CN107217031A - 一种高存活率的细胞复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者‑80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有2‑3ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20‑30次，于1000‑1500g/min的转速下离心3‑10min；移去上清液，加入1‑2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打40‑50次，然后均匀的加入到盛有7‑9ml的新鲜培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。本发明所述的高存活率的细胞复苏的方法，其方法合理，应用便捷，复苏后的细胞存活率高，活性好，可以稳定用于生物与健康相关研究。

Description

一种高存活率的细胞复苏方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种高存活率的细胞复苏方法。
背景技术
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。
细胞复苏是培养细胞的一种，是生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术，在研究中往往需要对冻存的细胞进行复苏。尤其随着细胞治疗个性化技术的兴起，体外扩增特殊功效的细胞成了临床前研究以及临床治疗的重点研发项目。具有体外扩增特殊功效的细胞包括由多功能的造血干细胞、T细胞、NK细胞、DC细胞以及CIK细胞等，将这类细胞体外扩增之后再回输到哺乳生物体内，有利于提高机体的造血装置功能：如提升红细胞、免疫细胞等的数量及功能维护、抗肿瘤能力以及免疫防御能力。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种高存活率的细胞复苏方法，用于多种人源以及非人源细胞的培养。
技术方案：本发明提供了一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有2-3ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。本发明所述的高存活率的细胞复苏的方法，其方法合理，应用便捷，复苏后的细胞存活率高，活性好，可以稳定用于生物与健康相关研究。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。培养基组分合理，营养丰富，可以为细胞培养提供更多的营养物（包括生长因子等），细胞生长速度快，细胞状态好。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉2-5份、壳聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、维生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基础培养基80-90份。冻存液组分合理，营养丰富，其中右旋糖酐为渗透性保护液，而N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺则抑制细胞活动和基因表达，维生素C的抗氧化性好，在保证休眠细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠12-25份、丙酮酸钠10-16份、丝胶蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙 0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛 0.3-0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亚麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止复苏的细胞被污染。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
进一步的，上述的高存活率的细胞复苏方法，所述细胞培养皿为10cm细胞培养皿。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
有益效果：本发明所述的高存活率的细胞复苏方法，其方法合理，应用便捷，可以显著减少冻存对细胞的损伤，复苏后的细胞存活率高状态好，细胞边界清晰，细胞生长速度快，可以稳定用于生物与健康相关研究。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有2ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20次，于1000g/min的转速下离心10min；移去上清液，加入1ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打40次，然后均匀的加入到盛有7ml的新鲜培养基的10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉2份、壳聚糖5份、谷胱甘肽2份、维生素C1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1份和基础培养基80份。
另，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠10份、丝胶蛋白5份、氯化钾35份、无水硫酸镁 6份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸 0.3份、肌醇0.8份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙25份、硝酸铁0.2份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.3份、酒石酸胆碱0.6份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.3份、N-异丙基丙烯酰胺0.2份、亚麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1份和去离子水100份。
再，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸3份、甘氨酸1份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸8份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸1份、L-苯丙氨酸2份、L-苏氨酸5份、L-色氨酸1份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
又，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 3份、白介素14 1份、IFN-γ3份和神经白细胞素1份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例2
一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有3ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打30次，于1500g/min的转速下离心3min；移去上清液，加入2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打50次，然后均匀的加入到盛有9ml的新鲜培养基的10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟乙基淀粉5份、壳聚糖10份、谷胱甘肽5份、维生素C4份、右旋糖酐4份、丙二醇2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺 1份和基础培养基90份。
另，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 88份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠16份、丝胶蛋白9份、氯化钾45份、无水硫酸镁 10份、氯化钠78份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸 0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.6份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.4份、丁二酸8份、丁二酸钠16份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.8份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛 0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.4份、亚麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
再，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 10份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸5份、L-盐酸组氨酸 6份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸6份、L-苯丙氨酸8份、L-苏氨酸15份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸9份和L-缬氨酸12份。
又，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子8份、白介素2 8份、白介素4 4份、白介素14 5份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例3
一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有3ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打25次，于1200g/min的转速下离心5min；移去上清液，加入2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打45次，然后均匀的加入到盛有8ml的新鲜培养基的10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜10份、羟乙基淀粉3份、壳聚糖6份、谷胱甘肽3份、维生素C2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基础培养基85份。
另，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 86份、碳酸氢钠18份、丙酮酸钠12份、丝胶蛋白6份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、叶酸 0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛0.4份、N-异丙基丙烯酰胺0.3份、亚麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚红钠1.2份和去离子水100份。
再，所述基础培养基还包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 8份、L-盐酸胱氨酸 6份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸10份、L-盐酸赖氨酸15份、L-甲硫氨酸3份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸9份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸6份和L-缬氨酸9份。
又，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子6份、白介素2 5份、白介素4 4份、白介素14 5份、IFN-γ5份和神经白细胞素3份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例4
一种高存活率的细胞复苏方法，包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有2ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打30次，于1000g/min的转速下离心8min；移去上清液，加入2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打50次，然后均匀的加入到盛有7ml的新鲜培养基的10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟乙基淀粉2份、壳聚糖6份、谷胱甘肽3份、维生素C1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基础培养基90份。
另，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠12份、丝胶蛋白6份、氯化钾45份、无水硫酸镁 6份、氯化钠72份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸 0.3份、肌醇1份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.3份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛0.4份、N-异丙基丙烯酰胺0.4份、亚麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
再，所述基础培养基还包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸5份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸10份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
又，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 8份、白介素4 3份、白介素14 4份、IFN-γ5份和神经白细胞素2份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：将冻存的细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有细胞冻存液的细胞液完全融化，将细胞液加入到盛有2-3ml新鲜培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述细胞冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉2-5份、壳聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、维生素C1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、N-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基础培养基80-90份。
4.根据权利要求2或3所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠12-25份、丙酮酸钠10-16份、丝胶蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙 0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛 0.3-0.5份、N-异丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亚麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
5.根据权利要求4所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
6.根据权利要求5所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
7.根据权利要求6所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。
8.根据权利要求7所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
9.根据权利要求1所述的高存活率的细胞复苏方法，其特征在于：所述细胞培养皿为10cm细胞培养皿。
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