CN113994953A - 一种鸡血藤提取物的应用、精液保存剂及精液的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡血藤提取物的应用、精液保存剂及精液的保存方法，属于生物技术领域。本发明提供的精液保存剂包括基液和鸡血藤提取物，其中，所述鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，鸡血藤提取物在保存精液时的较佳终浓度为0.01mg/mL；该精液保存剂可以用于保存鸡精子等禽类精子。本发明实施例提供了一种精液保存剂，其中的鸡血藤提取物具有抗氧化的作用，具有较高的DPPH自由基清除能力，添加适宜浓度鸡血藤提取物在藏鸡精子冷冻保存的稀释液中后可以显著提高SOD含量、降低MDA水平，提高精子活率，从而提高解冻后精子品质。

Description

一种鸡血藤提取物的应用、精液保存剂及精液的保存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种鸡血藤提取物的应用、精液保存剂及精液的保存方法。

背景技术

品种资源的活体保护、精液的冷冻保存、基因文库、体细胞克隆和分子遗传标记等是家禽遗传资源保护的主要方法。将精液经过采集和处理之后置于超低温状态下进行冷冻并保存是最经济实用的保存畜禽品种资源的方法。目前，在牛、猪和羊以及其他大型家畜的品种资源保护工作中精液冻存法已获得了广泛地应用。由于鸡精液冷冻技术还不够成熟，此项技术一直未大量应用于国内外市场，这是一个国际难题。

藏鸡已在2000年被列入了《世界品种资源保护名录》，为了提升高海拔地区居民的经济水平，藏鸡的活体保护以及采用人工授精的方式培育成为了重点工作。当前藏鸡进行人工授精技术时一般使用刚采集的新鲜精液，但是精子在体外存活的时间太短，暂时还不能达到理想中的保种和大规模繁殖的目的。而冷冻精液可以长时间保存，这项技术可以有效避免时间和空间对精液使用的限制，使得畜禽选育优良品种、杂交和配种可以更好更方便的实现，同时也使优秀的种用公禽和公畜的使用区域得到拓宽、使用时长得到极大地提升、优良遗传资源的长久保存得以实现，其生产性得到了极大的改善。

其中，精液的短期保存是指精液采出后，人们为延长精液在体外的时间，而创造出可以的短时间保存精液的环境以维持精液的受精能力的方法。根据保存温度的不同可以将精液的短期保存具体分为常温保存法和低温保存法。前人将在15～25℃的温度范围内体外保存精子的方法称为常温保存法，将0-5℃温度范围内的精子体外保存方法称为低温保存法。常温保存法一般适用于精液采集后短时间内再次使用，间隔时间短，一般为0.5h，而低温保存法的保存的时间相对于来说比较长。精液的长期保存是指精液在被采出后在体外长期存储以备人工授精及时使用一种方法。超低温保存法是以液氮(-196℃)或者是干冰(-79℃)为冷源对精子进行长期保存方法。此方法通过降低精子生存环境的温度使得精子的代谢速率变缓，从而达到长期保存的目的。液氮保存与干冰保存相比具有成本低廉的优势，因此液氮保存法使用的更加广泛。

然而，冷冻保存对精子会造成以下损伤：1)在精液冷冻过程中由于环境温度降低，精子细胞内部和外部逐渐出现的冰晶对精子细胞造成的损伤称为物理损伤。在精子冷冻过程中，冰晶是不可避免的，冰晶大小影响精子的损坏程度。为了减少冷冻过程中冰晶对精子的损害，应尽量减小冰晶体积，以提高精子的生存能力。2)化学损伤是由精子的渗透压改变引起的，因为低温时精清会先一步发生凝结，会使精子细胞外的渗透压升高，致使精子细胞内水分流失。过多水分的流失会导致精子死亡并降低精子存活率。3)氧化损伤指在精子冷冻解冻的过程中，精子产生大量的活性氧使得ROS平衡状态被打破，过量的活性氧使精子损伤细胞膜结构，从而导致的精子结构损伤，精子存活率降低的现象。

针对上述问题，由于当前由于所采取的降温和升温措施还不够完善，所以在精液冷冻过程中常采取调整稀释液成分(添加抗冻剂)的方式来增强精子的抗冻性，这对避免精子冰晶化具有重要意义，是精液冷冻保存技术的一个重大革新。抗冻剂具有多个羟基，羟基与水形成氢键后会增强保护剂的亲水性。抗冻剂可与细胞水结合或代替细胞脱水，防止细胞内形成冰晶，但现有的抗冻剂在保护精子的同时对精子也有毒性，会影响冷冻效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡血藤提取物的应用、精液保存剂及精液的保存方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种鸡血藤提取物在精子保存中的应用。

优选的，鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物。

鸡血藤被1977年版《中华人民共和国药典》首次收录，规定其为“豆科植物密花豆的干燥藤茎。研究表明鸡血藤具有较强的抗氧化性，且鸡血藤原花青素的抗氧化活性与维生素C不相上下。通过比较鸡血藤提取物与公认的抗氧化剂维生素C的半效浓度发现鸡血藤50％的乙醇提取物对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用分别可以达到维生素C的2倍和1.88倍。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述精子为禽类精子。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述精子为鸡精子，优选为藏鸡精子。

本发明实施例的另一目的在于提供一种精液保存剂，包括基液以及鸡血藤提取物。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述鸡血藤提取物在保存精液时的终浓度为0.005～0.05mg/mL。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述鸡血藤提取物在保存精液时的终浓度为0.008～0.012mg/mL。

优选的，所述鸡血藤提取物在保存精液时的终浓度为0.01mg/mL。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述基液包括精液稀释剂，所述精液稀释剂包括以下按照浓度计的组分：谷氨酸钠18～25mg/mL、葡萄糖6～10mg/mL、乙酸钾4～6mg/mL、四水乙酸镁0.6～1mg/mL、聚乙烯吡咯烷酮2～4mg/mL、青链霉素混合液80～120U/mL。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述基液还包括甘油，所述甘油在保存精液时的终浓度为5～7％v/v。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述精子为禽类精液。

作为本发明实施例的另一个优选方案，精液为鸡精液，优选为藏鸡精液。

本发明实施例的另一目的在于提供一种精液的保存方法，其包括以下步骤：

将精液与精液稀释剂进行同温稀释后，再进行平衡处理，得到平衡稀释后的精液；

将平衡稀释后的精液与上述的精液保存剂进行混合后，再进行低温保存。

作为本发明实施例的另一个优选方案，低温保存的温度为3～5℃。

作为本发明实施例的另一个优选方案，低温保存的环境为液氮环境。

精子只有具备完整的细胞结构，才能进行生理反应，完成受精过程，在体外保存的过程中，尤其需要保护细胞内的结构和生理特征，精子尾部中段被线粒体鞘覆盖，然而线粒体鞘是精子运动的主要能量来源，调节顶体反应能力，顶体的完整性是进行顶体反应和受精的必要条件。精子细胞膜在冷冻-解冻后容易受到氧化的损伤，正常状态下ROS处于动态平衡，精浆中含有自身的抗氧化酶系统，但超过调节能力后，就会对细胞造成损害。研究表明，可以通过向稀释液中添加抗氧化剂来抵御精子体外保存过程中氧化应激对精子细胞的结构和功能造成的损害，提高精子保存效果。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例提供了一种精液保存剂，其中的鸡血藤提取物具有抗氧化的作用，具有较高的DPPH自由基清除能力，添加适宜浓度鸡血藤提取物在藏鸡精子冷冻保存的稀释液中后可以显著提高SOD含量、降低MDA水平，提高精子活率，从而提高解冻后精子品质。

附图说明

图1为不同浓度鸡血藤提取物对DPPH自由基的清除率对比图，数据为Mean±SEM(n＝3)。

图2为新鲜精液稀释100倍后在显微镜下的观察结果图(比例尺：100μm)；图2中，A为新鲜精液稀释100倍后在显微镜下观察到的藏鸡精子形态，B为新鲜精液稀释100倍后经伊红染色后在显微镜下观察所得。

图3为添加不同浓度的鸡血藤提取物对4℃保存藏鸡精子活率的影响结果图，数据为Mean±SEM(n＝3)；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P﹤0.05)。

图4为不同浓度的鸡血藤提取物对4℃保存藏鸡精子抗氧化酶的影响结果图，数据为Mean±SEM(n＝3)；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P﹤0.05)。

图5为添加不同浓度的鸡血藤提取物对冷冻保存藏鸡精子活率的影响结果图，数据为Mean±SEM(n＝3)；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P﹤0.05)。

图6为添加不同浓度的鸡血藤提取物对冷冻保存后藏鸡精子线粒体活性的影响结果图(比例尺：100μm)；图6中，A为空白对照组，B为0.01mg/mL浓度组，C为0.03mg/mL浓度组，D为0.05mg/mL浓度组，E为0.1mg/mL浓度组。

图7为不同浓度的鸡血藤提取物对冷冻保存藏鸡精子抗氧化酶的影响结果图，数据为Mean±SEM(n＝3)；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P﹤0.05)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均可采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将180mg的谷氨酸钠、60mg的葡萄糖、40mg的乙酸钾、6mg的四水乙酸镁、20mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有800U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物和甘油制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.01mg/mL，甘油的浓度为10％v/v；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.005mg/mL，甘油的终浓度为5％v/v，然后置于液氮环境中进行保存。

实施例2

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将250mg的谷氨酸钠、100mg的葡萄糖、60mg的乙酸钾、10mg的四水乙酸镁、40mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1200U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物和甘油制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.1mg/mL，甘油的浓度为14％v/v；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.05mg/mL，甘油的终浓度为7％v/v，然后置于液氮环境中进行保存。

实施例3

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将190mg的谷氨酸钠、70mg的葡萄糖、45mg的乙酸钾、7mg的四水乙酸镁、25mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有900U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物和甘油制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.016mg/mL，甘油的浓度为11％v/v；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.008mg/mL，甘油的终浓度为5.5％v/v，然后置于液氮环境中进行保存。

实施例4

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将220mg的谷氨酸钠、90mg的葡萄糖、55mg的乙酸钾、9mg的四水乙酸镁、35mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1100U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物和甘油制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.024mg/mL，甘油的浓度为13％v/v；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.012mg/mL，甘油的终浓度为6.5％v/v，然后置于液氮环境中进行保存。

实施例5

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将212.5mg的谷氨酸钠、80mg的葡萄糖、50mg的乙酸钾、8mg的四水乙酸镁、30mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1000U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物和甘油制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.02mg/mL，甘油的浓度为12％v/v；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.01mg/mL，甘油的终浓度为6％v/v，然后置于液氮环境中进行保存。

实施例6

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将180mg的谷氨酸钠、60mg的葡萄糖、40mg的乙酸钾、6mg的四水乙酸镁、20mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有800U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入3℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.01mg/mL；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入3℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.005mg/mL，然后置于3℃的冰箱中进行保存。

实施例7

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将250mg的谷氨酸钠、100mg的葡萄糖、60mg的乙酸钾、10mg的四水乙酸镁、40mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1200U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入5℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.1mg/mL；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入5℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.05mg/mL，然后置于5℃的冰箱中进行保存。

实施例8

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将190mg的谷氨酸钠、70mg的葡萄糖、45mg的乙酸钾、7mg的四水乙酸镁、25mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有900U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.016mg/mL；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.008mg/mL，然后置于4℃的冰箱中进行保存。

实施例9

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将220mg的谷氨酸钠、90mg的葡萄糖、55mg的乙酸钾、9mg的四水乙酸镁、35mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1100U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.024mg/mL；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.012mg/mL，然后置于4℃的冰箱中进行保存。

实施例10

该实施例提供了一种禽类精液的保存方法，其包括以下步骤：

S1、将212.5mg的谷氨酸钠、80mg的葡萄糖、50mg的乙酸钾、8mg的四水乙酸镁、30mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1000U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

S2、取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的鸡血藤提取物制成精液保存剂，备用；其中，鸡血藤提取物的浓度为0.02mg/mL；鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物，其具体可以选用陕西横岭天然生物制品有限公司的市售产品。

S3、取上述制成的精液稀释剂置于38℃水浴锅中预热5分钟后，再将其与同体积的待保存的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布；接着，将稀释过的精液放入4℃冰箱中进行平衡处理1h，然后用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口，得到平衡稀释后的精液。

S4、将上述平衡稀释后的精液与上述制成的精液保存剂按照1:1的体积比进行混合，使得鸡血藤提取物的终浓度为0.01mg/mL，然后置于4℃的冰箱中进行保存。

试验例：

鸡血藤是由新鲜的密花豆藤茎遭到破坏后，流出红色的液体，液体似鸡血而得名。关于鸡血藤可以入药的记载，最早是清代的医书作中提起过。清代著名医学家赵学敏在《在本草纲目拾遗》中曾记载：一茎长数十里，土人得之，以刀砍断，则汁出如血，后被世人称之为“血之圣药”。现代人们对鸡血藤的进一步研究发现，其内蕴含的化学成分十分复杂，而且鸡血藤提取物、总黄酮的药理活性均具有多样性。鸡血藤有抗菌消炎、抗氧化、提高血小板活性、预防血栓、抗辐射、补血活血等药理作用。鸡血藤醇提物可以降低小鼠MDA水平，提高小鼠的抗氧化酶SOD的活性，从而促进造血细胞增值分化，实现补血造血、抗氧化、抗辐射的作用。鸡血藤原花青素具备较强的抗氧化性，它的抗氧化性接近维生素C，是一种非常好的氧自由基清除剂。同时，鸡血藤总黄酮可以通过提高机体的抗氧化能力来抑制大鼠实验性脑缺血，对于大鼠脑缺血、急性心肌缺血具有一定的保护作用。现阶段对于精子的体外保存需要很高的要求，例如：温度环境、环境湿度。体外保存过程中会产生过氧化物质，造成过氧化损伤进而引起其他生理损伤，造成精子寿命缩短。为了降低精子体外保存过程中所受的氧化损伤，发掘一种可以添加到精液中的抗氧化物质变得尤为重要。通过研究发现，鸡血藤提取物具有较强的抗氧化能力，可以作为外源抗氧化剂使用，而在藏鸡精子中添加鸡血藤提取物作为保护剂还未报道。所以本发明的下述试验例采用鸡血藤提取物作为抗氧化剂，探究在藏鸡精液稀释液中添加鸡血藤提取物是否可以降低藏鸡精子体外保存过程中出现的氧化损伤，具体的试验过程和结果如下。

一、试验材料：

1、试验动物：本试验选用25周龄的藏鸡，该藏鸡由阿坝州茂县九顶原生态畜禽养殖有限责任公司与阿坝州畜牧科学技术研究所经多年选育获得。由于当地试验条件限制，本试验把藏鸡进行适应两周后开展，试验期间保证所用饲料与养殖场饲料相同，同时保证充足的饮水以及光照条件。

2、主要试剂及耗材：本试验所用的主要试剂及耗材见表1。

表1

试剂及耗材	品牌
		鸡血藤提取物	陕西横岭天然生物制品有限公司
超氧化物歧化酶(SOD)测试盒	南京建成生物工程研究所
		丙二醛(MDA)测试盒	南京建成生物工程研究所
DPPH试剂	梯希爱化成工业发展有限公司
		甘油	上海昂一生物科技有限公司
碘化丙啶(PI)	北京索莱宝生物科技有限公司
		罗丹明(RH123)	北京索莱宝生物科技有限公司
青链霉素混合液	Biosharp公司
		谷氨酸钠	罗恩试剂公司
乙酸钾	罗恩试剂公司
		四水乙酸镁	罗恩试剂公司
葡萄糖	罗恩试剂公司
		聚乙烯吡咯烷酮	罗恩试剂公司
0.25mL冻精细管	卡苏公司
		离心管	Axygen公司
移液枪头	Axygen公司

3、主要仪器及设备：本试验主要仪器见表2。

表2

4、试验所需溶液的配制：

1)精液稀释剂的配制：将212.5mg的谷氨酸钠、80mg的葡萄糖、50mg的乙酸钾、8mg的四水乙酸镁、30mg的聚乙烯吡咯烷酮以及含有1000U青链霉素的青链霉素混合液进行混合后，再用高压灭菌后的蒸馏水进行溶解，并定容至10mL，同时用0.22μm滤膜过滤制成精液稀释剂，放入4℃冰箱中备用。

2)精液冻存液的配制：取上述制成的精液稀释剂，并加入适量的甘油制成精液冻存液，放入4℃冰箱中备用；其中，甘油的浓度为12％v/v；使用时，保证甘油的终浓度为6％。

3)DPPH溶液的配制：称取0.008g的DPPH，用无水乙醇稀释，定容至100mL制成浓度为0.08mg/mL的DPPH溶液，现配现用。

二、试验方法：

1、DPPH自由基清除试验：针对不同浓度鸡血藤提取物的ROS清除活性进行评价，需要采用DPPH法。将1毫升DPPH溶液(0.08mg/mL，在无水乙醇中)分别与1mL不同浓度鸡血藤提取物混匀静置30分钟，使用酶标仪在517nm处读取吸光度，通过以下方程计算：

DPPH的清除率PI＝[(A₀-A₁)/A₀×100％]；

式中，A₀为对照反应的吸光度，A₁为鸡血藤样品存在时的吸光度。

2、样品的采集、处理与保存方法：

1)采精前的准备：

首先将高压灭菌后的玻璃试管用生理盐水冲洗2～3次，放入盛有38℃温水的保温桶中预热五分钟。

2)精液采集：

精液采集使用的方法是背腹按摩法。本试验中采用单人采精法，先用双膝固定公鸡双腿，将试管夹于右手指缝并按摩公鸡腹部，左手对背部进行按摩，当公鸡出现性反射时，用左手迅速将尾羽压向背部，拇指与食指分开放在泄殖腔上方。公鸡出现排精动作时，右手迅速用无菌试管采集精液。用精子分析系统检查精液，保证精子活率大于80％，存于干燥无菌试管中。

3)精液稀释：

用精子分析系统检查精液，确保精子活率大于80％后进行稀释处理。

首先选取同等体积的精液稀释剂在38℃水浴锅中预热5分钟，将其与等体积的原精液在离心管中同温1:1稀释，轻微振荡、摇匀，包裹5层棉布。将稀释过的精液放入4℃冰箱中1h进行平衡，然后在4℃环境中将稀释的精液分别与含有不同浓度鸡血藤提取物的精液冻存液混合，使原精液与精液稀释液最终比例为1:3甘油最终浓度为6％。在4℃冰箱中平衡一小时，用200μL移液枪将精液抽入细管，镊子烧红封口。

4)精液冷冻与解冻：

将冻精细管置于提前用泡沫制作好的6cm高的简易细管冷冻架上。将液氮倒入保温桶中，浮于液面5分钟，然后放入液氮罐中。

从液氮中将冻精细管取出，快速放入38℃水浴锅中进行水浴解冻。在水浴解冻的过程种轻轻震荡冻精细管，使得里面的冻精融化大约2/3时取出来，紧握手中待其完全融化后进行精液的检测。

3、精液的4℃保存法：

将同温1:1稀释并平衡过的精液分为五组，分别用添加有不同浓度鸡血藤提取物的精液稀释液再次稀释并使提取物最终浓度分别为：0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL，对照组精液用不含提取物的稀释液稀释，使得原精液的最终稀释比例为1:3，每组三个重复，放入4℃冰箱保存。

4、精液的冷冻保存法：

将同温1:1稀释并平衡过的精液分为五组，分别用添加有不同浓度鸡血藤提取物的精液冻存液再次稀释并使提取物最终浓度分别为：0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL，对照组精液用不含提取物的冻存液稀释，使得原精液的最终稀释比例为1:3，每组三个重复，放入液氮保存。

5、精子活率检测方法：

为了评估精子活率，一个盖玻片下加入2.5μL稀释过的精液，借助精子质量分析系统，每份样品至少分析6个不同的视野，计算平均值。

6、精子线粒体活性检测方法：

碘化丙啶(propidiumiodide，PI)可以进入死细胞内，并特异的与精子头部核DNA结合发出红色荧光，而罗丹明123(Rhodamine123，Rh123)可以与线粒体特异性的结合发出绿色荧光。利用罗丹明123和碘化丙啶荧光染料进行区别活精子与死精子以及线粒体功能。

精子线粒体活性＝具有线粒体活性的精子数/计数的精子总数×100％。

7、精子悬液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的测定方法：

按照试剂盒说明书处理样品并进行测定。使用酶标仪在波长550nm比色。根据公式可得出被测样品中的SOD活力。

SOD活力(U/mL)＝(对照OD值－样品OD值)/(对照OD值×50％)×样品稀释倍数。

8、精液中MDA含量的测定方法：

按照试剂盒说明书处理样品并进行测定。使用酶标仪在波长532nm处比色。精子过氧化损伤的程度通过MDA的产量来表示。MDA产量可根据公式计算得出。

MDA含量(nmol/mL)＝(样品OD值－空白OD值)/(标准OD值－空白OD值)×标准品浓度(10nmoL/mL)×样品稀释倍数。

9、统计分析方法：

所有数据均按照Mean±SEM表示。本试验使用SPSS23.0软件，运用单因素方差分析(one-WayAnalysisofVariance，ANVOA)，对试验结果进行显著性分析，n＝3，不同字母表示差异显著(P<0.05)。本试验的试验数据作图使用graphpadprism8.3软件。

三、试验结果：

1、鸡血藤提取物DPPH清除率的测定结果：

IC₅₀是指自由基清除率达到50％时的抗氧化剂质量浓度。不同浓度鸡血藤提取物对DPPH自由基的清除率见图1，IC₅₀为0.03mg/mL。通过图1可以知道，当质量浓度在0～0.05mg/mL变化时，此时DPPH自由基清除率变化幅度最大。可以得出结论随着质量浓度的不断增加，其抗氧化活性也会随着相应的上升。

2、不同浓度鸡血藤提取物对4℃保存组精子活率的影响：

如图2所示，图2中的A为新鲜精液稀释100倍后在显微镜下观察到的藏鸡精子形态，图2中的B为新鲜精液稀释100倍后经伊红染色后在显微镜下观察所得。可见藏鸡精子头部和颈部均呈长柱形，颈部较短，尾部长，外形纤细。

在藏鸡精液稀释剂中，根据IC₅₀添加不同浓度的鸡血藤提取物，分别在2h、24h、48h用多功能精子分析系统测定4℃保存后解冻精子的活率。试验结果如图3所示：随着时间的延长各浓度组精子活率显著降低。在2h时0.01mg/mL，0.03mg/mL浓度组与对照组无显著差异；0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度组与对照组相比活率显著降低。在24h时，0.01mg/mL，0.03mg/mL浓度组与对照组无显著差异；0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度组与对照组相比活率显著降低。在48h时，0.01mg/mL浓度组与对照组相比活率显著升高；0.01mg/mL浓度组与0.03mg/mL浓度组相比活率无显著差异；0.05mg/mL和0.1mg/mL浓度组与对照组相比活率显著降低。

3、不同浓度鸡血藤提取物对4℃保存组精液SOD活力、MDA含量的影响：

在藏鸡精液稀释剂中，根据IC₅₀添加不同浓度的鸡血藤提取物，分别在2h、24h、48h用SOD试剂盒测试精液中的SOD活力。试验结果如图4的A所示，随着时间的延长各各浓度组精液SOD含量显著下降；在2h、24h、48h时各组SOD含量均随提取物浓度的上升而升高且与对照组相比，添加提取物试验组SOD含量均显著上升；在2h时各试验组随提取物浓度的上升SOD活力显著升高；在24h时0.03mg/mL和0.05mg/mL浓度组SOD活力没有显著差异；在48h时0.03mg/mL和0.05mg/mL浓度组SOD活力没有显著差异。

在藏鸡精液稀释液中添加鸡血藤提取物，其对藏鸡精液中MDA含量的影响如图4的B所示。试验结果表明，随着时间的延长各浓度组精液MDA含量显著上升；在2h、24h、48h时各组MDA含量均随提取物浓度的上升而下降，且各时间点对照组MDA含量均显著高于提取物添加组；在2h时，0.01mg/mL与0.03mg/mL浓度组相比无显著差异；0.05mg/mL与0.1mg/mL浓度组相比无显著差异；24h时，随着浓度的升高各浓度组MDA含量显著降低；48h时,与0.01mg/mL与0.03mg/mL浓度组相比无显著差异；0.03mg/mL与0.05mg/mL浓度组相比无显著差异。

4、不同浓度鸡血藤提取物对冷冻保存组精子活率的影响：

在藏鸡精子冻存液中，根据IC₅₀添加不同浓度的鸡血藤提取物，经过1周的保存后，用多功能精子分析系统测定冷冻保存后解冻精子的活率。试验结果如图5表明，与对照组相比，添加0.01mg/mL的鸡血藤提取物可以显著提高精子冷冻解冻后的精子的活率，0.01mg/mL浓度组解冻后精子活率达空白对照组精子活率的2.1倍；与对照组相比，0.1mg/mL浓度组的精子活率显著降低，0.03mg/mL、0.05mg/mL浓度组无显著差异。

5、不同浓度鸡血藤提取物对冷冻保存组精子线粒体活性的影响：

本试验使用碘化丙啶-罗丹明123联合染色法测定精子冷冻解冻后线粒体活性，染色结果如图6，碘化丙啶进入死细胞内，特异的与精子头部核DNA结合发出红色荧光，罗丹明123与线粒体特异性结合发出绿色荧光。由图可以统计出图6的A中线粒体活率为8％，图6的B中线粒体活率为33％，图6的C中线粒体活率为15％，图6的D中线粒体活率为5％，图6的E中线粒体活率为3％。统计表明染色后0.01mg/mL浓度组染色后绿色荧光的精子较多即线粒体活率明显高于对照组。

6、不同浓度鸡血藤提取物对冷冻保存组精液SOD活力、MDA含量的影响：

在冷冻保存藏鸡精液稀释液中添加鸡血藤提取物，其对藏鸡精子抗氧化酶活性的影响如图7所示。在抗氧化酶活性方面如图7的A所示，冷冻解冻后的超氧化物歧化酶的活性与对照组相比，添加鸡血藤提取物的试验组均显著的提高，在各试验组中随着鸡血藤提取物浓度的升高SOD活力呈不断上升趋势，在0.1mg/mL时SOD活力达到最高；与对照组相比,各浓度组SOD活力显著升高。

如图7的B所示，与对照组相比，添加0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/mL的鸡血藤提取物的试验组精液中MDA的含量显著降低，但是0.01mg/mL和0.03mg/mL浓度组之间差异不显著，0.05mg/mL和0.1mg/mL浓度组之间差异不显著。

四、试验结论：

精子只有具备完整的细胞结构，才能进行生理反应，完成受精过程，在体外保存的过程中，尤其需要保护细胞内的结构和生理特征，精子尾部中段被线粒体鞘覆盖，然而线粒体鞘是精子运动的主要能量来源，调节顶体反应能力，顶体的完整性是进行顶体反应和受精的必要条件。精子细胞膜在冷冻-解冻后容易受到氧化的损伤，正常状态下ROS处于动态平衡，精浆中含有自身的抗氧化酶系统(Fatmaetal.,2009)，但超过调节能力后，就会对细胞造成损害。研究表明，可以通过向稀释液中添加抗氧化剂来抵御精子体外保存过程中氧化应激对精子细胞的结构和功能造成的损害，提高精子保存效果。

本试验结果显示，鸡血藤提取物具有较高的DPPH自由基清除能力，且添加浓度为0.01mg/mL鸡血藤提取物更有利于精子保存，提高精子活率，而高浓度的鸡血藤提取物却使精子活率显著下降。添加适宜浓度鸡血藤提取物在藏鸡精子冷冻保存的稀释液中后可以显著提高低温及冷冻保存后精液中SOD含量、降低MDA水平，提高精子抗氧化能力，提高低温及冷冻保存后精子活率。

鸡血藤是中国传统的中草药，其中化学成分很多,其中的黄酮类是物质能够有效的清除自由基(汪盈盈等，2017)具有一定的抗氧化能力。有研究发现,在黄颡鱼腹腔注射鸡血藤醇提物提高了黄颡鱼各组织SOD活性。提高了GSH和GSH-Px含量，降低了MDA含量，且提升或降低比例随鸡血藤质量浓度增加而上升(张红霞等，2019)。这与本试验结果中显示的鸡血藤提取物具有较强的抗氧化能力以及对精液中抗氧化酶活力的调节作用基本一致。

本试验将阿坝藏鸡运输至成都适应两周后开始进行试验，对于阿坝藏鸡精液质量是否受生存地区海拔的影响暂时还未见相关报道，由于试验条件限制，本试验没有对此进行试验验证，这还需要在将来继续进行试验进行探索。精液稀释液的渗透压是调节精子活力的主要因子之一(武彩红等，2010)。本试验中添加高浓度的鸡血藤提取物使精子活率显著下降，这可能是由于高浓度鸡血藤提取物的添加使稀释液的渗透压超出了精子的耐受范围而导致。同时本试验结果显示在试验设置的鸡血藤提取物浓度为0.01mg/mL即最低浓度时为最佳添加浓度，但是却没有进一步对鸡血藤提取物进行稀释来探究更低浓度对试验效果的影响，因此本结果只能说明在本试验所设置的浓度组中最适添加浓度为0.01mg/mL。

综上所述，本试验说明鸡血藤提取物具有抗氧化的作用，添加适宜浓度鸡血藤提取物在藏鸡精子冷冻保存的稀释液中后可以显著提高SOD含量、降低MDA水平，提高精子活率，从而提高解冻后精子品质。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种鸡血藤提取物在精子保存中的应用，其特征在于，所述精子为禽类精子；所述鸡血藤提取物为鸡血藤的乙醇提取物。

2.根据权利要求1所述的一种鸡血藤提取物在精子保存中的应用，其特征在于，所述精子为鸡精子。

3.一种精液保存剂，包括基液，其特征在于，还包括鸡血藤提取物。

4.根据权利要求3所述的一种精液保存剂，其特征在于，所述鸡血藤提取物在保存精液时的终浓度为0.005~0.05mg/mL。

5.根据权利要求4所述的一种精液保存剂，其特征在于，所述鸡血藤提取物在保存精液时的终浓度为0.008~0.012mg/mL。

6.根据权利要求3所述的一种精液保存剂，其特征在于，所述基液包括精液稀释剂，所述精液稀释剂包括以下按照浓度计的组分：谷氨酸钠18~25mg/mL、葡萄糖6~10mg/mL、乙酸钾4~6mg/mL、四水乙酸镁0.6~1mg/mL、聚乙烯吡咯烷酮2~4mg/mL、青链霉素混合液80~120U/mL。

7.根据权利要求5所述的一种精液保存剂，其特征在于，所述基液还包括甘油，所述甘油在保存精液时的终浓度为5~7%v/v。

8.根据权利要求3~7中任一项所述的一种精液保存剂，其特征在于，精液为禽类精液。

9.一种精液的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

将精液与精液稀释剂进行同温稀释后，再进行平衡处理，得到平衡稀释后的精液；

将平衡稀释后的精液与如权利要求3~8中任一项所述的精液保存剂进行混合后，再进行低温保存。

10.根据权利要求9所述的一种精液的保存方法，其特征在于，低温保存的环境为3~5℃的环境或液氮环境。

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