CN107164311A - 一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者‑80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有7‑9ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿3‑5下，于37℃，5%CO2培养箱中培养，复苏操作简单、快捷，复苏速度快，效率高。

Description

一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法。
背景技术
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。细胞复苏是培养细胞的一种，是生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术，在研究中往往需要对冻存的细胞进行复苏，从而进行体内外的相关研究。
Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“O”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。
除了常规的科研需要之外，经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产。因此，Vero细胞的应用前景以及需求量极大。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法。
技术方案：本发明提供了一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有7-9ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿3-5下，于37℃，5%CO2培养箱中培养；所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、维生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8-2份和基础培养基80-90份。本发明所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，复苏操作简单、快捷，复苏速度快，效率高，复苏后的Vero细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。其中，Vero细胞专用冻存液对细胞损伤小， 20%甘露醇为渗透性保护液，而(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷则抑制细胞活动和基因表达，维生素E的抗氧化性好，在保证休眠Vero细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述Vero细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。Vero细胞专用培养基，组分合理，可以进一步为复苏的细胞的提供营养物质。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠 12-25份、丙酮酸钠10-16份、人血白蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、PHA-植物血球凝集素0.4-0.8份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙 0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛 0.3-0.5份、还原谷胱甘肽 0.2-0.6份、胆固醇2-4份、抗坏血酸磷酸酯0.6-1份、聚碳酸酯0.4-0.9份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。基础培养基组分合理，营养丰富，富含生长因子，可以为Vero细胞培养提供更多的营养物，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度佳，用于Vero细胞的培养以及研究。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止复苏的细胞被污染。
进一步的，上述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
有益效果：本发明所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，复苏操作简单、快捷，复苏速度快，效率高，复苏后的Vero细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有7ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿3下，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉3份、葡萄糖5份、维生素E1份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8份和基础培养基80份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠10份、人血白蛋白5份、氯化钾35份、无水硫酸镁 6份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、PHA-植物血球凝集素0.4份、叶酸 0.3份、肌醇0.8份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙25份、硝酸铁0.2份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.3份、酒石酸胆碱0.6份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.3份、还原谷胱甘肽 0.2份、胆固醇2份、抗坏血酸磷酸酯0.6份、聚碳酸酯0.4份、酚红钠1份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸3份、甘氨酸1份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸8份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸1份、L-苯丙氨酸2份、L-苏氨酸5份、L-色氨酸1份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 3份、白介素14 1份、IFN-γ3份和神经白细胞素1份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例2
一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有9ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿5下，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟乙基淀粉8份、葡萄糖15份、维生素E5份、20%甘露醇10份、丙二醇2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷2份和基础培养基90份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 88份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠16份、人血白蛋白9份、氯化钾45份、无水硫酸镁 10份、氯化钠78份、无水磷酸二氢钠14份、PHA-植物血球凝集素0.8份、叶酸 0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.6份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.4份、丁二酸8份、丁二酸钠16份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.8份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛 0.5份、还原谷胱甘肽 0.6份、胆固醇4份、抗坏血酸磷酸酯1份、聚碳酸酯0.9份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 10份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸5份、L-盐酸组氨酸 6份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸6份、L-苯丙氨酸8份、L-苏氨酸15份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸9份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子10份、白介素2 8份、白介素4 6份、白介素14 5份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例3
一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有8ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿4下，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜12份、羟乙基淀粉5份、葡萄糖12份、维生素E3份、20%甘露醇8份、丙二醇1.5份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1.2份和基础培养基88份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 86份、碳酸氢钠18份、丙酮酸钠12份、人血白蛋白6份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、PHA-植物血球凝集素0.5份、叶酸 0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛 0.4份、还原谷胱甘肽 0.5份、胆固醇3份、抗坏血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.8份、酚红钠1.2份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 8份、L-盐酸胱氨酸 6份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸10份、L-盐酸赖氨酸15份、L-甲硫氨酸3份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸9份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸6份和L-缬氨酸9份。
再，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子8份、白介素2 6份、白介素4 4份、白介素14 3份、IFN-γ5份和神经白细胞素2份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例4
一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有7ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿5下，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
其中，所述Vero细胞专用培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉8份、葡萄糖9份、维生素E5份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1.6份和基础培养基85份。
进一步的，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 88份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠12份、人血白蛋白6份、氯化钾35份、无水硫酸镁 10份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠14份、PHA-植物血球凝集素0.4份、叶酸 0.4份、肌醇0.9份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙28份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、D-泛酸钙 0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.5份、还原谷胱甘肽 0.6份、胆固醇3份、抗坏血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.4份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸4份、L-苯丙氨酸5份、L-苏氨酸8份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括4份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 5份、白介素14 3份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化，将Vero细胞液均匀加入到盛有7-9ml新鲜的Vero细胞专用培养基的细胞培养皿中，顺时针摇晃细胞培养皿3-5下，于37℃，5%CO2培养箱中培养；所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、维生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8-2份和基础培养基80-90份。
2.根据权利要求1所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述Vero细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。
3.根据权利要求1或2所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82-88份、碳酸氢钠 12-25份、丙酮酸钠10-16份、人血白蛋白5-9份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁 6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、PHA-植物血球凝集素0.4-0.8份、叶酸 0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、D-泛酸钙0.3-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛0.3-0.5份、还原谷胱甘肽 0.2-0.6份、胆固醇2-4份、抗坏血酸磷酸酯0.6-1份、聚碳酸酯0.4-0.9份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
4.根据权利要求3所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
5.根据权利要求4所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
6.根据权利要求5所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。
7.根据权利要求6所述的便捷、快速Vero细胞的复苏方法，其特征在于：所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
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