CN109644982A - 一种用于脂肪干细胞的冻存方法 - Google Patents

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栾杰
王黔
穆大力
刘春军
辛敏强
付苏
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    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明提供了一种用于脂肪干细胞的冻存方法，包括：S1：将分离出的脂肪干细胞加入冻存液进行程序性降温冻存；S2：将冻存后的脂肪干细胞置入恒温水浴箱内进行解冻复苏。本发明中的一种用于脂肪干细胞的冻存方法与现有技术相比,具有以下优点：1、脂肪间充质干细胞复苏率高；2、冻存过程精确、可控，可重复性强；3、无需专用商品化冻存剂。

Description

一种用于脂肪干细胞的冻存方法
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种用于脂肪干细胞的冻存方法。
背景技术
吸脂手术后的脂肪组织是医疗废弃物。术后需要作为医疗垃圾统一处理。然而其内具有大量的脂肪干细胞被一同丢弃。脂肪干细胞是(ASCs)一群从脂肪组织获取的中胚层来源的多能成体干细胞，其具有自我更新及多向分化潜能，且脂肪干细胞由于产量高，容易获取，是代替骨髓干细胞的重要干细胞来源。通过ASCs治疗慢性溃疡等临床应用已在许多临床研究中报道，此外其具有治疗糖尿病、心血管疾病、瘢痕的潜能。
应用细胞进行研究的前提是低温保存，以备随时取用。目前提取脂肪干细胞的冻存过程主要步骤分为胰酶消化、终止消化、离心去上清、添加冻存剂、冻存管内分装、-80℃降温盒过夜、液氮储存等步骤。
然而，目前降温控制多采用降温盒，降温速率受异丙醇剂量等因素影响大，降温速率尚未标准化。造成冻存后脂肪干细胞质量不一。研究针对脂肪干细胞提取的安全、便捷、高效具有重要作用。因此制定高效、标准的冻存方法对其保藏至关重要。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有冻存方法冻存脂肪干细胞复苏后细胞质量不一的技术问题。
本发明提供了一种用于脂肪干细胞的冻存方法，包括：
S1：将分离出的脂肪干细胞加入冻存液进行程序性降温冻存；
S2：将冻存后的脂肪干细胞置入恒温水浴箱内进行解冻复苏。
进一步，所述S1中使用的冻存程序为：
将细胞混悬液转入冻存管；
第一阶段在4℃等待；
第二阶段由4℃至-60℃采用1℃/min的速率进行冻存；
第三阶段在-60℃停滞5分钟冻存处理。
进一步，所述S1中使用的冻存液为90％胎牛血清FBS+10％二甲基亚砜DMSO所组成的冻存液。
进一步，所述S1中冻存的过程具体为：
S1.1：制备细胞悬浮液，并置于冰水混合物上预冷；
其中，所述悬浮液浓度为5*106个/ml；
S1.2：冷冻液冰水混合物预冷；
S1.3：将冻存液用200微升移液枪头逐滴加入所述细胞混悬液，加入体积比为细胞混悬液：冻存液等于1:4的所述细胞混悬液，即800微升冻存液；
S1.4：将细胞混悬液转入冻存管。
本发明的有益效果是，本发明中的一种用于脂肪干细胞的冻存方法与现有技术相比,具有以下优点：
1、脂肪间充质干细胞复苏率高；
2、冻存过程精确、可控，可重复性强；
3、无需专用商品化冻存剂。
附图说明
图1为本发明的一种用于脂肪干细胞的冻存方法的流程示意图；
图2为本发明的降温程序与传统冻存盒法降温速率下的复苏率对比，所采用的冻存剂为本发明的FBS+DMSO组成的冻存液和4种商品冻存液。
具体实施方式
以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定装备结构、接口、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。在其它情况中，省略对众所周知的装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本发明的描述。
如图1所示，本发明公开了一种用于脂肪干细胞的冻存方法，包括：
S1：将分离出的脂肪干细胞加入冻存液进行程序性降温冻存；
S2：将冻存后的脂肪干细胞置入恒温水浴箱内进行解冻复苏。
本发明的S1对脂肪干细胞进行冻存的步骤中，首先加入配比为90％胎牛血清FBS和10％二甲基亚砜DMSO所组成的冻存液。
图2为本发明的降温程序与传统冻存盒法降温速率下的复苏率对比，所采用的冻存剂为本发明的FBS+DMSO组成的冻存液和4种商品冻存液。
通过图2可以发现，采用本发明的90％胎牛血清FBS和10％二甲基亚砜DMSO所组成的冻存液在降温盒法和本专利降温程序的条件下都有着较好的脂肪干细胞复苏效果，利用本专利细胞复苏率明显优于传统降温盒法，且复苏效果不亚于商品冻存剂。
之后进行冻存处理，冻存的过程为：
S1.1：制备细胞悬浮液，悬浮液为前述培养基，悬浮浓度为5*106个/ml，并置于冰水混合物上预冷；
S1.2：冷冻液冰水混合物预冷；
S1.3：将冻存液用200微升移液枪头逐滴加入细胞混悬液，加入体积比为细胞混悬液：冻存液等于1:4的细胞混悬液；
S1.4：将细胞混悬液转入冻存管。
在一些说明性实施例中，所述S1中使用的冻存程序为：
将细胞混悬液转入冻存管；
第一阶段在4℃等待；
第二阶段由4℃至-60℃采用1℃/min的速率进行冻存；
第三阶段在-60℃停滞5分钟冻存处理。
本发明的S2进行脂肪干细胞复苏的步骤中，将冻存后的脂肪干细胞取出冻存管，置于37℃的恒温水浴箱内，不断摇动加速存进其融化至少许冰球残留。将细胞悬液转至离心管中，加入10倍体积的培养基离心弃上清，再重悬于完全培养液进行检测。
读者应理解，在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种用于脂肪干细胞的冻存方法，其特征在于，包括：
S1：将分离出的脂肪干细胞加入冻存液进行程序性降温冻存；
S2：将冻存后的脂肪干细胞置入恒温水浴箱内进行解冻复苏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中使用的冻存程序为：
将细胞混悬液转入冻存管；
第一阶段在4℃等待；
第二阶段由4℃至-60℃采用1℃/min的速率进行冻存；
第三阶段在-60℃停滞5分钟冻存处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中冻存的过程具体为：
S1.1：制备细胞悬浮液，并置于冰水混合物上预冷；
其中，所述悬浮液浓度为5*106个/ml；
S1.2：冷冻液冰水混合物预冷；
S1.3：将冻存液用200微升移液枪头逐滴加入所述细胞混悬液，加入体积比为细胞混悬液：冻存液等于1:4的所述细胞混悬液；
S1.4：将细胞混悬液转入冻存管。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中使用的冻存液为90％胎牛血清FBS和10％二甲基亚砜DMSO所组成的冻存液。
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