果が見られることから、必須ではないことが分かる。
本発明の上記実施例4において保存し解凍したES細胞を、3回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除く。KSR(Knockout Serum Replacement;GIBCO/Invitrogen Cat.No.10828−028)を含むES細胞培地を用いて、PA6フィーダー細胞上で未分化細胞を8−11日間培養する(Kawasaki et al.,2000,Neuron 28;31−40、Tada et al.,2003;Dev.Dyn.,227;504−510.参照)。これにより、神経細胞に分化させる。
次に、本発明の上記実施例4において保存し解凍したES細胞のテラトーマ形成能を確認した。SCIDマウス(日本クレア、東京)の皮下および腹腔内に本発明のES細胞を約107個移植し、1〜3ヶ月様子を見る。
次に、本発明の上記実施例4において保存し解凍したES細胞の造血系細胞への分化を観察する。分化誘導培養液として、αMEM(Gibco BRL、Cat#11900−016)に10%ウシ胎仔血清を加え、5×10−5Mメルカプトエタノールを加えた培養液を使用した。
上述の実施例で凍結保存した後に解凍したES細胞を、KSRを含む基本培地(例えば、DMEM)中で浮遊培養することによって胚様体を形成させる。胚様体形成後、4〜7日経過後に胚様体を集めゼラチンコート下培養ディッシュに播種する。KSRを含む基本培地中で1〜3週間培養することによって心筋細胞が分化する。
次に、マウスES細胞を用いて、本発明の保存媒体がもたらす凍結保存効果を実証する。ES細胞は、非特許文献5に記載されるように調製することができる。具体的には、実施例1に記載される手順に準じて行う。
組織幹細胞(神経幹細胞、間葉系幹細胞など)を含む組織を取り出して単離して、上記実施例のように凍結保存および解凍することによって、組織幹細胞でも安定して凍結保存することができる細胞株が樹立される。
次に、カニクイサルから、ES細胞を採取し、実施例5と同様の保存を行った後、神経細胞に分化させる。神経への分化は、適切な分化因子(神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン(neurotrophin)、IL−6、TGF−β、TNF)を含む培地中で培養することによって行う。この神経細胞の移植物を神経疾患を有するカニクイサル被検体に移植すると、移植物が機能できることがわかる。
実施例4に記載の方法を改変して、ヒトのES細胞の保存効率が上がることを実証した。以下に詳細なプロトコールを示す。
方法
1)前日までに、4日以内に作成したフィーダー細胞を準備する。
2)(以下の試薬容量は、60mm細胞培養ディッシュ1枚の場合)
ヒトES細胞用培地を室温にもどす。ヒトES細胞用解離液を解凍し、室温にもどす。
3)細胞解離液0.5mlをディッシュに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした後、37℃、CO2インキュベーターで5分間加温する。
4)細胞の状態を顕微鏡で観察する。半分以上のコロニーが周囲から小さくまとまり、フィーダー細胞からはがれかけている状態が望ましい。ここで、5分以上放置してもコロニーがこのような状態にならない場合は、原因として解離溶液が充分に室温にもどっていない、あるいは失活していることが考えられる。
5)ヒトES細胞用培地を2ml加え、細胞をディッシュからはがす。数回ピペッティングを行い、コロニーを適切なサイズに砕く。ギルソンP−1000を使用するとよい。ES細胞コロニー1つあたり約100細胞程度になるようにする。ここで、コロニーが小さくなりすぎると再接着・増殖の効率が極端に低下する原因になるため、顕微鏡で確認しながら、コロニーを解離する。
6)約170×g(1,000rpm)、5分間遠心。
7)上澄みをできるだけ除く。
8)フィーダー細胞のディッシュから培地を除き、ヒトES細胞用培地を4 mlずつ加える。
9)コニカルチューブに2mlの培地を加え、軽く懸濁する。ここで、既にES細胞は100細胞前後の適切なサイズのコロニーなっているため、激しいピペッティングを避ける。もし大きなコロニーがみえるようなら、細胞懸濁液を吸い上げたピペットの先端をコニカルチューブの底に軽く押しつけ、穏やかに細胞懸濁液を排出して細胞をほぐす。
10)フィーダー細胞ディッシュ1枚あたり1mlのES細胞懸濁液を加える。最終濃度5ng/mlで繊維芽増殖因子(bFGF;科研製薬)を加える
11)細胞の状態を顕微鏡で観察する。
12)ES細胞のコロニーがディッシュ全体に行き渡るように、ディッシュを充分に揺する。37℃、CO2インキュベーターで一晩培養する。
13)翌日、顕微鏡で細胞の状態を観察する。培地交換。
14)以後毎日培地交換する。3〜4日でコンフルエントになる。
材料
凍結保存溶液 DAP213
2 M DMSO,1Mアセトアミド,3Mプロピレングリコール/ヒトES細胞用培地
・0.59gアセトアミドを6ml程度のES培地に溶解。0.22μmフィルターで濾過滅菌。15mlの遠心分離チューブへ入れる。
・DMSO 1.42ml、プロピレングリコール2.2mlを添加する。
・10mlに培地でメスアップ(チューブの目盛りでよい)。
・よく混ぜて、1mlずつクライオチューブに分注し、−80℃で保存する。数回の融解・凍結は可能である。
1)コンフルエントの状態のヒトES細胞を60mm細胞培養ディッシュ1枚準備する。
2)ヒトES細胞用培地を室温にもどす。ヒトES細胞用解離液を解凍し、室温にもどす。
3)液体窒素と氷を準備する。凍結保存用チューブ(Nulgene #5000−1012)に「細胞名」「日付」「継代数」等を記入し、氷上で冷やしておく。
4)凍結保存液DAP213を解凍、氷上で冷やしておく。
5)ヒトES細胞ディッシュの培地を除き、適量のPBS(−)を加え、細胞を洗う。
6)ヒトES細胞用トリプシン溶液1mlをディッシュに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにする。
7)細胞の状態を顕微鏡で観察する。半分以上のコロニーが周囲から小さくまとまり、フィーダー細胞からはがれかけている状態が望ましい。
8)ヒトES細胞用培地を5ml加え、細胞全体をディッシュからはがす。凍結、融解時に自然にコロニーがほぐれるため、この時点でほぐす必要はない。
9)細胞懸濁液を15 mlコニカルチューブに回収する。新しいヒトES細胞用培地5mlをディッシュに加え、残りの細胞も回収する。
10)170×g(1,000rpm)、4℃で5分間遠心分離する。ここで、サンプル数が多い場合、遠心後、氷上においておく。
11)上澄みをできるだけ除く。
12)DAPを200μl加え、穏やかに懸濁する。予め準備した凍結保存用チューブに移す。ピンセットで凍結チューブをつかみ、液体窒素につける。ここで、DAPは細胞毒性が強いため出来る限りすばやく作業すること。目安として15秒以内。また、加えるDAPは、凍結する細胞数に関係なく200μlで良い。
13)液体窒素中で、30秒から1分間凍結する。ここで、内部まで完全に凍らせる。
14)液体窒素保存容器に移す。
方法
1)前日までに、ヒトES細胞の凍結チューブ1本あたり60mm細胞培養ディッシュ1枚分のフィーダー細胞を用意する。
2)ヒトES細胞用培地10mlを15mlコニカルチューブに移し、37℃ウォーターバスで温めておく。
3)凍結保存していたヒトES細胞凍結チューブに、あらかじめ37℃に温めたヒトES細胞用培地を1ml加え、ピペッティングを行い、急速解凍する。ここで、解凍および希釈はすばやく行う。また、ウォーターバスでの解凍は、融解後の細胞生存率が極端に低下する原因になる。
4)細胞懸濁液を15mlコニカルチューブへ移す。
5)約170×g(1,000rpm)、5分間遠心。
6)上清を吸引し、ヒトES細胞用培地を10ml加える。ピペッティングを穏やかに行い、ES細胞のコロニーが小さくなりすぎない程度に懸濁する。大きなコロニーは、細胞懸濁液を吸い上げたピペットの先端をコニカルチューブの底に軽く押しつけ、穏やかに細胞懸濁液を排出してほぐす。
7)フィーダー細胞の培地を除く。
8)ES細胞懸濁液全量を60mmフィーダー細胞ディッシュに移す。
9)顕微鏡で細胞の状態を確認する。
10)37℃、CO2インキュベーターで一晩培養する。
11)翌日、顕微鏡で細胞の状態を確認する。通常解凍した翌日は、多数の細胞が死んでいるのが確認される。毎日1回培地交換を継続する。通常、3日程度で継代可能になる。
次に、ヒトのES細胞を調製し、実施例15に記載されるように保存した後、皮膚細胞に分化させる。皮膚への分化は、適切な分化因子(皮膚(ケラチノサイト)の場合は、TGF−β、FGF−7(KGF:ケラチノサイト増殖因子=keratinocyte growth factor)、EGF)を含む培地中で必要に応じて適切なフィーダー細胞を用いて培養することによって達成される。この皮膚細胞の移植物を、皮膚疾患を有するヒト被検体に移植すると、移植物が機能し、皮膚の機能が回復することがわかる。
Claims (21)
- 多能性幹細胞を凍結保存するための媒体(medium)であって、
A)ジメチルスルホキシド(DMSO)を1M〜4M;
B)プロピレングリコールを1.5M〜6M;
C)約0.5M〜2Mのアセトアミド;及び
D)保存が企図される前記多能性幹細胞に応じた培地(culture medium)、
を含む、媒体。 - 前記多能性幹細胞は、卵細胞及び胚を除く
ことを特徴とする請求項1に記載の媒体。 - 前記多能性幹細胞は、コロニーのまま剥離された
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の媒体。 - 前記凍結保存は、簡易ガラス化法で行われる
ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載の媒体。 - 前記アセトアミドの濃度は、0.5M〜1.5Mである
ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載の媒体。 - 前記DMSOと前記プロピレングリコールとは、約1:2〜約2:1のモル比率で存在する、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の媒体。
- 前記DMSOと前記プロピレングリコールとは、約3:2のモル比率で存在する、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の媒体。
- 前記DMSOは、約2M存在する、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の媒体。
- 前記プロピレングリコールは、約3M存在する、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の媒体。
- さらに、糖を含む、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の媒体。
- 前記培地は、ダルベッコ改変Eagle培地(DMEM培地)およびF12培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の媒体。
- 前記培地は、DMEM/F12(1:1)培地+KSRである、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の媒体。
- 多能性幹細胞を凍結保存するための方法であって、
a)ジメチルスルホキシド(DMSO)を1M〜4M;
b)プロピレングリコールを1.5M〜6M;
c)約0.5M〜2Mのアセトアミド;及び
d)保存が企図される前記多能性幹細胞に応じた培地(culture medium)、
を含む、媒体中で、前記多能性幹細胞を急速凍結させる工程、
を包含する、方法。 - 前記急速凍結は、封入管を用いて行われる、請求項13に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、コロニーのまま剥離されたものである、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞と、前記媒体とは、約1×104/100μl〜約5×107/100μlの比率で存在する、請求項13乃至15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記急速凍結は、約30℃/分以上の速度で凍結される、請求項13乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記急速凍結は、液体窒素中で行われる、請求項13乃至17のいずれか1項に記載の方法。
- 多能性幹細胞を解凍するための方法であって、
a)DMSOを1M〜4M;
b)プロピレングリコールを1.5M〜6M;
c)約0.5M〜2Mのアセトアミド;及び
d)保存が企図される前記多能性幹細胞に応じた培地(culture medium)、
を含む、媒体中で、凍結させた前記多能性幹細胞を、
急速解凍する工程、
を包含する、方法。 - 前記急速解凍は、ピペッティングによる、請求項19に記載の方法。
- 前記急速解凍は、約50℃/分以上の速度で解凍される、請求項19又は20に記載の方法。
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