CN110547291A - 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂 - Google Patents

一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110547291A
CN110547291A CN201910939412.4A CN201910939412A CN110547291A CN 110547291 A CN110547291 A CN 110547291A CN 201910939412 A CN201910939412 A CN 201910939412A CN 110547291 A CN110547291 A CN 110547291A
Authority
CN
China
Prior art keywords
melatonin
human
solution
ovum
mol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910939412.4A
Other languages
English (en)
Inventor
章志国
丁丁
穆耀琴
邹慧娟
邹薇薇
陈蓓丽
周平
魏兆莲
曹云霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Original Assignee
Anhui Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Medical University filed Critical Anhui Medical University
Priority to CN201910939412.4A priority Critical patent/CN110547291A/zh
Publication of CN110547291A publication Critical patent/CN110547291A/zh
Priority to PCT/CN2020/088708 priority patent/WO2021031614A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液‑1、稀释液‑2和清洗液。本发明联合应用了丙二醇和乙二醇两种渗透性冷冻保护剂、海藻糖非渗透性保护剂以及褪黑素(melatonin)抗氧化剂。本发明在人卵母细胞冷冻保护剂中添加具备高效抗氧化特性的褪黑素，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平以及钙离子水平，具备保护线粒体功能，防止了人卵子在冻融过程中所遭受的氧化损伤，进而有效地保护了冻融后的人卵子质量。

Description

一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂
技术领域
本发明涉及一种高效抗氧化的人类卵母细胞冷冻保护剂，属于生殖医学工程领域。
背景技术
2006年1月，我国首例、全球第二例“三冻(冻卵、冻精、冻胚胎，再解冻移植入母体子宫内)”试管婴儿在北京大学第三医院诞生。目前，中国ART(辅助生殖技术)衍生技术的应用范围和技术水准已处于世界前列。随着全球性不孕人口上升，女性育龄的推迟、癌症患者的增加，女性生育能力保存的需求也日益增加。卵子冷冻技术也已逐步应用于临床，与冷冻胚胎相比较，冷冻卵子一方面可使许多宗教、法律及伦理问题得以解决，另一方面对于因生殖系统疾病导致卵巢功能损伤甚至散失的妇女，如早发性卵巢衰竭、子宫内膜异位症及接受化学治疗或放射线治疗恶性肿瘤的患者，卵子冷冻是保存此类妇女生育能力的有效途径[1]。
尽管人类卵子冷冻技术近年来取得了较大的突破，成活率大大提高，但人卵子冷冻至今仍未能像胚胎及精子冷冻在辅助生殖技术领域常规开展[2]。根本原因是冷冻过程中累积的氧自由基使卵子的氧化-抗氧化系统失衡，造成卵母细胞的氧化应激[3]。这种氧化应激使卵子的胞浆松散、颗粒化、含泡率升高等结构改变，以及线粒体的膜电位降低、胞内钙离子水平升高[4-5]，这种细胞结构和功能的改变会造成冻融后的人卵子质量下降，导致人卵子冷冻技术进展较为缓慢。因此开发一种更加高效安全的人类卵子冷冻保护剂是解决人类卵子冷冻效果低下的唯一路径。
目前，没有一种人卵子冷冻保护剂具备高效的抗氧化特性，现有的人卵子冷冻保护剂仅包含非渗透性保护剂和/或渗透性保护剂。冷冻保护剂的广泛使用旨在防止人卵子遭受冷冻损伤。其中，氧化损伤是最主要的冷冻损伤之一，这种损伤不仅造成了人卵母细胞结构和功能的不可逆损伤，而且使其复苏率和发育潜能大大降低[5-6]。氧化损伤主要表现为细胞内氧自由基水平以及钙离子水平的升高，进而引发线粒体功能的损伤，最终导致细胞功能的严重损伤或丧失[7-8]。
迄今为止，生殖界仍没有一种人类卵子冷冻保护剂具备高效地抗氧化特性，现有的人卵子冷冻保护剂仅包含非渗透性保护剂和渗透性抵抗剂，现有的保护剂无法防止人卵子在冻融过程中所遭受的氧化损伤，这种损伤不仅造成了人卵母细胞结构和功能的不可逆损伤，而且使其复苏率和发育潜能大大降低，严重阻碍了在辅助生殖技术领域常规开展。再者，虽然有报道采用褪黑素在其他实验动物如小鼠卵细胞培养方面具备一定应用，但其研究仅限于某一方面或者其所要研究的方面而非卵母细胞冷冻损伤的防护研究；并且人卵母细胞样本相对于实验动物样本更加难以获取，这就给人卵母细胞的研究造成了较大困难，即使能够获取足够量的人卵母细胞样本，也会因为种属间的差异，如卵母细胞的直径大小，卵胞膜渗透性及弹性等参数的完全不同导致动物样本的实验结果与人的结果存在本质差异，即动物的研究结果不能直接用于人类样本。另外，迄今为止，没有关于褪黑素应用于人卵母细胞冷冻方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具备高效抗氧化特性的人类卵母细胞冷冻保护剂，该保护剂在常用的人类卵母细胞冷冻保护剂的基础上添加内源性的高效抗氧化剂褪黑素(melatonin)，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平、保护线粒体的功能，进而有效地保护了冻融后的人卵子质量。
本发明所提供的一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液：60％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+10％PROH(V/V)+10％EG(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
冷冻液：40％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+20％PROH(V/V)+20％EG(V/V)+0.65mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+1.0mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-1：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+0.5mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-2：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+0.2mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
清洗液：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)。
所述缓冲液选自HTF 1024(SAGE,USA)、HTF1023(SAGE,USA)、GMOPS(Vitrolife,Sweden)或DPBS(SAGE,USA)。
所述人血清替代物选自SPS(SAGE,USA)、SSS(IrovineScientific，USA)或HAS(Vitrolife,Sweden)，更优选SSS(IrovineScientific，USA)。
缓冲液涵盖HTF 1024(SAGE,USA)、HTF1023(SAGE,USA)、GMOPS(Vitrolife,Sweden)及DPBS(SAGE,USA)等；人血清替代物涵盖SPS(SAGE,USA)、SSS(IrovineScientific，USA)及HSA(Vitrolife,Sweden)；PROH(1，2-Propanediol，MERCK，USA)；EG(Ethylene glycol，MERCK，USA)；海藻糖(Trehalose，α-D-glucopyranosylα-D-glucopyranoside，C12H22O11≥99.0，FLUKA，USA)；褪黑素(SIGMA)。另V/V代表体积比。
以冷冻液(VM)为例(其他溶液的配制同此)，其配制方法为，按缓冲液、人血清替代物、PROH、EG的体积比4：2：2：2配成混合液，以该配比的混合液来配制含海藻糖0.65mol/L和褪黑素10-9mol/L的溶液即可。
本发明联合应用了丙二醇和乙二醇两种渗透性冷冻保护剂、海藻糖非渗透性保护剂以及褪黑素(melatonin)作为抗氧化剂开发了本发明。迄今为止，生殖界仍没有一款人类卵子冷冻保护剂含有抗氧化物质成分，现有的人卵子冷冻保护剂仅包含非渗透性保护剂和渗透性抵抗剂，无法防止人卵子在冻融过程中所遭受的氧化损伤。本发明在人卵母细胞冷冻保护剂中添加具备高效抗氧化特性的褪黑素，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平以及钙离子水平，具备保护线粒体功能，防止了人卵母细胞在冻融过程中所遭受的氧化损伤，进而有效地保护了冻融后的人卵子质量。
附图说明
图1：不同浓度的褪黑素对冻融后人卵母细胞结构的影响(箭头所示为卵子胞浆空泡)。
图2：不同浓度的褪黑素对冻融后人卵母细胞内ROS水平的影响；(A)用DCFH试剂盒染色人卵母细胞的荧光图(绿色荧光强度由强到弱依次为0＞10-5＞10-7＞10-9)；(B)褪黑素对人卵母细胞内ROS水平的影响。*代表组间差异有显着性(P<0.05)。
图3：不同浓度的褪黑素对冻融后人卵母细胞线粒体膜电位的影响。(A)用JC-1试剂盒染色人卵母细胞的荧光图(从上到下第一排显红色荧光，第二排显绿色荧光，第三排显黄色荧光)；(B)褪黑素对人卵母细胞线粒体膜电位的影响。*代表组间差异有显着性(P<0.05)。
图4：不同浓度的褪黑素对冻融后人卵母细胞内钙离子浓度的影响。(A)用Fluo-4AM试剂盒染色人卵母细胞的荧光图(绿色荧光强度由强到弱依次为0＞10-5＞10-7＞10-9)；(B)褪黑素对人卵母细胞内钙离子的影响。*代表组间差异有显着性(P<0.05)。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
本发明的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
平衡液(EM)：60％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+10％PROH(V/V)+10％EG(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
冷冻液(VM)：40％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+20％PROH(V/V)+20％EG(V/V)+0.65mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液(TM)：80％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+1.0mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-1(DM-1)：80％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+0.5mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-2(DM-2)：80％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+0.2mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
清洗液(WM)：80％HTF 1024(V/V)+20％SSS(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)。
对比例
仅调整褪黑素(melatonin)浓度分别为0、10-7mol/L、10-5mol/L，其他同实施例1。
人卵母细胞冻融技术的实施如下：
由安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心从受试者为来我们中心寻求IVF/ICSI治疗的不孕症患者，年龄均小于35岁。收集废弃的未成熟人卵母细胞(MI/GV)于体外培养24小时，随后体外成熟的人卵母细胞行冷冻-解冻过程。
冷冻过程:
将人卵母细胞移至平衡液(EM)，放置15min后,转移至冷冻液(VM)液中1min，随后将人卵母细胞转移至特定的载体上并迅速投入液氮,最后再将含有人卵母细胞的载体移入液氮罐中-196℃保存。
解冻过程:
冷冻2周后，将含人卵母细胞的载体从液氮罐中取出，迅速将载体插入复苏液(TM)中，人卵母细胞在TM液中自动脱落，快速将人卵母细胞转移至稀释液-1(DM-1)，室温下放置3min后依次转至稀释液-2(DM-2)和清洗液，各3min，最后，人卵母细胞被移入配子培养液，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。
(2)冻融后的人卵子结构与功能检测的实施如下：
形态学检测：
冻融后的人卵母细胞体外培养2-2.5小时后，在倒置电子显微镜下观察形态并拍照记录。
细胞内ROS水平检测：
使用DCFH试剂盒测定活人卵母细胞中的ROS水平。冻融后的人卵母细胞体外培养2-2.5小时后，在预热的1X PBS中洗涤。然后用10μmol/L DCFHDA溶液染色，在37℃、5％CO2的环境下避光处理20分钟。在1X PBS中洗涤三次后将人卵母细胞转移至玻璃皿中，立即在Zeiss倒置共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。绿色荧光的强度代表细胞内ROS的水平，图片用共聚焦显微镜图像处理系统分析。
线粒体膜电位检测：
根据制造商的说明，使用JC-1测定试剂盒评估线粒体膜电位。人卵母细胞体外培养2-2.5小时，用预热的0.1％PVA/PBS洗涤冻融的人卵母细胞，并用5％CO2中的8μmol/LJC-1溶液染色，在37℃、5％CO2的环境下避光孵育30分钟。为了消除自发荧光对实验的影响，在每个实验中选择一个人卵母细胞作为阴性对照，并用1XBuffer缓冲液处理。再次洗涤人卵母细胞，立即在Zeiss倒置共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。线粒体膜电位用红色荧光与绿色荧光的比率表示，图片用共聚焦显微镜图像处理系统分析。
细胞内钙离子水平检测：
根据制造商的说明，使用Fluo4 AM试剂盒评估细胞内钙浓度。人卵母细胞体外培养2-2.5小时，将冻融的人卵母细胞在预热的1X PBS中洗涤三次，并用5μmol/L Fluo4 AM溶液染色，在37℃、5％CO2的环境下避光处理30分钟。用1X PBS处理阴性对照组人卵母细胞，再次洗涤所有的人卵母细胞，并避光孵育15-30分钟，立即在Zeiss倒置共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。绿色荧光的强度代表细胞内钙离子的浓度。荧光强度越弱，钙离子浓度越低，图片用共聚焦显微镜图像处理系统分析。
目前，本发明相关实验已在安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心完成。实验研究及结果如下：
褪黑素未处理组(褪黑素浓度为0)：本例共收集人卵母细胞53枚，人卵子冻融后，存活51枚，存活率96.23％；
浓度为10-9mol/L褪黑素处理组：共收集人卵母细胞34枚，人卵子冻融后，存活34枚，存活率100％；
浓度为10-7mol/L褪黑素处理组：共收集人卵母细胞38枚，人卵子冻融后，存活38枚，存活率100％；
浓度为10-5mol/L褪黑素处理组：共收集人卵母细胞38枚，人卵子冻融后，存活36枚，存活率94.74％。
如图1所示：不同浓度的褪黑素组之间细胞形态有差异。其中，褪黑素未处理组的人卵母细胞无异常形态出现，胞浆不均质、发黑，胞浆内含有空泡(如箭头所示)及颗粒状暗区，第一极体光滑、完整，呈圆形，透明带及卵周间隙正常；浓度为10-9mol/L褪黑素处理组的人卵母细胞无异常形态出现，胞质清亮、均质，无空泡、碎片，无颗粒状暗区，第一极体光滑、完整，呈圆形，透明带及卵周间隙正常；浓度为10-7mol/L褪黑素处理组的人卵母细胞无异常形态出现，胞质较为清亮、均质，有空泡(如箭头所示)，无碎片，无颗粒状暗区，第一极体光滑、完整，呈圆形，透明带及卵周间隙正常；浓度为10-5mol/L褪黑素处理组的人卵母细胞无异常形态出现,胞浆不均质、较黑，胞浆内含有空泡(如箭头所示)及局部颗粒状暗区，第一极体光滑、完整，呈圆形，透明带，卵周间隙大。
如图2所示：不同浓度的褪黑素组之间细胞内氧自由基水平有差异。其中，浓度为10-9mol/L褪黑素处理组细胞内氧自由基水平最低且明显低于10-5mol/L褪黑素处理组与褪黑素未处理组，有显著性统计学意义(P<0.05)；浓度为10-7mol/L褪黑素处理组细胞内氧自由基水平明显低于10-5mol/L褪黑素处理组与褪黑素未处理组，且有显著性统计学意义(P<0.05)；
如图3所示：不同浓度的褪黑素组之间线粒体膜电位水平有差异。其中，浓度为10- 9mol/L褪黑素处理组的线粒体膜电位水平最高且明显高于褪黑素未处理组，有显著性统计学意义(P<0.05)；浓度为10-7mol/L褪黑素处理组线粒体膜电位水平明显高于褪黑素未处理组，且有显著性统计学意义(P<0.05)；
如图4所示：不同浓度褪黑素组之间细胞内钙离子水平有差异。其中，浓度为10- 9mol/L褪黑素处理细胞内钙离子水平最低且明显低于其他各组，有显著性统计学意义(P<0.05)；浓度为10-7mol/L褪黑素处理组细胞内钙离子水平明显低于褪黑素未处理组，且有显著性统计学意义(P<0.05)。
以上结果表明，在人卵母细胞冷冻保护剂中添加具备高效抗氧化特性的褪黑素且浓度10-9mol/L，不仅抑制了冻融后人卵母细胞胞浆内空泡的形成，而且降低了细胞内的氧自由基水平以及钙离子水平、具备保护线粒体的功能，进而能够有效地保护冻融后的人卵子质量。
参考文献：
1.吴霜,刘婷婷,李文.人类卵母细胞冷冻技术研究进展[J].中国医学前沿杂志,2017,9(08):17-22.
2.Argyle CE,Harper JC and Davies MC.Oocyte cryopreservation:where arewe now？[J].Hum Reprod Update.2016 Jun；22(4):440-9.
3.Zhang Y,Li W,Ma YS,et al.Improved development by melatonintreatment after vitrification of mouse metaphase II oocytes[J].Cryobiology,2016,73,335-342.
4.He,C.；Wang,J.；Zhang,Z,et al.Mitochondria Synthesize Melatonin toAmeliorate Its Function and Improve Mice Oocyte’s Quality under in VitroConditions.[J].Int J Mol Sci.2016 Jun 14；17(6).
5.Zhao XM Hao HS,Du WH,et al.Melatonin inhibits apoptosis andimproves the developmental potential of vitrified bovine oocytes[J].PinealRes.2016 Mar；60(2):132-416.Brambillasca F,Guglielmo MC,Coticchio G,et al.Thecurrent challenges to efficient immature oocyte cryopreservation[J].AssistReprod Genet,30(2013)1531-1539.
7.L.He,T.He,S.Farrar,L.Ji,T.Liu,and X.Ma,'Antioxidants MaintainCellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species',CellPhysiol Biochem,44(2017),532-53.
8.S.Drose,and U.Brandt,'Molecular Mechanisms of Superoxide Productionby the Mitochondrial Respiratory Chain',Adv Exp Med Biol,748(2012),145-69.

Claims (3)

1.一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，其特征在于，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液：60％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+10％PROH(V/V)+10％EG(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
冷冻液：40％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+20％PROH(V/V)+20％EG(V/V)+0.65mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+1.0mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-1：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+0.5mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
稀释液-2：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+0.2mol/L海藻糖+10-9mol/L褪黑素(melatonin)，
清洗液：80％缓冲液(V/V)+20％人血清替代物(V/V)+10-9mol/L褪黑素(melatonin)。
2.如权利要求1所述高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，其特征在于，所述缓冲液选自HTF 1024(SAGE,USA)、HTF1023(SAGE,USA)、GMOPS(Vitrolife,Sweden)或DPBS(SAGE,USA)。
3.如权利要求1所述高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂，其特征在于，所述人血清替代物选自SPS(SAGE,USA)、SSS(IrovineScientific，USA)或HSA(Vitrolife,Sweden)。
CN201910939412.4A 2019-09-27 2019-09-27 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂 Pending CN110547291A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910939412.4A CN110547291A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂
PCT/CN2020/088708 WO2021031614A1 (zh) 2019-09-27 2020-05-06 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910939412.4A CN110547291A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110547291A true CN110547291A (zh) 2019-12-10

Family

ID=68742068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910939412.4A Pending CN110547291A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110547291A (zh)
WO (1) WO2021031614A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021031614A1 (zh) * 2019-09-27 2021-02-25 安徽医科大学第一附属医院 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂
CN112655702A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 青岛奥克生物开发有限公司 一种脐带间充质干细胞用溶液、脐带间充质干细胞制剂及制备方法和应用
CN115590017A (zh) * 2022-11-04 2023-01-13 中国农业大学（Cn） 一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104663649A (zh) * 2015-02-13 2015-06-03 安徽医科大学 人类卵母细胞冷冻保护剂
CN104886040A (zh) * 2015-03-18 2015-09-09 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能的方法
WO2016044271A2 (en) * 2014-09-15 2016-03-24 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
CN107372460A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 漳州傲农现代农业开发有限公司 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用
KR20180088071A (ko) * 2017-01-26 2018-08-03 중앙대학교 산학협력단 멜라토닌을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법
CN108812646A (zh) * 2018-08-01 2018-11-16 公安部南昌警犬基地 一种犬精液冷藏保存稀释液
CN110257321A (zh) * 2019-08-01 2019-09-20 四川农业大学 一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法
CN111838131A (zh) * 2020-07-16 2020-10-30 浙江大学 一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103651330A (zh) * 2012-09-21 2014-03-26 临沂思科生物科技有限公司 具有生物活性的动物精液保存剂及其制备方法
CN104054697B (zh) * 2014-07-07 2015-10-28 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用
CN107384854B (zh) * 2017-08-16 2020-01-07 安徽医科大学 人类卵母细胞胞浆成熟优化液
CN110547291A (zh) * 2019-09-27 2019-12-10 安徽医科大学 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016044271A2 (en) * 2014-09-15 2016-03-24 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
CN104663649A (zh) * 2015-02-13 2015-06-03 安徽医科大学 人类卵母细胞冷冻保护剂
CN104886040A (zh) * 2015-03-18 2015-09-09 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种高效保护玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体功能的方法
KR20180088071A (ko) * 2017-01-26 2018-08-03 중앙대학교 산학협력단 멜라토닌을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법
CN107372460A (zh) * 2017-07-13 2017-11-24 漳州傲农现代农业开发有限公司 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用
CN108812646A (zh) * 2018-08-01 2018-11-16 公安部南昌警犬基地 一种犬精液冷藏保存稀释液
CN110257321A (zh) * 2019-08-01 2019-09-20 四川农业大学 一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法
CN111838131A (zh) * 2020-07-16 2020-10-30 浙江大学 一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARGYLE CE 等: "Oocyte cryopreservation：where are we now？", 《HUM REPROD UPDATE》 *
MH KARIMFAR 等: "The protective effects of melatonin", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOPATHOLOGY AND PHARMACOLOGY》 *
刘婷婷，章志国，曹云霞: "褪黑素在卵母细胞发育中的作用及体外成熟培养中的应用", 《国际生殖健康/计划生育杂志》 *
霍敏 等: "褪黑素对绒山羊精液冷冻保存效果的影响", 《黑龙江畜牧兽医》 *
高明 等: "褪黑素对ICSI 周期中人未成熟卵母细胞体外成熟结果的影响", 《安徽医科大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021031614A1 (zh) * 2019-09-27 2021-02-25 安徽医科大学第一附属医院 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂
CN112655702A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 青岛奥克生物开发有限公司 一种脐带间充质干细胞用溶液、脐带间充质干细胞制剂及制备方法和应用
CN115590017A (zh) * 2022-11-04 2023-01-13 中国农业大学（Cn） 一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法
CN115590017B (zh) * 2022-11-04 2023-09-12 中国农业大学 一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021031614A1 (zh) 2021-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110547291A (zh) 一种高效抗氧化的人卵母细胞冷冻保护剂
Anghel et al. The effects of antioxidants on the cytological parameters of cryopreserved buck semen
Zhang et al. Effects of glutathione on sperm quality during liquid storage in boars
CN104663649B (zh) 人类卵母细胞冷冻保护剂
Ren et al. Lycopene and alpha-lipoic acid improve semen antioxidant enzymes activity and cashmere goat sperm function after cryopreservation
Andreea et al. Role of antioxidant additives in the protection of the cryopreserved semen against free radicals
Tanpradit et al. Positive impact of sucrose supplementation during slow freezing of cat ovarian tissues on cellular viability, follicle morphology, and DNA integrity
Silva et al. Effect of coconut water and Braun-Collins solutions at different temperatures and incubation times on the morphology of goat preantral follicles preserved in vitro
Ahmed et al. Supplementation of green tea extract (GTE) in extender improves structural and functional characteristics, total antioxidant capacity and in vivo fertility of buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa
Satorre et al. Cryopreservation with α-tocopherol and Sephadex filtration improved the quality of boar sperm
Varo-Ghiuru et al. Lutein, trolox, ascorbic acid and combination of trolox with ascorbic acid can improve boar semen quality during cryopreservation
Li et al. Supplemental effect of different levels of taurine in Modena on boar semen quality during liquid preservation at 17 C
Lee et al. Effect of magnetized extender on sperm membrane integrity and development of oocytes in vitro fertilized with liquid storage boar semen
Amstislavsky et al. Embryo cryopreservation and in vitro culture of preimplantation embryos in Campbell's hamster (Phodopus campbelli)
CN110463689A (zh) 一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法
Mahmoud et al. Effects of cysteamine during in vitro maturation on viability and meiotic competence of vitrified buffalo oocytes
Sobhani et al. Antioxidant effects of brown algae Sargassum on sperm parameters: CONSORT-compliant article
Honaramooz Cryopreservation of testicular tissue
Ren et al. Effects of Isatis root polysaccharide on boar sperm quality during liquid storage and in vitro fertilization
Talevi et al. Replacement of sodium with choline in slow-cooling media improves human ovarian tissue cryopreservation
Asr et al. The evaluations of Tris-citrate acid or Bioxcell extenders on the post-thawed buffalo sperm parameters
Nagano et al. Effects of isolation method and pre-treatment with ethylene glycol or raffinose before vitrification on in vitro viability of mouse preantral follicles
Rodríguez-Martínez Sperm biotechnologies in domestic species: state of the art
Park et al. Effects of antioxidants supplement in porcine sperm freezing on in vitro fertilization and the glutathione and reactive oxygen species level of presumptive zygotes
Li et al. Effects of negative pressure on boar semen quality during liquid storage at 17 C

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20201214

Address after: No.218 Jixi Road, Shushan District, Hefei City, Anhui Province

Applicant after: The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University

Address before: 230032 No. 81 Mei Shan Road, Shushan District, Anhui, Hefei

Applicant before: ANHUI MEDICAL University

TA01 Transfer of patent application right