CN107217027A - 一种高营养细胞扩大培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高营养细胞扩大培养的方法，用移液枪将培养基吸尽，加入3‑5ml PBS洗涤细胞2‑3次，向细胞培养皿中加入1‑2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3‑5min，加入2‑3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40‑50次；将液体移至细胞离心管中，在1000‑1500g/min条件下离心3‑10min，用移液枪去除上清液，加入2‑3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞40‑50次；平均加入到3‑8个细胞培养皿中，进行扩大培养。方法合理，易于实现，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度佳，可以有利于生物与健康相关研究。

Description

一种高营养细胞扩大培养的方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种高营养细胞扩大培养的方法。
背景技术
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。
细胞培养作为生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术。尤其随着细胞治疗个性化技术的兴起，体外扩增特殊功效的细胞成了临床前研究以及临床治疗的重点研发项目。具有体外扩增特殊功效的细胞包括由多功能的造血干细胞、T细胞、NK细胞、DC细胞以及CIK细胞等，将这类细胞体外扩增之后再回输到哺乳生物体内，有利于提高机体的造血装置功能：如提升红细胞、免疫细胞等的数量及功能维护、抗肿瘤能力以及免疫防御能力。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种高营养细胞扩大培养的方法，用于多种人源以及非人源细胞的培养。
技术方案：本发明提供了一种高营养细胞扩大培养的方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3-5ml PBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3-5min，加入2-3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1500g/min条件下离心3-10min，用移液枪去除上清液，加入2-3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞40-50次；平均加入到3-8个细胞培养皿中，进行扩大培养。本发明所述的高营养细胞扩大培养的方法，方法合理，易于实现，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度佳，可以有利于生物与健康相关研究。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。可以与胰蛋白酶相配合，迅速使贴壁细胞脱离培养皿，减少胰蛋白酶对细胞的损伤。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以进一步为培养的细胞提供营养物质，同时还能终止胰蛋白酶的消化作用。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠10-20份、丙酮酸钠8-18份、丝胶蛋白3-12份、氯化钾 30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、N-异丙基丙烯酰胺0.1-0.5份、亚麻酸0.3-3份、乙醇胺0.5-0.8份、芳香酸酯0.2-0.9份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份。基础培养基组分合理，营养丰富，可以为细胞培养提供更多的营养物。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止培养细胞被污染。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
进一步的，上述的高营养细胞扩大培养的方法，所述细胞培养皿为10cm细胞培养皿。
有益效果：本发明所述的高营养细胞扩大培养的方法，方法合理，易于实现，培养基可以为细胞培养提供更多的营养物（包括生长因子等），细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度更佳，可以有利于生物与健康相关研究。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种高营养细胞扩大培养的方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3mlPBS洗涤细胞3次，向10cm细胞培养皿中加入1ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3min，加入2ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40次；将液体移至细胞离心管中，在1000g/min条件下离心10min，用移液枪去除上清液，加入2ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞40次；平均加入到3个细胞培养皿中，进行扩大培养。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。并且，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80份、碳酸氢钠10份、丙酮酸钠8份、丝胶蛋白3份、氯化钾 30份、无水硫酸镁 5份、氯化钠60份、无水磷酸二氢钠 8份、叶酸 0.2份、肌醇0.5份、烟酰胺0.2份、无水氯化钙20份、硝酸铁0.1份、丁二酸 5份、丁二酸钠9份、D-泛酸钙 0.2份、酒石酸胆碱0.5份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.1份、盐酸吡哆辛 0.1份、N-异丙基丙烯酰胺0.1份、亚麻酸0.3份、乙醇胺0.5份、芳香酸酯0.2份、酚红钠0.8份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 3份、L-丝氨酸3份、甘氨酸1份、L-盐酸组氨酸 4份、L-异亮氨酸8份、L-亮氨酸7份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸1份、L-苯丙氨酸2份、L-苏氨酸5份、L-色氨酸1份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 3份、白介素4 3份、白介素14 1份、IFN-γ3份和神经白细胞素1份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。进一步的，所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。
实施例2
一种高营养细胞扩大培养的方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入5mlPBS洗涤细胞2次，向10cm细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化5min，加入3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底50次；将液体移至细胞离心管中，在1500g/min条件下离心3min，用移液枪去除上清液，加入3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞50次；平均加入到8个细胞培养皿中，进行扩大培养。
其中，所述培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。并且，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖90份、碳酸氢钠20份、丙酮酸钠18份、丝胶蛋白12份、氯化钾50份、无水硫酸镁12份、氯化钠80份、无水磷酸二氢钠16份、叶酸 0.6份、肌醇1.5份、烟酰胺0.8份、无水氯化钙40份、硝酸铁0.5份、丁二酸 10份、丁二酸钠18份、D-泛酸钙0.8份、酒石酸胆碱1份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.5份、盐酸吡哆辛 0.6份、N-异丙基丙烯酰胺0.5份、亚麻酸3份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.9份、酚红钠1.5份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 10份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸5份、L-盐酸组氨酸 6份、L-异亮氨酸20份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸20份、L-甲硫氨酸6份、L-苯丙氨酸8份、L-苏氨酸15份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸9份和L-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子10份、白介素2 8份、白介素4 6份、白介素14 5份、IFN-γ6份和神经白细胞素4份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。进一步的，所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。
实施例3
一种高营养细胞扩大培养的方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入4mlPBS洗涤细胞2-3次，向10cm细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化4min，加入2ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底45次；将液体移至细胞离心管中，在1200g/min条件下离心5min，用移液枪去除上清液，加入3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞45次；平均加入到5个细胞培养皿中，进行扩大培养。
其中，所述培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。并且，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠10份、丝胶蛋白5份、氯化钾35份、无水硫酸镁 6份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸 0.3份、肌醇0.8份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙25份、硝酸铁0.2份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.3份、酒石酸胆碱0.6份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛 0.3份、N-异丙基丙烯酰胺0.2份、亚麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 8份、L-盐酸胱氨酸 6份、L-丝氨酸5份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸10份、L-盐酸赖氨酸15份、L-甲硫氨酸3份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸9份、L-色氨酸2份、L-酪氨酸6份和L-缬氨酸9份。
再，所述基础培养基还包括4份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子6份、白介素2 5份、白介素4 4份、白介素14 5份、IFN-γ5份和神经白细胞素3份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。进一步的，所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。
实施例4
一种高营养细胞扩大培养的方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入5mlPBS洗涤细胞3次，向10cm细胞培养皿中加入2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3min，加入2ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底50次；将液体移至细胞离心管中，在1500g/min条件下离心3min，用移液枪去除上清液，加入3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞50次；平均加入到6个细胞培养皿中，进行扩大培养。
其中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。并且，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 82份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠12份、丝胶蛋白6份、氯化钾45份、无水硫酸镁 6份、氯化钠72份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸 0.3份、肌醇1份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.3份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、D-泛酸钙 0.6份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛 0.4份、N-异丙基丙烯酰胺0.4份、亚麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5份、L-盐酸胱氨酸 8份、L-丝氨酸6份、甘氨酸3份、L-盐酸组氨酸 5份、L-异亮氨酸12份、L-亮氨酸18份、L-盐酸赖氨酸10份、L-甲硫氨酸5份、L-苯丙氨酸4份、L-苏氨酸10份、L-色氨酸3份、L-酪氨酸5份和L-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成重组人碱性成纤维细胞生长因子2份、白介素2 8份、白介素4 3份、白介素14 4份、IFN-γ5份和神经白细胞素2份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。进一步的，所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3-5ml PBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3-5min，加入2-3ml的新鲜培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1500g/min条件下离心3-10min，用移液枪去除上清液，加入2-3ml新鲜培养基，使用移液枪上下吹打细胞40-50次；平均加入到3-8个细胞培养皿中，进行扩大培养。
2.根据权利要求1所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述胰蛋白酶中还包含0.01%的EDTA。
3.根据权利要求1或2所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。
4.根据权利要求3所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠10-20份、丙酮酸钠8-18份、丝胶蛋白3-12份、氯化钾 30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、N-异丙基丙烯酰胺0.1-0.5份、亚麻酸0.3-3份、乙醇胺0.5-0.8份、芳香酸酯0.2-0.9份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份。
5.根据权利要求4所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：L-盐酸精氨酸 5-10份、L-盐酸胱氨酸 3-8份、L-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、L-盐酸组氨酸 4-6份、L-异亮氨酸8-20份、L-亮氨酸7-18份、L-盐酸赖氨酸10-20份、L-甲硫氨酸1-6份、L-苯丙氨酸2-8份、L-苏氨酸5-15份、L-色氨酸1-3份、L-酪氨酸5-9份和L-缬氨酸8-12份。
6.根据权利要求5所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：重组人碱性成纤维细胞生长因子2-10份、白介素2 3-8份、白介素4 3-6份、白介素14 1-5份、IFN-γ3-6份和神经白细胞素1-4份。
7.根据权利要求6所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。
8.根据权利要求7所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述青霉素选自10000U/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
9.根据权利要求1所述的高营养细胞扩大培养的方法，其特征在于：所述细胞培养皿为10cm细胞培养皿。
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