JP2000217571A - インビトロで誘導した移植用臓器 - Google Patents
インビトロで誘導した移植用臓器Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 インビトロで誘導した臓器が実際に生体内で
も機能するかどうかを評価するために、発生工学あるい
は臓器工学を利用し、臓器のインビトロでの誘導と生体
移植の手法を確立し、より高等な動物の先天的腎疾患等
の移植治療への道を拓く移植用臓器を提供すること。 【解決手段】 アクチビン等のＴＧＦ−βファミリーの
存在下、インビトロで誘導した腎臓、心臓、膵臓、肝
臓、腸管等の臓器を、同種の被臓器移植動物の発生ステ
ージに応じた所定の発生ステージまで該臓器を培養し、
生体内に移植した際に生体内で機能することができる移
植用臓器を調製する。発生ステージは、インビトロで誘
導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮ
Ａを分子マーカーとして検定することができる。
も機能するかどうかを評価するために、発生工学あるい
は臓器工学を利用し、臓器のインビトロでの誘導と生体
移植の手法を確立し、より高等な動物の先天的腎疾患等
の移植治療への道を拓く移植用臓器を提供すること。 【解決手段】 アクチビン等のＴＧＦ−βファミリーの
存在下、インビトロで誘導した腎臓、心臓、膵臓、肝
臓、腸管等の臓器を、同種の被臓器移植動物の発生ステ
ージに応じた所定の発生ステージまで該臓器を培養し、
生体内に移植した際に生体内で機能することができる移
植用臓器を調製する。発生ステージは、インビトロで誘
導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮ
Ａを分子マーカーとして検定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発生工学又は臓器
工学に関し、より詳しくは、生体内に移植した際に生体
内で機能することができる、インビトロで誘導した移植
用の腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管、脊索、骨格筋、白
血球、赤血球、リンパ球等の臓器及びその調製方法や評
価方法に関する。
工学に関し、より詳しくは、生体内に移植した際に生体
内で機能することができる、インビトロで誘導した移植
用の腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管、脊索、骨格筋、白
血球、赤血球、リンパ球等の臓器及びその調製方法や評
価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】すべての多細胞動物の発生は受精にはじ
まり、細胞分裂（卵割）と細胞分化を経て、多くの組織
とバランスのとれた体制をもつ個体として完成される
が、このような分化のプロセスはきわめて複雑であり、
誘導現象と呼ばれる重要な細胞間の相互作用が多段階に
わたって行われていると考えられ、そして、もっとも重
要なのは「形作りを支配する分子」の解明といわれてお
り、またこのような研究の材料として、主に両生類胚が
よく用いられるが、体づくりの基本的な法則はすべての
脊椎動物に共通であり、相同な遺伝子は異なった生物種
においてもきわめて類似した機能をもつことが知られて
いる。
まり、細胞分裂（卵割）と細胞分化を経て、多くの組織
とバランスのとれた体制をもつ個体として完成される
が、このような分化のプロセスはきわめて複雑であり、
誘導現象と呼ばれる重要な細胞間の相互作用が多段階に
わたって行われていると考えられ、そして、もっとも重
要なのは「形作りを支配する分子」の解明といわれてお
り、またこのような研究の材料として、主に両生類胚が
よく用いられるが、体づくりの基本的な法則はすべての
脊椎動物に共通であり、相同な遺伝子は異なった生物種
においてもきわめて類似した機能をもつことが知られて
いる。
【０００３】従来より、両生類の胚は実験発生学におい
てきわめて重要な材料とされ、多くの研究がなされてき
ている。その理由は、体外で受精と発生をおこない、卵
が大きいために胚手術が可能で、経時的変化を容易に観
察できることにある。両生類の原腸胚の原口上唇部は特
殊な領域であり、他の胚の腹側にこれを移植すると頭部
もしくは胴尾部を含む二次胚が誘導され、このことか
ら、原口上唇部は胚の体制を決定し形態形成の中心とし
て働く領域として形成体(organizer)と名付けられてお
り、形成体は原腸陥入のあいだに予定外胚葉へと働きか
けて中枢神経を誘導し、それ自身は背側の中胚葉に分化
することはよく知られている。
てきわめて重要な材料とされ、多くの研究がなされてき
ている。その理由は、体外で受精と発生をおこない、卵
が大きいために胚手術が可能で、経時的変化を容易に観
察できることにある。両生類の原腸胚の原口上唇部は特
殊な領域であり、他の胚の腹側にこれを移植すると頭部
もしくは胴尾部を含む二次胚が誘導され、このことか
ら、原口上唇部は胚の体制を決定し形態形成の中心とし
て働く領域として形成体(organizer)と名付けられてお
り、形成体は原腸陥入のあいだに予定外胚葉へと働きか
けて中枢神経を誘導し、それ自身は背側の中胚葉に分化
することはよく知られている。
【０００４】また、実験動物として用いられるアフリカ
ツメガエルの未受精卵は、動物極と植物極を結ぶ上下の
軸をあらかじめ有するものの、背腹軸と左右軸は決定さ
れておらず、受精すると、卵の表層と内側の細胞質の間
に回転がおこり、その結果精子の侵入した側が将来の腹
側、反対側が背側になることや、精子は必ず動物半球に
侵入し、侵入点の１８０度反対側が将来の原口となるこ
とや、表層の回転は、受精卵の細胞質に含まれる体軸決
定因子（デターミナント）の分布に偏りを生じさせ、こ
のために背腹軸が成立することが知られている。図１
に、アフリカツメガエルの発生過程を模式的に示す。
ツメガエルの未受精卵は、動物極と植物極を結ぶ上下の
軸をあらかじめ有するものの、背腹軸と左右軸は決定さ
れておらず、受精すると、卵の表層と内側の細胞質の間
に回転がおこり、その結果精子の侵入した側が将来の腹
側、反対側が背側になることや、精子は必ず動物半球に
侵入し、侵入点の１８０度反対側が将来の原口となるこ
とや、表層の回転は、受精卵の細胞質に含まれる体軸決
定因子（デターミナント）の分布に偏りを生じさせ、こ
のために背腹軸が成立することが知られている。図１
に、アフリカツメガエルの発生過程を模式的に示す。
【０００５】図１からもわかるように、中胚葉誘導は、
卵割が進行して胚が桑実胚期に達するころに開始される
最初の誘導であり、これは植物半球の割球が動物半球の
割球に働きかけて帯域に中胚葉を誘導する現象として実
験的にその存在が証明されている。このとき植物半球割
球は背腹軸に沿った誘導の勾配をもち、腹側の割球は腹
側中胚葉を、背側の割球は形成体を含む背側中胚葉を誘
導する、すなわち、中胚葉誘導は中胚葉の部域化を行
い、形成体の領域を特定することが知られている。そし
て、この中胚葉誘導は両生類に特有な現象ではなく、す
べての脊椎動物の初期胚で中胚葉と形成体の形成にかか
わっていると考えられている。
卵割が進行して胚が桑実胚期に達するころに開始される
最初の誘導であり、これは植物半球の割球が動物半球の
割球に働きかけて帯域に中胚葉を誘導する現象として実
験的にその存在が証明されている。このとき植物半球割
球は背腹軸に沿った誘導の勾配をもち、腹側の割球は腹
側中胚葉を、背側の割球は形成体を含む背側中胚葉を誘
導する、すなわち、中胚葉誘導は中胚葉の部域化を行
い、形成体の領域を特定することが知られている。そし
て、この中胚葉誘導は両生類に特有な現象ではなく、す
べての脊椎動物の初期胚で中胚葉と形成体の形成にかか
わっていると考えられている。
【０００６】また、誘導現象においては何らかの化学物
質が細胞間で輸送されていると考えられているが、中胚
葉誘導では植物半球の細胞から動物半球側に分泌される
ものが中胚葉誘導因子と呼ばれ、この胚に存在する中胚
葉誘導因子の固定は、発生学研究のもっとも重要なテー
マの一つであり、両生類の胚では、古くからさまざまな
胚手術が行われており、誘導因子のアッセイ系も確立さ
れている。例えば、中胚葉誘導因子の活性を直接的に調
べる方法としてアニマルキャップアッセイが、主に候補
となる因子やレセプター分子などのｍＲＮＡを２細胞期
から８細胞期の受精卵に注入して正常発生への影響を調
べる方法としてインジェクションアッセイが、それぞれ
知られている。そして本発明者らは、かかるアニマルキ
ャップアッセイを用いて、ＴＧＦ−βファミリーの細胞
成長因子アクチビンに中胚葉誘導活性があることを最初
に報告した（Roux' Arch. Dev. Biol. 198: 330-335, 1
990）。
質が細胞間で輸送されていると考えられているが、中胚
葉誘導では植物半球の細胞から動物半球側に分泌される
ものが中胚葉誘導因子と呼ばれ、この胚に存在する中胚
葉誘導因子の固定は、発生学研究のもっとも重要なテー
マの一つであり、両生類の胚では、古くからさまざまな
胚手術が行われており、誘導因子のアッセイ系も確立さ
れている。例えば、中胚葉誘導因子の活性を直接的に調
べる方法としてアニマルキャップアッセイが、主に候補
となる因子やレセプター分子などのｍＲＮＡを２細胞期
から８細胞期の受精卵に注入して正常発生への影響を調
べる方法としてインジェクションアッセイが、それぞれ
知られている。そして本発明者らは、かかるアニマルキ
ャップアッセイを用いて、ＴＧＦ−βファミリーの細胞
成長因子アクチビンに中胚葉誘導活性があることを最初
に報告した（Roux' Arch. Dev. Biol. 198: 330-335, 1
990）。
【０００７】一方、脊椎動物の発生過程では、前腎、中
腎、後腎という３つの腎臓が順に作られ、それらが排出
器官として機能し、これらの腎臓は中間中胚葉に由来
し、時間的にも空間的にも整然と形づくられ、特に前腎
は最初に作られる非常に単純な構造をもった排出器官で
あり、腎臓の基本単位であるネフロンの数は３種類で異
なるが、その細胞学的な性質は共通であり、したがっ
て、前腎は腎臓形成の仕組みを研究する上でとても有用
なモデル系として知られている。本発明者らは、前腎
（前腎細管）を誘導する比較的簡単な実験系を確立し、
ツメガエルの胞胚期の外胚葉片をアクチビンとレチノイ
ン酸で処理すると前腎細管が誘導され、この前腎細管は
オタマジャクシの前腎に発現するいくつかの分子マーカ
ーを発現することを確認している。しかし、この前腎
（前腎細管）が生体に移植した際に臓器として機能する
ことができるかどうかについては知られていなかった。
腎、後腎という３つの腎臓が順に作られ、それらが排出
器官として機能し、これらの腎臓は中間中胚葉に由来
し、時間的にも空間的にも整然と形づくられ、特に前腎
は最初に作られる非常に単純な構造をもった排出器官で
あり、腎臓の基本単位であるネフロンの数は３種類で異
なるが、その細胞学的な性質は共通であり、したがっ
て、前腎は腎臓形成の仕組みを研究する上でとても有用
なモデル系として知られている。本発明者らは、前腎
（前腎細管）を誘導する比較的簡単な実験系を確立し、
ツメガエルの胞胚期の外胚葉片をアクチビンとレチノイ
ン酸で処理すると前腎細管が誘導され、この前腎細管は
オタマジャクシの前腎に発現するいくつかの分子マーカ
ーを発現することを確認している。しかし、この前腎
（前腎細管）が生体に移植した際に臓器として機能する
ことができるかどうかについては知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これまでに両生類胚の
腎臓、すなわち前腎をインビトロで誘導する実験系の確
立が世界中で試みられ、前腎だけを特異的に誘導するこ
とは不可能とされていたが、上記のように、本発明者ら
はツメガエルの胞胚の外胚葉片を生理活性物質であるア
クチビンとレチノイン酸で処理し、前腎のみを分化させ
る実験系を確立した。しかし、このインビトロで誘導し
た前腎は、生体に移植され実際に排出器官として機能す
ることが確認されて初めて移植用臓器として認められる
ことになる。
腎臓、すなわち前腎をインビトロで誘導する実験系の確
立が世界中で試みられ、前腎だけを特異的に誘導するこ
とは不可能とされていたが、上記のように、本発明者ら
はツメガエルの胞胚の外胚葉片を生理活性物質であるア
クチビンとレチノイン酸で処理し、前腎のみを分化させ
る実験系を確立した。しかし、このインビトロで誘導し
た前腎は、生体に移植され実際に排出器官として機能す
ることが確認されて初めて移植用臓器として認められる
ことになる。
【０００９】本発明の課題は、インビトロで誘導した臓
器が実際に生体内でも機能するかどうかを評価するため
に、発生工学あるいは臓器工学を利用し、臓器のインビ
トロでの誘導と生体移植の手法を確立し、より高等な動
物の先天的腎疾患等の移植治療への道を拓く移植用臓器
を提供することにある。
器が実際に生体内でも機能するかどうかを評価するため
に、発生工学あるいは臓器工学を利用し、臓器のインビ
トロでの誘導と生体移植の手法を確立し、より高等な動
物の先天的腎疾患等の移植治療への道を拓く移植用臓器
を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、アフリカ
ツメガエルの胚の外胚葉片（多分化能を備えた細胞集
団）をアクチビンとレチノイン酸で処理し、個体発生で
最初に作られる最も基本的な排出器官である前腎の分化
誘導を行い、続いて前腎へ分化の方向性が決まった外胚
葉片を、あらかじめ前腎原基（本来、前腎を形成する領
域）を除去した胚に、該前腎原基の発生ステージに応じ
た所定の発生ステージまで培養した後移植すると、イン
ビトロで作った前腎が生体内で機能することを世界で初
めて見い出し、インビトロで作った臓器を生体に移植す
ることができることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
ツメガエルの胚の外胚葉片（多分化能を備えた細胞集
団）をアクチビンとレチノイン酸で処理し、個体発生で
最初に作られる最も基本的な排出器官である前腎の分化
誘導を行い、続いて前腎へ分化の方向性が決まった外胚
葉片を、あらかじめ前腎原基（本来、前腎を形成する領
域）を除去した胚に、該前腎原基の発生ステージに応じ
た所定の発生ステージまで培養した後移植すると、イン
ビトロで作った前腎が生体内で機能することを世界で初
めて見い出し、インビトロで作った臓器を生体に移植す
ることができることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
【００１１】すなわち本発明は、インビトロで誘導した
臓器を同種の被臓器移植動物の生体内に移植した際に生
体内で機能することができる臓器の調製方法であって、
被臓器移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステ
ージまで該臓器を培養することを特徴とする移植用イン
ビトロ誘導臓器の調製方法（請求項１）や、被臓器移植
動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージが、被
臓器移植動物と同じ発生ステージであることを特徴とす
る請求項１記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法
（請求項２）や、所定の発生ステージを、インビトロで
誘導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤ
ＮＡを分子マーカーとして検定することを特徴とする請
求項１又は２記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方
法（請求項３）や、インビトロで誘導した臓器が、胞胚
から切除した外胚葉域から誘導した臓器であることを特
徴とする請求項１〜３のいずれか記載の移植用インビト
ロ誘導臓器の調製方法（請求項４）や、インビトロでの
誘導が、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリーの
存在下で行われることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求
項５）や、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリー
が、アクチビンであることを特徴とする請求項５記載の
移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求項６）や、
インビトロでの誘導が、アクチビン及びレチノイン酸の
存在下で行われることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求
項７）や、臓器が、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管、脊
索、骨格筋、白血球、赤血球、リンパ球から選ばれるこ
とを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の移植用イ
ンビトロ誘導臓器の調製方法（請求項８）や、被臓器移
植動物の生体が、胚であることを特徴とする請求項１〜
８のいずれか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方
法（請求項９）や、被臓器移植動物が、脊椎動物である
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の移植用
インビトロ誘導臓器の調製方法（請求項１０） に関
する。
臓器を同種の被臓器移植動物の生体内に移植した際に生
体内で機能することができる臓器の調製方法であって、
被臓器移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステ
ージまで該臓器を培養することを特徴とする移植用イン
ビトロ誘導臓器の調製方法（請求項１）や、被臓器移植
動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージが、被
臓器移植動物と同じ発生ステージであることを特徴とす
る請求項１記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法
（請求項２）や、所定の発生ステージを、インビトロで
誘導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤ
ＮＡを分子マーカーとして検定することを特徴とする請
求項１又は２記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方
法（請求項３）や、インビトロで誘導した臓器が、胞胚
から切除した外胚葉域から誘導した臓器であることを特
徴とする請求項１〜３のいずれか記載の移植用インビト
ロ誘導臓器の調製方法（請求項４）や、インビトロでの
誘導が、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリーの
存在下で行われることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求
項５）や、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリー
が、アクチビンであることを特徴とする請求項５記載の
移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求項６）や、
インビトロでの誘導が、アクチビン及びレチノイン酸の
存在下で行われることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法（請求
項７）や、臓器が、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管、脊
索、骨格筋、白血球、赤血球、リンパ球から選ばれるこ
とを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の移植用イ
ンビトロ誘導臓器の調製方法（請求項８）や、被臓器移
植動物の生体が、胚であることを特徴とする請求項１〜
８のいずれか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方
法（請求項９）や、被臓器移植動物が、脊椎動物である
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の移植用
インビトロ誘導臓器の調製方法（請求項１０） に関
する。
【００１２】また本発明は、上記請求項１〜１０のいず
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法により
調製することを特徴とするインビトロで誘導された移植
用臓器（請求項１１）や、インビトロで誘導した非ヒト
動物の臓器を、同種の被臓器移植非ヒト動物の生体内に
移植することを特徴とするインビトロで誘導した非ヒト
動物の臓器の評価方法（請求項１２）や、インビトロで
誘導した非ヒト動物の臓器を、同種の被臓器移植非ヒト
動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージまで培
養し、該培養後の臓器を被臓器移植動物の生体内に移植
することを特徴とするインビトロで誘導した非ヒト動物
の臓器の評価方法（請求項１３）や、所定の発生ステー
ジを、インビトロで誘導した臓器の発生ステージに応じ
て発現するゲノムＤＮＡを分子マーカーとして検定する
ことを特徴とする請求項１３記載のインビトロで誘導し
た非ヒト動物の臓器の評価方法（請求項１４）や、イン
ビトロで誘導した臓器が、胞胚から切除した外胚葉域か
ら誘導した臓器であることを特徴とする請求項１３又は
１４のいずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物
の臓器の評価方法（請求項１５）や、インビトロでの誘
導が、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリーの存
在下で行われることを特徴とする請求項１３〜１５のい
ずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器の
評価方法（請求項１６）や、臓器が、腎臓、心臓、膵
臓、肝臓、腸管、脊索、骨格筋、白血球、赤血球、リン
パ球から選ばれることを特徴とする請求項１３〜１６の
いずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器
の評価方法（請求項１７）に関する。
れか記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法により
調製することを特徴とするインビトロで誘導された移植
用臓器（請求項１１）や、インビトロで誘導した非ヒト
動物の臓器を、同種の被臓器移植非ヒト動物の生体内に
移植することを特徴とするインビトロで誘導した非ヒト
動物の臓器の評価方法（請求項１２）や、インビトロで
誘導した非ヒト動物の臓器を、同種の被臓器移植非ヒト
動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージまで培
養し、該培養後の臓器を被臓器移植動物の生体内に移植
することを特徴とするインビトロで誘導した非ヒト動物
の臓器の評価方法（請求項１３）や、所定の発生ステー
ジを、インビトロで誘導した臓器の発生ステージに応じ
て発現するゲノムＤＮＡを分子マーカーとして検定する
ことを特徴とする請求項１３記載のインビトロで誘導し
た非ヒト動物の臓器の評価方法（請求項１４）や、イン
ビトロで誘導した臓器が、胞胚から切除した外胚葉域か
ら誘導した臓器であることを特徴とする請求項１３又は
１４のいずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物
の臓器の評価方法（請求項１５）や、インビトロでの誘
導が、ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミリーの存
在下で行われることを特徴とする請求項１３〜１５のい
ずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器の
評価方法（請求項１６）や、臓器が、腎臓、心臓、膵
臓、肝臓、腸管、脊索、骨格筋、白血球、赤血球、リン
パ球から選ばれることを特徴とする請求項１３〜１６の
いずれか記載のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器
の評価方法（請求項１７）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の移植用インビトロ誘導臓
器の調製方法は、インビトロで誘導した臓器を同種の被
臓器移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能する
ことができる臓器の調製方法であって、被臓器移植動物
の発生ステージに応じた所定の発生ステージまで該臓器
を培養することを特徴とする。
器の調製方法は、インビトロで誘導した臓器を同種の被
臓器移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能する
ことができる臓器の調製方法であって、被臓器移植動物
の発生ステージに応じた所定の発生ステージまで該臓器
を培養することを特徴とする。
【００１４】本発明におけるインビトロで誘導される臓
器には、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管等動物の内臓等
を構成する器官の他に、便宜上、脊索、骨格筋、白血
球、赤血球、リンパ球などの組織が含まれる。また、本
発明における被臓器移植動物としては、インビトロで誘
導される臓器と同種、すなわち分類学上同じ“種(speci
es)”の脊椎動物、例えばイモリやカエル等の両生類、
魚類、鳥類、マウス等の哺乳動物などの非ヒト動物の他
に、ヒトも含まれる。
器には、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸管等動物の内臓等
を構成する器官の他に、便宜上、脊索、骨格筋、白血
球、赤血球、リンパ球などの組織が含まれる。また、本
発明における被臓器移植動物としては、インビトロで誘
導される臓器と同種、すなわち分類学上同じ“種(speci
es)”の脊椎動物、例えばイモリやカエル等の両生類、
魚類、鳥類、マウス等の哺乳動物などの非ヒト動物の他
に、ヒトも含まれる。
【００１５】臓器のインビトロでの誘導は、胞胚から切
除した外胚葉域（アニマルキャップ）を用いることが望
ましい。胞胚の予定外胚葉領域は未分化の細胞群である
ため、培養液に含まれる物質に中胚葉誘導活性がない場
合は組織を分化することなく、表皮様細胞の塊（不整形
表皮）となるが、培養液中に中胚葉誘導活性が存在する
と内部に血球、筋肉、脊索などの中胚葉を含む組織塊と
なる。細胞分化及び発生ステージの検定には、組織の観
察と同時に多くの遺伝子マーカーや抗体を用いた定量的
解析を行うことが好ましい。
除した外胚葉域（アニマルキャップ）を用いることが望
ましい。胞胚の予定外胚葉領域は未分化の細胞群である
ため、培養液に含まれる物質に中胚葉誘導活性がない場
合は組織を分化することなく、表皮様細胞の塊（不整形
表皮）となるが、培養液中に中胚葉誘導活性が存在する
と内部に血球、筋肉、脊索などの中胚葉を含む組織塊と
なる。細胞分化及び発生ステージの検定には、組織の観
察と同時に多くの遺伝子マーカーや抗体を用いた定量的
解析を行うことが好ましい。
【００１６】インビトロで誘導した臓器を同種の被臓器
移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能すること
ができるかどうかは移植時期に大きく依存することか
ら、インビトロで誘導した移植用臓器は、同種の被臓器
移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージ、
すなわち生体内に移植した際に生体内で機能することが
できる発生ステージまで培養する必要がある。そして、
多くの場合、被臓器移植動物と同じ発生ステージまで培
養し、該培養後の臓器を被臓器移植動物の生体内に移植
すると、生体内に移植した際に生体内で機能する可能性
が大きくなる。例えば、被臓器移植動物の移植対象とな
る臓器が原基（primordium）である発生ステージのとき
は、移植用臓器も同じ発生ステージの原基まで生理食塩
水等を用いて培養することが、また移植対象となる臓器
が完全な器官である発生ステージのときは、移植用臓器
も同じ発生ステージの完全な器官まで血清等を用いて培
養することが好ましい。ここで、発生ステージとは、受
精卵又は単為発生卵などを出発点として一つの生物が成
体に到達する個体発生の進行を、一定の段階（ステー
ジ）に区切って番号をつけた各段階（ステージ）をい
い、例えば両生類では変態に至るまでが約６０期の発生
ステージに分けられている。
移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能すること
ができるかどうかは移植時期に大きく依存することか
ら、インビトロで誘導した移植用臓器は、同種の被臓器
移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステージ、
すなわち生体内に移植した際に生体内で機能することが
できる発生ステージまで培養する必要がある。そして、
多くの場合、被臓器移植動物と同じ発生ステージまで培
養し、該培養後の臓器を被臓器移植動物の生体内に移植
すると、生体内に移植した際に生体内で機能する可能性
が大きくなる。例えば、被臓器移植動物の移植対象とな
る臓器が原基（primordium）である発生ステージのとき
は、移植用臓器も同じ発生ステージの原基まで生理食塩
水等を用いて培養することが、また移植対象となる臓器
が完全な器官である発生ステージのときは、移植用臓器
も同じ発生ステージの完全な器官まで血清等を用いて培
養することが好ましい。ここで、発生ステージとは、受
精卵又は単為発生卵などを出発点として一つの生物が成
体に到達する個体発生の進行を、一定の段階（ステー
ジ）に区切って番号をつけた各段階（ステージ）をい
い、例えば両生類では変態に至るまでが約６０期の発生
ステージに分けられている。
【００１７】かかるインビトロ誘導臓器の発生ステージ
の検定は、上記のように組織の観察や抗体を用いる方法
によっても行うことができるが、インビトロで誘導した
臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮＡを分
子マーカーとすることにより一層精確な検定を実施する
ことができる。例えば、両生類胚の正常発生において
は、卵割が１２回行われた中期胞胚期からゲノムＤＮＡ
の発現が急激に増加し、その後は胚の発生ステージに応
じて発現する遺伝子の量と種類が厳密な階層を示しなが
ら変化していくことが明らかになっているが、アクチビ
ンにより処理されたインビトロ誘導臓器においても、表
１に示すようにこの階層は完全に再現されている。また
特に、アフリカツメガエルの腎臓分化に関連するマーカ
ー遺伝子としては、発生ステージ第１１期〜第３１期に
発現するXlim-1、発生ステージ第２０期以降に発現する
Xpax-2、発生ステージ第２２期以降に発現するXCIRPやX
eWT1、発生ステージ第２７期以降に発現するNa+K+-ATPa
se、発生ステージ第３１期以降に発現するCap-1やXlcaa
x-1を例示することができる。
の検定は、上記のように組織の観察や抗体を用いる方法
によっても行うことができるが、インビトロで誘導した
臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮＡを分
子マーカーとすることにより一層精確な検定を実施する
ことができる。例えば、両生類胚の正常発生において
は、卵割が１２回行われた中期胞胚期からゲノムＤＮＡ
の発現が急激に増加し、その後は胚の発生ステージに応
じて発現する遺伝子の量と種類が厳密な階層を示しなが
ら変化していくことが明らかになっているが、アクチビ
ンにより処理されたインビトロ誘導臓器においても、表
１に示すようにこの階層は完全に再現されている。また
特に、アフリカツメガエルの腎臓分化に関連するマーカ
ー遺伝子としては、発生ステージ第１１期〜第３１期に
発現するXlim-1、発生ステージ第２０期以降に発現する
Xpax-2、発生ステージ第２２期以降に発現するXCIRPやX
eWT1、発生ステージ第２７期以降に発現するNa+K+-ATPa
se、発生ステージ第３１期以降に発現するCap-1やXlcaa
x-1を例示することができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】本発明におけるインビトロでの臓器の誘導
は、ＴＧＦ−βファミリーの存在下で行うことができ
る。ＴＧＦは形質転換成長因子あるいはトランスフォー
ミング増殖因子とも呼ばれ、培養環境に添加したとき単
独又は他の因子との共同で、細胞の正常な増殖特性をト
ランスフォーム様の増殖特性に転換させる作用を有し、
かかるＴＧＦには、上皮増殖因子（ＥＧＦ）と受容体を
共通するＴＧＦ−αと、ＴＧＦ−αと共同してＴＧＦ活
性を示すＴＧＦ−βがある。そして、ＴＧＦ−βファミ
リーとしては、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、
ミュラー管抑制因子などを挙げることができるが、中胚
葉誘導活性の点でアクチビンが特に好ましい。
は、ＴＧＦ−βファミリーの存在下で行うことができ
る。ＴＧＦは形質転換成長因子あるいはトランスフォー
ミング増殖因子とも呼ばれ、培養環境に添加したとき単
独又は他の因子との共同で、細胞の正常な増殖特性をト
ランスフォーム様の増殖特性に転換させる作用を有し、
かかるＴＧＦには、上皮増殖因子（ＥＧＦ）と受容体を
共通するＴＧＦ−αと、ＴＧＦ−αと共同してＴＧＦ活
性を示すＴＧＦ−βがある。そして、ＴＧＦ−βファミ
リーとしては、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、
ミュラー管抑制因子などを挙げることができるが、中胚
葉誘導活性の点でアクチビンが特に好ましい。
【００２０】卵巣の顆粒膜細胞などから分泌され、脳下
垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を促
進させる活性をもつ細胞増殖因子であり、ＦＳＨ分泌抑
制因子作用をもつインヒビンβ鎖のサブユニットがＳ−
Ｓ結合したダイマーとして存在している哺乳類のアクチ
ビンは、０．１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で予定外胚葉片に
中胚葉組織を誘導し、筋アクチンやホメオボックス遺伝
子などの中胚葉マーカー遺伝子の発現をひきおこすこと
ができ、いずれのアッセイ系においても腹側から背側に
いたるすべての中胚葉組織を誘導できる特徴を有する
が、アクチビンの作用は明確に濃度依存的であり、濃度
が高くなるに従ってより背側の中胚葉を分化し、およそ
０．３〜１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されたアニマル
キャップの内部には血球、体腔上皮、間充織が、５〜１
０ｎｇ／ｍｌの濃度では筋肉が、５０〜１００ｎｇ／ｍ
ｌにおいては最も背側の中胚葉である脊索がそれぞれ分
化してくる。
垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を促
進させる活性をもつ細胞増殖因子であり、ＦＳＨ分泌抑
制因子作用をもつインヒビンβ鎖のサブユニットがＳ−
Ｓ結合したダイマーとして存在している哺乳類のアクチ
ビンは、０．１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で予定外胚葉片に
中胚葉組織を誘導し、筋アクチンやホメオボックス遺伝
子などの中胚葉マーカー遺伝子の発現をひきおこすこと
ができ、いずれのアッセイ系においても腹側から背側に
いたるすべての中胚葉組織を誘導できる特徴を有する
が、アクチビンの作用は明確に濃度依存的であり、濃度
が高くなるに従ってより背側の中胚葉を分化し、およそ
０．３〜１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されたアニマル
キャップの内部には血球、体腔上皮、間充織が、５〜１
０ｎｇ／ｍｌの濃度では筋肉が、５０〜１００ｎｇ／ｍ
ｌにおいては最も背側の中胚葉である脊索がそれぞれ分
化してくる。
【００２１】他方、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）も濃
度に応じて血球、間充織、筋肉を分化させるが、高濃度
(３０〜１２０ｎｇ／ｍｌ)でも脊索は誘導できないこと
から、インビトロでの臓器の誘導は、アクチビン等のＴ
ＧＦ−βファミリーの存在下で行うことが望ましい。ま
た、アクチビン処理した外植体の内部にはしばしば神経
組織が観察されるが、これは高濃度のアクチビンによっ
て誘導された形成体が、未分化の細胞に神経誘導をおこ
なうことで生じると考えられ、これらのことは、アクチ
ビンが単に組織の分化を誘導するのみならず、背腹軸の
決定に密接に関わっていることを示している。アクチビ
ンによるアニマルキャップへの器官形成の誘導を図２に
示す。
度に応じて血球、間充織、筋肉を分化させるが、高濃度
(３０〜１２０ｎｇ／ｍｌ)でも脊索は誘導できないこと
から、インビトロでの臓器の誘導は、アクチビン等のＴ
ＧＦ−βファミリーの存在下で行うことが望ましい。ま
た、アクチビン処理した外植体の内部にはしばしば神経
組織が観察されるが、これは高濃度のアクチビンによっ
て誘導された形成体が、未分化の細胞に神経誘導をおこ
なうことで生じると考えられ、これらのことは、アクチ
ビンが単に組織の分化を誘導するのみならず、背腹軸の
決定に密接に関わっていることを示している。アクチビ
ンによるアニマルキャップへの器官形成の誘導を図２に
示す。
【００２２】さらに、アクチビンはいくつかの他種の生
体内物質との相互作用によってさまざまな器官を誘導す
ることができる（図２参照）。本発明者らによると、ツ
メガエルのアニマルキャップを適当な濃度のアクチビン
とレチノイン酸で処理することによって腎臓の分化を、
またアクチビンとＢＭＰ（骨形成因子）、もしくはＩＬ
−１１、ＳＣＦ(Stem Cell Factor)によって血球の分化
をコントロールすることができる。上記図２においてＲ
Ａで示されるレチノイン酸は、ビタミンＡ酸とも呼ば
れ、ビタミンＡ（レチノール）の重要な代謝産物であ
り、動物の正常な発育、上皮組織や軟骨の分化増殖に必
須とされ、脊椎動物の発生過程においてモルフォーゲン
様作用をもち、レチノイン酸受容体を介して遺伝子の発
現を制御することによってその作用を発揮する。
体内物質との相互作用によってさまざまな器官を誘導す
ることができる（図２参照）。本発明者らによると、ツ
メガエルのアニマルキャップを適当な濃度のアクチビン
とレチノイン酸で処理することによって腎臓の分化を、
またアクチビンとＢＭＰ（骨形成因子）、もしくはＩＬ
−１１、ＳＣＦ(Stem Cell Factor)によって血球の分化
をコントロールすることができる。上記図２においてＲ
Ａで示されるレチノイン酸は、ビタミンＡ酸とも呼ば
れ、ビタミンＡ（レチノール）の重要な代謝産物であ
り、動物の正常な発育、上皮組織や軟骨の分化増殖に必
須とされ、脊椎動物の発生過程においてモルフォーゲン
様作用をもち、レチノイン酸受容体を介して遺伝子の発
現を制御することによってその作用を発揮する。
【００２３】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具
体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実
施例に限定されるものではない。 実施例１ インビトロにおけるアクチビン及び／又はレチノイン酸
による外植体の分化パターンについて調べた。アフリカ
ツメガエルの胞胚（発生ステージ第９期）から外胚葉域
を切り出し、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン（ヒト組換え
アクチビンＡ）溶液、１０-4Ｍのレチノイン酸（米国シ
グマ社製「Ｒ−２６２５」）溶液、及びアクチビン１０
ｎｇ／ｍｌとレチノイン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で３
時間処理し、生理食塩水（スタインバーグ溶液）中で４
日間培養し、インビトロにおける外植体の分化誘導パタ
ーンを調べた。結果を表２に示す。なお、表２中の括弧
内の数値は全試料数に対する割合（％）を示す（表３も
同じ）。表２から、アクチビン１０ｎｇ／ｍｌとレチノ
イン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で処理したものは、４日
目に前腎細管が高頻度で分化し、処理した外胚葉片のう
ち８６％のものが前腎細管を形成した。図３に形成され
た前腎細管（矢印部分）を模式的に示す（参考写真１参
照）。また、アクチビン単独処理の場合は、外胚葉片に
筋肉や間充織、体腔上皮、神経組織などが誘導され、無
処理及びレチノイン酸単独処理の場合は、何も分化が見
られず、外胚葉片は不整形な表皮細胞塊となることがわ
かる。
体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実
施例に限定されるものではない。 実施例１ インビトロにおけるアクチビン及び／又はレチノイン酸
による外植体の分化パターンについて調べた。アフリカ
ツメガエルの胞胚（発生ステージ第９期）から外胚葉域
を切り出し、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン（ヒト組換え
アクチビンＡ）溶液、１０-4Ｍのレチノイン酸（米国シ
グマ社製「Ｒ−２６２５」）溶液、及びアクチビン１０
ｎｇ／ｍｌとレチノイン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で３
時間処理し、生理食塩水（スタインバーグ溶液）中で４
日間培養し、インビトロにおける外植体の分化誘導パタ
ーンを調べた。結果を表２に示す。なお、表２中の括弧
内の数値は全試料数に対する割合（％）を示す（表３も
同じ）。表２から、アクチビン１０ｎｇ／ｍｌとレチノ
イン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で処理したものは、４日
目に前腎細管が高頻度で分化し、処理した外胚葉片のう
ち８６％のものが前腎細管を形成した。図３に形成され
た前腎細管（矢印部分）を模式的に示す（参考写真１参
照）。また、アクチビン単独処理の場合は、外胚葉片に
筋肉や間充織、体腔上皮、神経組織などが誘導され、無
処理及びレチノイン酸単独処理の場合は、何も分化が見
られず、外胚葉片は不整形な表皮細胞塊となることがわ
かる。
【００２４】実施例２ インビボ（生体内）におけるアクチビン及び／又はレチ
ノイン酸による外植体（移植片）の分化パターンについ
ては移植法によって調べた。実施例１と同様に調製した
外植体（０．３ｍｍ×０．３ｍｍ）をアフリカツメガエ
ルの胚（発生段階第２０期）左側の前腎原基除去（切
除）部分に移植し、５日後にインビボにおける外植体の
分化誘導パターンを調べた。結果を実施例１と同様に表
２に示す。表２から、アクチビン１０ｎｇ／ｍｌとレチ
ノイン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で処理したものは、４
日目に前腎細管が高頻度で分化し、処理した外胚葉片の
うちすべてのものが宿主胚の内部で前腎細管を形成し、
アクチビン単独処理の場合は、外胚葉片に筋肉や体腔上
皮、表皮などが誘導され、前腎細管に分化したものはご
く僅かであり、無処理及びレチノイン酸単独処理の場合
は、ほとんど分化が見られず、外胚葉片は宿主胚の表皮
の一部を形成することがわかる。なお、前腎細管に分化
することは、１％フルオレセイン−デキストラン−アミ
ンからなる蛍光色素（FDA製分子プローブ「Ｄ−１８２
０」）によって移植片をラベルし、それを追跡すること
により確認した。
ノイン酸による外植体（移植片）の分化パターンについ
ては移植法によって調べた。実施例１と同様に調製した
外植体（０．３ｍｍ×０．３ｍｍ）をアフリカツメガエ
ルの胚（発生段階第２０期）左側の前腎原基除去（切
除）部分に移植し、５日後にインビボにおける外植体の
分化誘導パターンを調べた。結果を実施例１と同様に表
２に示す。表２から、アクチビン１０ｎｇ／ｍｌとレチ
ノイン酸１０-4Ｍを含む混合溶液で処理したものは、４
日目に前腎細管が高頻度で分化し、処理した外胚葉片の
うちすべてのものが宿主胚の内部で前腎細管を形成し、
アクチビン単独処理の場合は、外胚葉片に筋肉や体腔上
皮、表皮などが誘導され、前腎細管に分化したものはご
く僅かであり、無処理及びレチノイン酸単独処理の場合
は、ほとんど分化が見られず、外胚葉片は宿主胚の表皮
の一部を形成することがわかる。なお、前腎細管に分化
することは、１％フルオレセイン−デキストラン−アミ
ンからなる蛍光色素（FDA製分子プローブ「Ｄ−１８２
０」）によって移植片をラベルし、それを追跡すること
により確認した。
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例３ 実施例１記載の方法により、インビトロでアクチビンと
レチノイン酸の混合溶液を用いて分化誘導した、発生ス
テージ第２０期に応じて発現するゲノムＤＮＡであるXP
ax-2を分子マーカーとして検出した発生ステージ第２０
期と検定された前腎細管に分化する外胚葉片を、発生ス
テージ第２０期、第２３期及び第２５期の段階で、あら
かじめ左右の前腎原基（第３〜第５体節の下方に存在）
を摘出除去したアフリカツメガエルの胚の除去部位片側
に移植し、生体内で機能することができるかどうかを調
べた。移植の概要を図４に示す。なお、対照として、移
植することなく左右の前腎原基を摘出除去したアフリカ
ツメガエルを用いた。結果を表３に示す。
レチノイン酸の混合溶液を用いて分化誘導した、発生ス
テージ第２０期に応じて発現するゲノムＤＮＡであるXP
ax-2を分子マーカーとして検出した発生ステージ第２０
期と検定された前腎細管に分化する外胚葉片を、発生ス
テージ第２０期、第２３期及び第２５期の段階で、あら
かじめ左右の前腎原基（第３〜第５体節の下方に存在）
を摘出除去したアフリカツメガエルの胚の除去部位片側
に移植し、生体内で機能することができるかどうかを調
べた。移植の概要を図４に示す。なお、対照として、移
植することなく左右の前腎原基を摘出除去したアフリカ
ツメガエルを用いた。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
【００２８】表３から、発生ステージ第２０期に移植し
た場合には１４１例のうち２９例（２１％）が、発生ス
テージ第２３期に移植した場合には４８例のうち４例
（８％）が、発生ステージ第２５期に移植した場合には
１９例のうち１例（５％）が、水腫を形成せずに正常に
発生し、移植された前腎が排出器官として機能し、水腫
の形成を抑えたのに対し、対照である左右の前腎原基を
摘出除去された胚は、発生ステージ第２０期では９６例
のうち７例（７％）が、発生ステージ第２３期では３６
例のうち１例（３％）が水腫を形成せずに正常に発生し
たにすぎず、発生ステージ第２５期では１０例のうちす
べてが水分排出できずに水腫を形成していた。図５
（Ａ）に水腫を形成したオタマジャクシと、図５（Ｂ）
に正常に発生したオタマジャクシ（矢印が移植後、前腎
細管を形成した外胚葉片）を模式的に示す（参考写真２
参照）。
た場合には１４１例のうち２９例（２１％）が、発生ス
テージ第２３期に移植した場合には４８例のうち４例
（８％）が、発生ステージ第２５期に移植した場合には
１９例のうち１例（５％）が、水腫を形成せずに正常に
発生し、移植された前腎が排出器官として機能し、水腫
の形成を抑えたのに対し、対照である左右の前腎原基を
摘出除去された胚は、発生ステージ第２０期では９６例
のうち７例（７％）が、発生ステージ第２３期では３６
例のうち１例（３％）が水腫を形成せずに正常に発生し
たにすぎず、発生ステージ第２５期では１０例のうちす
べてが水分排出できずに水腫を形成していた。図５
（Ａ）に水腫を形成したオタマジャクシと、図５（Ｂ）
に正常に発生したオタマジャクシ（矢印が移植後、前腎
細管を形成した外胚葉片）を模式的に示す（参考写真２
参照）。
【００２９】また、発生ステージ第２０期における移植
又は摘出除去の術後の経過日数と生存率との関係を図６
に示す。図６より、移植することなく摘出除去した場合
には、水腫を形成して９日以内に死亡するが、移植した
場合には、上記のように１４１例のうち２９例（２１
％）が水腫を形成せずに正常に発生し、そのうち数例が
一ヶ月以上生存することがわかる。
又は摘出除去の術後の経過日数と生存率との関係を図６
に示す。図６より、移植することなく摘出除去した場合
には、水腫を形成して９日以内に死亡するが、移植した
場合には、上記のように１４１例のうち２９例（２１
％）が水腫を形成せずに正常に発生し、そのうち数例が
一ヶ月以上生存することがわかる。
【００３０】アカガエル科のラナ・ダルマティナ（Rana
dalmatina）を用いた実験でも知られているように、初
期胚から左右の前腎原基を除去すると、除去胚は水分排
出ができずに水腫（edema）を形成する。上記実施例３
の移植試験において、発生ステージ第２０期〜第２５期
までの胚の第３〜第５体節の下部にある前腎原基を摘出
除去した胚に、アクチビン／レイノイン酸処理した発生
ステージ第２０期〜第２５期の外胚葉片を移植し、水腫
形成が抑えられるという結果が得られたことから、移植
片が前腎すなわち排出器官として機能したと判断でき
る。発生ステージ第２０期に移植されたものに比べて、
発生ステージ第２３期以降に移植手術を行った場合に
は、正常に発生したものは著しく少なく、このことは、
移植を行う時期が非常に重要な要素であり、後期のステ
ージ（ステージ２５）を用いると、宿主に対する移植用
臓器の適応性が著しく低下することがわかった。
dalmatina）を用いた実験でも知られているように、初
期胚から左右の前腎原基を除去すると、除去胚は水分排
出ができずに水腫（edema）を形成する。上記実施例３
の移植試験において、発生ステージ第２０期〜第２５期
までの胚の第３〜第５体節の下部にある前腎原基を摘出
除去した胚に、アクチビン／レイノイン酸処理した発生
ステージ第２０期〜第２５期の外胚葉片を移植し、水腫
形成が抑えられるという結果が得られたことから、移植
片が前腎すなわち排出器官として機能したと判断でき
る。発生ステージ第２０期に移植されたものに比べて、
発生ステージ第２３期以降に移植手術を行った場合に
は、正常に発生したものは著しく少なく、このことは、
移植を行う時期が非常に重要な要素であり、後期のステ
ージ（ステージ２５）を用いると、宿主に対する移植用
臓器の適応性が著しく低下することがわかった。
【００３１】
【発明の効果】本発明によると、アクチビンあるいはア
クチビンとレチノイン酸等を中胚葉誘導因子として用い
た比較的簡単な実験系で臓器をインビトロで誘導するこ
とができ、このインビトロ誘導臓器を被臓器移植動物の
発生ステージに応じた所定の発生ステージまで培養する
ことにより、同種の被臓器移植動物の生体内に移植した
際に生体内で機能することができる臓器を調製すること
ができ、また、インビトロで誘導した臓器を、同種の被
臓器移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステー
ジまで培養した後生体内に移植することにより、インビ
トロで誘導した臓器が移植用臓器として適しているかど
うかを評価することができる。
クチビンとレチノイン酸等を中胚葉誘導因子として用い
た比較的簡単な実験系で臓器をインビトロで誘導するこ
とができ、このインビトロ誘導臓器を被臓器移植動物の
発生ステージに応じた所定の発生ステージまで培養する
ことにより、同種の被臓器移植動物の生体内に移植した
際に生体内で機能することができる臓器を調製すること
ができ、また、インビトロで誘導した臓器を、同種の被
臓器移植動物の発生ステージに応じた所定の発生ステー
ジまで培養した後生体内に移植することにより、インビ
トロで誘導した臓器が移植用臓器として適しているかど
うかを評価することができる。
【００３２】また、本発明によると、インビトロで誘導
された臓器が実際に生体内で機能することを確認するこ
とができるので、腎臓等の臓器の形成の仕組みを解明す
る上で多くの有用な知見を得ることができるばかりでな
く、インビトロでの臓器形成とその生体への移植という
発生工学あるいは臓器工学の新たな分野の確立にも貢献
することができる。さらに、本発明によると、免疫的に
適合した臓器の移植が可能となり、ヒトを含めた高等動
物の腎疾患等の各種疾病に対して治療の道を拓くことが
できる。
された臓器が実際に生体内で機能することを確認するこ
とができるので、腎臓等の臓器の形成の仕組みを解明す
る上で多くの有用な知見を得ることができるばかりでな
く、インビトロでの臓器形成とその生体への移植という
発生工学あるいは臓器工学の新たな分野の確立にも貢献
することができる。さらに、本発明によると、免疫的に
適合した臓器の移植が可能となり、ヒトを含めた高等動
物の腎疾患等の各種疾病に対して治療の道を拓くことが
できる。
【図１】アフリカツメガエルの発生過程を模式的に説明
する図である。
する図である。
【図２】中胚葉誘導因子であるアクチビン及び他の生理
活性物質によって誘導を受けたアニマルキャップの器官
形成を説明する図である。
活性物質によって誘導を受けたアニマルキャップの器官
形成を説明する図である。
【図３】アクチビンとレチノイン酸の混合溶液で処理さ
れた外胚葉片に形成された前腎細管を模式的に示す図で
ある。
れた外胚葉片に形成された前腎細管を模式的に示す図で
ある。
【図４】前腎細管に分化する外胚葉片を、あらかじめ左
右の前腎原基を摘出除去したアフリカツメガエルの胚の
除去部位片側に移植する概要を示す図である。
右の前腎原基を摘出除去したアフリカツメガエルの胚の
除去部位片側に移植する概要を示す図である。
【図５】前腎原基が摘出除去され水腫を形成したアフリ
カツメガエルのオタマジャクシ（Ａ）と、前腎細管に分
化した移植片を片側にもつアフリカツメガエルのオタマ
ジャクシ（Ｂ）を模式的に示す図である。
カツメガエルのオタマジャクシ（Ａ）と、前腎細管に分
化した移植片を片側にもつアフリカツメガエルのオタマ
ジャクシ（Ｂ）を模式的に示す図である。
【図６】アフリカツメガエル発生ステージ第２０期にお
ける前腎細管へ誘導された移植片をもつ移植体と移植を
受けなかった前腎原基摘出除去体との術後の生存カーブ
を示す図である。
ける前腎細管へ誘導された移植片をもつ移植体と移植を
受けなかった前腎原基摘出除去体との術後の生存カーブ
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１月６日（２０００．１．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B063 QQ02 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QS32 QS36 4B065 AA90X BA12 BB08 BB19 BB34 BC41 CA44 CA60
Claims (17)
- 【請求項１】 インビトロで誘導した臓器を同種の被臓
器移植動物の生体内に移植した際に生体内で機能するこ
とができる臓器の調製方法であって、被臓器移植動物の
発生ステージに応じた所定の発生ステージまで該臓器を
培養することを特徴とする移植用インビトロ誘導臓器。 - 【請求項２】 被臓器移植動物の発生ステージに応じた
所定の発生ステージが、被臓器移植動物と同じ発生ステ
ージであることを特徴とする請求項１記載の移植用イン
ビトロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項３】 所定の発生ステージを、インビトロで誘
導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤＮ
Ａを分子マーカーとして検定することを特徴とする請求
項１又は２記載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方
法。 - 【請求項４】 インビトロで誘導した臓器が、胞胚から
切除した外胚葉域から誘導した臓器であることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか記載の移植用インビトロ誘
導臓器の調製方法。 - 【請求項５】 インビトロでの誘導が、ＴＧＦ（形質転
換成長因子）−βファミリーの存在下で行われることを
特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の移植用インビ
トロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項６】 ＴＧＦ（形質転換成長因子）−βファミ
リーが、アクチビンであることを特徴とする請求項５記
載の移植用インビトロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項７】 インビトロでの誘導が、アクチビン及び
レチノイン酸の存在下で行われることを特徴とする請求
項１〜４のいずれか記載の移植用インビトロ誘導臓器の
調製方法。 - 【請求項８】 臓器が、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸
管、脊索、骨格筋、白血球、赤血球、リンパ球から選ば
れることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の移
植用インビトロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項９】 被臓器移植動物の生体が、胚であること
を特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の移植用イン
ビトロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項１０】 被臓器移植動物が、脊椎動物であるこ
とを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の移植用イ
ンビトロ誘導臓器の調製方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか記載の移植
用インビトロ誘導臓器の調製方法により調製することを
特徴とするインビトロで誘導された移植用臓器。 - 【請求項１２】 インビトロで誘導した非ヒト動物の臓
器を、同種の被臓器移植非ヒト動物の生体内に移植する
ことを特徴とするインビトロで誘導した非ヒト動物の臓
器の評価方法。 - 【請求項１３】 インビトロで誘導した非ヒト動物の臓
器を、同種の被臓器移植非ヒト動物の発生ステージに応
じた所定の発生ステージまで培養し、該培養後の臓器を
被臓器移植動物の生体内に移植することを特徴とするイ
ンビトロで誘導した非ヒト動物の臓器の評価方法。 - 【請求項１４】 所定の発生ステージを、インビトロで
誘導した臓器の発生ステージに応じて発現するゲノムＤ
ＮＡを分子マーカーとして検定することを特徴とする請
求項１３記載のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器
の評価方法。 - 【請求項１５】 インビトロで誘導した臓器が、胞胚か
ら切除した外胚葉域から誘導した臓器であることを特徴
とする請求項１３又は１４のいずれか記載のインビトロ
で誘導した非ヒト動物の臓器の評価方法。 - 【請求項１６】 インビトロでの誘導が、ＴＧＦ（形質
転換成長因子）−βファミリーの存在下で行われること
を特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載のインビ
トロで誘導した非ヒト動物の臓器の評価方法。 - 【請求項１７】 臓器が、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、腸
管、脊索、骨格筋、白血球、赤血球、リンパ球から選ば
れることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載
のインビトロで誘導した非ヒト動物の臓器の評価方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11021077A JP2000217571A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | インビトロで誘導した移植用臓器 |
| EP00900388A EP1146118A4 (en) | 1999-01-29 | 2000-01-14 | VITRO-INDUCED ORGANS FOR TRANSPLANTATION |
| PCT/JP2000/000148 WO2000044881A1 (fr) | 1999-01-29 | 2000-01-14 | ORGANES POUR TRANSPLANTATION PRODUITS $i(IN VITRO) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11021077A JP2000217571A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | インビトロで誘導した移植用臓器 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000217571A true JP2000217571A (ja) | 2000-08-08 |
Family
ID=12044836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11021077A Pending JP2000217571A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | インビトロで誘導した移植用臓器 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1146118A4 (ja) |
| JP (1) | JP2000217571A (ja) |
| WO (1) | WO2000044881A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413901B2 (en) | 2000-04-27 | 2008-08-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of forming vertebrate pancreas in vitro |
| WO2010016469A1 (ja) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | 片山化学工業株式会社 | Ｎｅｌｌ－１による組織・臓器異所再生制御技術 |
| JP2016119919A (ja) * | 2004-07-09 | 2016-07-07 | ヴィアサイト，インコーポレイテッド | 前原始線条及び中内胚葉細胞 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03147782A (ja) * | 1989-10-31 | 1991-06-24 | Bio Material Kenkyusho:Kk | 細胞移植方法 |
| US5851832A (en) * | 1991-07-08 | 1998-12-22 | Neurospheres, Ltd. | In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny |
| JPH06277050A (ja) * | 1993-03-26 | 1994-10-04 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 動物細胞の固定化物および培養方法 |
-
1999
- 1999-01-29 JP JP11021077A patent/JP2000217571A/ja active Pending
-
2000
- 2000-01-14 EP EP00900388A patent/EP1146118A4/en not_active Withdrawn
- 2000-01-14 WO PCT/JP2000/000148 patent/WO2000044881A1/ja active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6009000146, "１ＰＹ０５アクチビン／レチノイン酸処理したツメガエル外胚葉片の腎管形成と胚への移植について", 日本動物学会大会予稿集（１９９７），Ｖｏｌ．６８ｔｈ，ｐ．３４ * |
| JPN6009000148, 化学工業（１９９７），Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．９，ｐ．７３３−７３８ * |
| JPN6009000151, Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｈ Ｄｉｆｆｅｒ．（１９９６），Ｖｏｌ．３８，ｐ．６２５−６３４ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7413901B2 (en) | 2000-04-27 | 2008-08-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of forming vertebrate pancreas in vitro |
| JP2016119919A (ja) * | 2004-07-09 | 2016-07-07 | ヴィアサイト，インコーポレイテッド | 前原始線条及び中内胚葉細胞 |
| JP2018027099A (ja) * | 2004-07-09 | 2018-02-22 | ヴィアサイト，インコーポレイテッド | 前原始線条及び中内胚葉細胞 |
| WO2010016469A1 (ja) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | 片山化学工業株式会社 | Ｎｅｌｌ－１による組織・臓器異所再生制御技術 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1146118A1 (en) | 2001-10-17 |
| EP1146118A4 (en) | 2002-08-14 |
| WO2000044881A1 (fr) | 2000-08-03 |
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