CN107151650A - 一种Vero细胞的复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Vero细胞的复苏方法，将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者‑80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2‑3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20‑30次，于1000‑1500g/min的转速下离心3‑10min；移去上清液，加入1‑2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40‑50次，然后均匀的加入到盛有7‑9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

Description

一种Vero细胞的复苏方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种Vero细胞的复苏方法。
背景技术
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。细胞复苏是培养细胞的一种，是生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术，在研究中往往需要对冻存的细胞进行复苏，从而进行体内外的相关研究。
Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“O”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。
除了常规的科研需要之外，经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产。因此，Vero细胞的应用前景以及需求量极大。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种Vero细胞的复苏方法。
技术方案：本发明提供了一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2-3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养；所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、维生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8-2份和基础培养基80-90份。本发明所述的Vero细胞的复苏方法，方法合理，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的Vero细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。其中，Vero细胞专用冻存液对细胞损伤小，20%甘露醇为渗透性保护液，而(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷则抑制细胞活动和基因表达，维生素E的抗氧化性好，在保证休眠Vero细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述Vero细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。Vero细胞专用培养基，组分合理，可以进一步为复苏的细胞的提供营养物质。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠 10-20份、丙酮酸钠8-18份、人血白蛋白2-10份、氯化钾30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、PHA-植物血球凝集素0.2-1份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、还原谷胱甘肽 0.1-0.8份、胆固醇1-5份、抗坏血酸磷酸酯0.5-1.2份、聚碳酸酯0.3-1.5份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。基础培养基组分合理，营养丰富，富含生长因子，可以为Vero细胞培养提供更多的营养物，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度佳，用于Vero细胞的培养以及研究。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，以重量组分计，所述基础培养基还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止复苏的细胞被污染。
进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
有益效果：本发明所述的Vero细胞的复苏方法，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的Vero细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20次，于1000g/min的转速下离心10min；移去上清液，加入1ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40次，然后均匀的加入到盛有7ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉3份、葡萄糖5份、维生素E1份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8份和基础培养基80份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80份、碳酸氢钠 10份、丙酮酸钠8份、人血白蛋白2份、氯化钾 30份、无水硫酸镁 5份、氯化钠60份、无水磷酸二氢钠 8份、PHA-植物血球凝集素0.2份、叶酸 0.2份、肌醇0.5份、烟酰胺0.2份、无水氯化钙20份、硝酸铁0.1份、丁二酸 5份、丁二酸钠9份、D-泛酸钙 0.2份、酒石酸胆碱0.5份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.1份、盐酸吡哆辛 0.1份、还原谷胱甘肽 0.1份、胆固醇1份、抗坏血酸磷酸酯0.5份、聚碳酸酯0.3份、酚红钠0.8份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸3份、甘氨酸1份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸8份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸1份、L-苯丙氨酸2份、L-苏氨酸5份、L-色氨酸1份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 3份、白介素14 1份、IFN-γ3份和神经白细胞素1份。
此外，以重量组分计，所述基础培养基还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例2
一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打30次，于1500g/min的转速下离心3min；移去上清液，加入2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打50次，然后均匀的加入到盛有9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟乙基淀粉8份、葡萄糖15份、维生素E5份、20%甘露醇10份、丙二醇2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷2份和基础培养基90份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 90份、碳酸氢钠 20份、丙酮酸钠18份、人血白蛋白10份、氯化钾 50份、无水硫酸镁12份、氯化钠80份、无水磷酸二氢钠16份、PHA-植物血球凝集素1份、叶酸 0.6份、肌醇1.5份、烟酰胺0.8份、无水氯化钙40份、硝酸铁0.5份、丁二酸 10份、丁二酸钠18份、D-泛酸钙 0.8份、酒石酸胆碱1份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.5份、盐酸吡哆辛 0.6份、还原谷胱甘肽 0.8份、胆固醇5份、抗坏血酸磷酸酯1.2份、聚碳酸酯1.5份、酚红钠1.5份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 10份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸5份、L-盐酸组氨酸 6份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸6份、L-苯丙氨酸8份、L-苏氨酸15份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸9份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子10份、白介素2 8份、白介素4 6份、白介素14 5份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，以重量组分计，所述基础培养基还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例3
一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打25次，于1200g/min的转速下离心6min；移去上清液，加入2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打45次，然后均匀的加入到盛有8ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜12份、羟乙基淀粉5份、葡萄糖12份、维生素E3份、20%甘露醇8份、丙二醇1.5份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1.2份和基础培养基88份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 86份、碳酸氢钠 18份、丙酮酸钠12份、人血白蛋白6份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、PHA-植物血球凝集素0.5份、叶酸 0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛 0.4份、还原谷胱甘肽 0.5份、胆固醇3份、抗坏血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.8份、酚红钠1.2份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 8份、L-盐酸胱氨酸 6份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸10份、L-盐酸赖氨酸15份、L-甲硫氨酸3份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸9份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸6份和L-缬氨酸9份。
再，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子8份、白介素2 6份、白介素4 4份、白介素14 3份、IFN-γ5份和神经白细胞素2份。
此外，以重量组分计，所述基础培养基还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例4
一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打30次，于1400g/min的转速下离心4min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40次，然后均匀的加入到盛有9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉8份、葡萄糖9份、维生素E5份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1.6份和基础培养基85份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 88份、碳酸氢钠 12份、丙酮酸钠12份、人血白蛋白6份、氯化钾35份、无水硫酸镁 10份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠14份、PHA-植物血球凝集素0.4份、叶酸 0.4份、肌醇0.9份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙28份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.5份、还原谷胱甘肽 0.6份、胆固醇3份、抗坏血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.4份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸4份、L-苯丙氨酸5份、L-苏氨酸8份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括4份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 5份、白介素14 3份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，以重量组分计，所述基础培养基还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种Vero细胞的复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2-3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养；所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、维生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8-2份和基础培养基80-90份。
2.根据权利要求1所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述Vero细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。
3.根据权利要求1或2所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠 10-20份、丙酮酸钠8-18份、人血白蛋白2-10份、氯化钾 30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、PHA-植物血球凝集素0.2-1份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、还原谷胱甘肽 0.1-0.8份、胆固醇1-5份、抗坏血酸磷酸酯0.5-1.2份、聚碳酸酯0.3-1.5份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份。
4.根据权利要求3所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
5.根据权利要求4所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
6.根据权利要求5所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。
7.根据权利要求6所述的Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
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