CN105165804A - 一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞领域，公开了脂肪间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液包括10v/v％-20v/v％DMSO、30v/v％-80v/v％脂肪间充质干细胞条件培养基、10v/v％-50v/v％胎牛血清。采用本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，细胞回收率明显高于常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液。本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存方法将脂肪间充质干细胞消化离心，加入脂肪间充质干细胞条件培养基调整细胞密度，加入等体积的所述冻存保护液后冻存细胞。本发明所述冻存方法冻存的细胞复苏后细胞回收率明显高于常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。
背景技术
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一。除此以外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。
脂肪间充质干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，具有取材容易、不限年龄及时间、少量组织即可获取大量间充质干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点。而且脂肪来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，因此脂肪间充质干细胞逐渐成为近年来新的研究热点之一。
间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的脂肪间充质干细胞的冻存方法，使具有临床应用价值的脂肪间充质干细胞能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。
脂肪间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。
目前现有技术中，脂肪间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以DMSO和血清为主要成分，另一种是以培养基、DMSO和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存脂肪间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液，包括
DMSO10v/v％-20v/v％
脂肪间充质干细胞条件培养基30v/v％-80v/v％
胎牛血清10v/v％-50v/v％。
其中，所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液中所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法为：取P1-P5代的脂肪间充质干细胞酶解消化后传代，连续培养24-72h后，收集培养上清，离心后取上清。
在一些实施方案中，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述P1-P5代的脂肪间充质干细胞优选为汇合度80-90％脂肪间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述酶解消化具体为向细胞中加入0.015mL/cm2-0.04mL/cm2的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，完全培养基终止酶解。
在一些优选实施方案中，所述终止酶解的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍～10倍。
在一些实施方案中，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述传代为酶解消化后的细胞离心，完全培养基重选后，按80000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2的传代密度传代，细胞连续生长24h-72h。
其中，所述酶解消化后的离心优选为200g-400g离心5min。
本领域技术人员可以理解，本发明所述完全培养基的组成为DMEM-F1280v/v％-95v/v％，FBS5v/v％-20v/v％。
本发明所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法在脂肪间充质干细胞传代后收集培养上清，离心后取上清获得脂肪间充质干细胞条件培养基。其中，所述离心优选为200g-400g离心5min。
本发明还提供了所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，按比例将脂肪间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMSO，冰水浴中降温至0℃。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，将脂肪间充质干细胞消化离心，加入脂肪间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度至0.1×106个/mL-10×106个/mL，加入等体积的所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，-80℃中冻存1天-5天，转移至液氮中长久保存。
其中，所述的冻存方法中，所述消化为向细胞中加入0.015mL/cm2-0.04mL/cm2的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，用5倍-10倍于消化液的完全培养基终止酶解。
在一个具体实施例中，本发明分别采用不同的冻存保护液冻存脂肪间充质干细胞，比较不同的冻存保护液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率以及细胞增殖情况，对比本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液与常规冻存液的冻存效果，结果显示虽然细胞活率没有明显差异，但经本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏的细胞回收率明显高于其他常规冻存液。而增殖情况结果显示本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液冻存的细胞相对常规冻存液冻存的细胞，扩增的倍数更多。
由此可见，采用本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液，结合本发明所述的冻存方法进行脂肪间充质干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在回收率上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规冻存液。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液。
本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液包括10v/v％-20v/v％DMSO、30v/v％-80v/v％脂肪间充质干细胞条件培养基、10v/v％-50v/v％胎牛血清。与常规细胞冻存液相比，采用本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，不仅在细胞回收率上明显高于其他常规冻存液，细胞增殖能力也优于常规细胞冻存液，可以用于间充质干细胞的长期保存及应用。本发明所述脂肪间充质干细胞的冻存方法将脂肪间充质干细胞消化离心后，加入脂肪间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度，加入等体积的本发明所述冻存保护液后冻存细胞。与常规的冻存方法相比，本发明脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在细胞回收率上明显高于其他常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1复苏后各组细胞增殖情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
对比例1、
分别采用表1中不同的冻存保护液冻存脂肪间充质干细胞，比较不同的冻存保护液冻存复苏后细胞回收率、细胞活率以及细胞增殖情况。
表1不同的冻存保护液
冻存方法如下：
1、配制脂肪间充质干细胞条件培养基：取汇合度80％的P2代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离心5min，用完全培养基重选后，接种于培养瓶中，传代密度为10000个细胞每cm2。细胞连续生长48h，收集培养上清，200g离心5min，取上清，分装后置于-80℃保存备用。
2、取汇合度80％的P3代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，分别命名为A组、B组和C组。200g离心5min，去上清，A组加入脂肪间充质干细胞条件培养基至细胞密度为4×106cell/mL，B组加入加入胎牛血清至细胞密度4×106cell/mL，C组加入完全培养基至细胞密度为4×106cell/mL，轻轻吹打均匀。
3、分别向上述各组加入等体积的表1中A、B、C三组配方的冻存保护液。A组为本发明所述脂肪间充质干细胞冻存保护液，B组和C组为常用冻存保护液。各组轻轻吹打均匀后，分装，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中3天，转移至液氮中，半年后取出复苏，计算回收率，细胞活率，以及细胞增殖情况。结果见表2。其中计算公式如下：
①细胞回收率＝复苏后细胞数/冻存时候细胞数×100％
②细胞活率：细胞复苏后取样，用0.4％台盼蓝1:1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数×100％
③细胞增殖情况：把复苏后的细胞，按10000个细胞每孔接种于12孔板中，连续培养，每天取样计数，作三个重复，观察细胞的增殖情况。结果见图1。
表2复苏后细胞回收率、细胞活率以及细胞增殖情况
| 组别 | A组 | B组 | C组 |
| 细胞回收率 | 98.32％ | 88.31％ | 83.43％ |
| 细胞活率 | 96.21％ | 93.46％ | 91.57％ |
由表2结果可见，虽然A组冻存保护液冻存后复苏的细胞活率要优于BC两组，但优势不明显，而细胞回收率A组冻存保护液冻存后复苏的细胞明显高于其他两组。
而由图1结果可见，经A组冻存保护液冻存后复苏的细胞的增殖也优于其他两组，A组细胞扩增的倍数更多。
实施例1：
脂肪间充质干细胞条件培养基的配制：取汇合度90％的P1代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.05％的胰酶+0.01％EDTA消化1min，用5倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离心5min，用完全培养基重选后，接种于培养皿中，传代密度为8000个细胞每cm2。细胞连续生长72h，收集培养上清，200g离心5min，取上清，分装后置于-80℃保存备用。
细胞冻存前，配制脂肪间充质干细胞冻存保护液：将80％脂肪间充质干细胞条件培养基及10％胎牛血清混合，再加入10％DMSO，置于冰水浴中至脂肪间充质干细胞冻存保护液温度将近于0℃。
细胞冻存：取汇合度80％的P6代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，200g离心5min，去上清，加入条件培养基至细胞密度为2×106cell/mL，轻轻吹打均匀。加入等体积的脂肪间充质干细胞冻存保护液。轻轻吹打均匀后，分装后，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中，半年后取出复苏，计算回收率，细胞活率。
细胞活率：94.92％，细胞回收率：96.16％。
实施例2：
脂肪间充质干细胞条件培养基的配制：取汇合度80％的P5代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗3遍后，往细胞中加入0.04mL/cm2的0.05％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，400g离心5min，用完全培养基重选后，接种于培养瓶中，传代密度为15000个细胞每cm2。细胞连续生长24h，收集培养上清，400g离心5min，取上清，分装后置于-80℃保存备用。
细胞冻存前，配制脂肪间充质干细胞冻存保护液：将30％脂肪间充质干细胞条件培养基及50％胎牛血清混合，再加入20％DMSO，置于冰水浴中至冻存液温度将近于0℃。
细胞冻存：取汇合度80％的P6代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，200g离心5min，去上清，加入条件培养基至细胞密度为2×106cell/mL，轻轻吹打均匀。加入等体积的脂肪间充质干细胞冻存保护液。轻轻吹打均匀后，分装后，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中，半年后取出复苏，计算回收率，细胞活率。
细胞活率：98.98％，细胞回收率：94.14％。
实施例3：
脂肪间充质干细胞条件培养基的配制：取汇合度80％的P3代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.04mL/cm2的0.05％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，400g离心5min，用完全培养基重选后，接种于培养皿或培养瓶中，传代密度为10000个细胞每cm2。细胞连续生长48h，收集培养上清，400g离心5min，取上清，分装后置于-80℃保存备用。
细胞冻存前，配制脂肪间充质干细胞冻存保护液：将55％脂肪间充质干细胞条件培养基及30％胎牛血清混合，再加入15％DMSO，置于冰水浴中至冻存液温度将近于0℃。
细胞冻存：取汇合度80％的P4代的脂肪间充质干细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，200g离心5min，去上清，加入条件培养基至细胞密度为2×106cell/mL，轻轻吹打均匀。加入等体积的脂肪间充质干细胞冻存保护液。轻轻吹打均匀后，分装后，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中，半年后取出复苏，计算回收率，细胞活率。
细胞活率：97.22％，细胞回收率：97.49％。
Claims (9)
1.一种脂肪间充质干细胞的冻存保护液，包括
DMSO10v/v％-20v/v％
脂肪间充质干细胞条件培养基30v/v％-80v/v％
胎牛血清10v/v％-50v/v％。
2.根据权利要求1所述的冻存保护液，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法为：取P1-P5代的脂肪间充质干细胞酶解消化后传代，连续培养24-72h后，收集培养上清，离心后取上清。
3.根据权利要求2所述的冻存保护液，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述酶解消化具体为向细胞中加入0.015mL/cm2-0.04mL/cm2的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，完全培养基终止酶解。
4.根据权利要求2所述的冻存保护液，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述传代为酶解消化后的细胞离心，完全培养基重选后，按80000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2的传代密度传代，细胞连续生长24h-72h。
5.根据权利要求2所述的冻存保护液，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述离心为200g-400g离心5min。
6.权利要求1所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，按比例将脂肪间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMSO，冰水浴中降温至0℃。
7.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，将脂肪间充质干细胞消化离心后，加入脂肪间充质干细胞条件培养基，调整细胞密度至0.1×106个/mL-10×106个/mL，加入等体积的权利要求1所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，-80℃中冻存1天-5天，转移至液氮中长久保存。
8.根据权利要求7所述的冻存方法，所述消化为向细胞中加入0.015mL/cm2-0.04mL/cm2的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，用5倍-10倍于消化液的完全培养基终止酶解。
9.一种脂肪间充质干细胞的冻存试剂盒，包含权利要求1所述脂肪间充质干细胞的冻存保护液。
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