CN107251894A - 一种高存活率的细胞冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高存活率的细胞冻存方法，用移液枪将培养基吸尽，加入3‑5ml PBS洗涤细胞2‑3次，向细胞培养皿中加入1‑2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3‑5min，加入2‑3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部40‑50次；将液体移至细胞离心管中，在1000‑1500g/min条件下离心3‑10min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞40‑50次，加入到细胞冻存管中，拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2‑7℃保存10‑30min，再于15‑20℃保存40‑60min，然后移入到≤‑80℃环境进行细胞冻存，细胞复苏后存活率高。

Description

一种高存活率的细胞冻存方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种高存活率的细胞冻存方法。
背景技术
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。
人们在细胞生物学及其相关学科的研究中，越来越多的运用组织细胞培养增殖技术，将有研究意义或有应用前景的活体细胞，采用低温度进行长期保存数月、数年、数十年甚至数百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种高存活率的细胞冻存方法，用于多种人源以及非人源细胞的培养。
技术方案：本发明提供了一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3-5ml PBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3-5min，加入2-3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1500g/min条件下离心3-10min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞40-50次，加入到细胞冻存管中，拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2-7℃保存10-30min，再于-15 - -20℃保存40-60min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。第二天放入液氮罐中在液氮浸没条件下进行细胞冻存。本发明的高存活率的细胞冻存方法，安全性、稳定性好，冻存后的细胞复苏后存活率高，可以适用于人源以及非人源的多种细胞的培养。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，每支冻存管中细胞冻存密度为105-106个细胞。细胞密度合理，可以有效保证细胞的存活率及细胞活性。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。可以与胰蛋白酶相配合，迅速使贴壁细胞脱离培养皿，减少胰蛋白酶对细胞的损伤。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以进一步为培养的细胞提供营养物质，同时还能终止胰蛋白酶的消化作用。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉2-5份、壳聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、维生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基础培养基80-90份。细胞冻存液组分合理，营养丰富，其中右旋糖酐可以，N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺则抑制细胞活动和基因表达，维生素C的抗氧化性好，在保证休眠细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠12-25份、丙酮酸钠10-16份、丝胶蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙 0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛 0.3-0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亚麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。基础培养基组分合理，营养丰富，可以提高细胞冻存时的营养物质，保证冻存细胞的活性。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止冻存细胞被污染。
进一步的，上述的高存活率的细胞冻存方法，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
有益效果：本发明所述的高存活率的细胞冻存方法，方法合理，应用成本低，在保证休眠细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
附图说明
图1为实施例1-4细胞存活率的测定图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种高存活率的细胞冻存方法，冻存人源性肝癌细胞A549，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3ml PBS洗涤细胞3次，向细胞培养皿中加入1ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3min，加入2ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部40次；将液体移至细胞离心管中，在1000g/min条件下离心10min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞40次，加入到细胞冻存管中，每支冻存管中细胞冻存密度为105个细胞。拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2℃保存10min，再于-15℃保存60min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。第二天放入液氮罐中在液氮浸没于液氮中进行细胞冻存。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉2份、壳聚糖5份、谷胱甘肽2份、维生素C1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1份和基础培养基80份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠10份、丝胶蛋白5份、氯化钾35份、无水硫酸镁 6份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸 0.3份、肌醇0.8份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙25份、硝酸铁0.2份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.3份、酒石酸胆碱0.6份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.3份、N-异丙基丙烯酰胺0.2份、亚麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸3份、甘氨酸1份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸8份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸1份、L-苯丙氨酸2份、L-苏氨酸5份、L-色氨酸1份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 3份、白介素14 1份、IFN-γ3份和神经白细胞素1份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。
实施例2
一种高存活率的细胞冻存方法，冻存小鼠来源的黑色素瘤细胞B16，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入5ml PBS洗涤细胞2次，向细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化5min，加入3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部50次；将液体移至细胞离心管中，在1500g/min条件下离心3min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞50次，加入到细胞冻存管中，每支冻存管中细胞冻存密度为106个细胞。拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在7℃保存30min，再于-20℃保存40min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。第二天放入液氮罐中在液氮浸没于液氮中进行细胞冻存。
其中，所述培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉2-5份、壳聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、维生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基础培养基80-90份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 88份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠16份、丝胶蛋白9份、氯化钾45份、无水硫酸镁 10份、氯化钠78份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸 0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.6份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.4份、丁二酸8份、丁二酸钠16份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.8份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛 0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.4份、亚麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 10份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸5份、L-盐酸组氨酸 6份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸6份、L-苯丙氨酸8份、L-苏氨酸15份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸9份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子8份、白介素2 8份、白介素4 4份、白介素14 5份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。
实施例3
一种高存活率的细胞冻存方法，冻存猴肾细胞Marc145，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入4ml PBS洗涤细胞3次，向细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化4min，加入3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部48次；将液体移至细胞离心管中，在1200g/min条件下离心5min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞45次，加入到细胞冻存管中，每支冻存管中细胞冻存密度为5×105个细胞。拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在5℃保存20min，再于-18℃保存50min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。第二天放入液氮罐中在液氮浸没于液氮中进行细胞冻存。
其中，所述培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜10份、羟乙基淀粉3份、壳聚糖6份、谷胱甘肽3份、维生素C2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基础培养基85份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 86份、碳酸氢钠18份、丙酮酸钠12份、丝胶蛋白6份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、叶酸 0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛 0.4份、N-异丙基丙烯酰胺0.3份、亚麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚红钠1.2份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 8份、L-盐酸胱氨酸 6份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸10份、L-盐酸赖氨酸15份、L-甲硫氨酸3份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸9份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸6份和L-缬氨酸9份。
再，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子6份、白介素2 5份、白介素4 4份、白介素14 5份、IFN-γ5份和神经白细胞素3份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。
实施例4
一种高存活率的细胞冻存方法，冻存大鼠的永生化肝星形细胞HSC-T6，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入5ml PBS洗涤细胞3次，向细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化4min，加入3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部50次；将液体移至细胞离心管中，在1000g/min条件下离心8min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞50次，加入到细胞冻存管中，每支冻存管中细胞冻存密度为106个细胞。拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2℃保存20min，再于-18℃保存45min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。第二天放入液氮罐中在液氮浸没于液氮中进行细胞冻存。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟乙基淀粉2份、壳聚糖6份、谷胱甘肽3份、维生素C1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基础培养基90份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠12份、丝胶蛋白6份、氯化钾45份、无水硫酸镁 6份、氯化钠72份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸 0.3份、肌醇1份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.3份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛 0.4份、N-异丙基丙烯酰胺0.4份、亚麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括6份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸5份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸10份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括4份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 8份、白介素4 3份、白介素14 4份、IFN-γ5份和神经白细胞素2份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。
将实施例1-4冻存的细胞分别取冻存后3个月、6个月、9个月、12个月、18个月以及24个月的冻存细胞进行复苏，并对细胞存活率进行测定，细胞存活率均在85%以上。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3-5ml PBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3-5min，加入2-3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1500g/min条件下离心3-10min，用移液枪去除上清液，加入冻存液，使用移液枪上下吹打细胞40-50次，加入到细胞冻存管中，拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2-7℃保存10-30min，再于-15 - -20℃保存40-60min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存。
2.根据权利要求1所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：每支冻存管中细胞冻存密度为105-106个细胞。
3.根据权利要求1所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。
4.根据权利要求1所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。
5.根据权利要求1所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉2-5份、壳聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、维生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基础培养基80-90份。
6.根据权利要求4或5所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠12-25份、丙酮酸钠10-16份、丝胶蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙 0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛 0.3-0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亚麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
7.根据权利要求6所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
8.根据权利要求7所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
9.根据权利要求8所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。
10.根据权利要求9所述的高存活率的细胞冻存方法，其特征在于：所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
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