CN115735904A - 一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液及其使用方法和应用 - Google Patents
一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液及其使用方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及冻精稀释液领域，具体公开了一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液及其使用方法和应用。含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液由以下原料制得：葡萄糖，柠檬酸，卵黄，螯合剂，碳酸氢钠，氯化钾，青霉素，链霉素，甘油，SDBS，类黄酮化合物，血红蛋白与蒸馏水；SDBS的浓度为0‑10g/L。使用方法为：S1：采用上述原料制备稀释液；S2：采集精液；S3：在‑4‑0℃温度下降温平衡4‑6小时；密封，置于液氮面约2cm处，冻3‑6min，投入液氮中；S4：精液解冻，在34‑38℃的温度下解冻15‑25s，静置1h。本申请的含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液解冻后精子活力高，操作流程简单，具备推广性。
Description
技术领域
本申请涉及冻精稀释液的领域，更具体地说，它涉及一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液及其使用方法和应用。
背景技术
实际应用中，用鲜精进行人工授精可以提高优秀种犬的育种率，但是这种方法受到多种因素制约，不能充分发挥和交流优秀种犬的遗传作用和潜能。精液冷冻保存技术是人工授精技术的一大革新。这种方法是将精子存放于-196℃低温环境中，以暂时停止其新陈代谢，而升温后又能使精子恢复活力。此种方法由于限制较少，有利于提高优良种犬的遗传利用率，促进犬的优秀性状的改良和交流、并遏制退化趋势。因此，研制有效、简单、安全的犬用冻精稀释液配方已成为必然。
相关技术中，申请号为202210259827.9的中国申请文件公开了一种猪精液的冷冻保存方法，首先制备冷冻稀释Ⅰ液、冷冻稀释Ⅱ液和稀释液BTS，接着对三种溶液进行加氢处理，采精后，将猪精液用加氢处理后的稀释液BTS等温1∶1稀释，然后在17℃下平衡24h，离心去除上清，将精子沉淀用等温的加氢处理后的冷冻稀释Ⅰ液稀释，然后再降温平衡至4℃，最后用等温的加氢处理后的冷冻稀释Ⅱ液1∶1稀释，将稀释后的精液用冷冻细管分装并封口，再置于程序冷冻仪的箱体中进行冷冻，冷冻结束后，将冷冻细管移至液氮中保存。
相关技术中，还公开了一种山羊精液冷冻保存方法(NAC、SLS和SDS三种抗氧化剂对山羊精液冷冻保存效果的研究，硕士论文，西北农林科技大学)，首先，配置冷冻稀释Ⅰ液和冷冻稀释Ⅱ液，现配现用；然后将混合的精液样品按照1：2的比例加入冷冻稀释液I液，用纱布包裹16层置于49℃冰箱中缓慢降温2h，每0.5h轻轻摇晃一下；将第一次稀释和平衡后的精液按照1：2的比例加入等温的冷冻稀释液II液(4℃)，中进行封管保存，平衡后的精子活率大于0.65；将液氮倒入泡沫箱内，约5～7cm即可，在液氮上铺好纱布，便于细管烟熏，同时备好酒精灯，封管后，将细管放在液氮上烟熏10min，然后装入布袋中，烟熏后，快速投入液氮中，并把剩余液氮倒入液氮罐中。
针对上述中的相关技术，能够看出，上述精子冷冻操作流程繁杂，提高了精子冷冻的工艺复杂性，很难具备推广性；且解冻后精子活力有待提高。
发明内容
为了精简精子冷冻操作流程，提供具有推广性，且解冻后精子活力高的精子冷冻技术，本申请提供一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液及其使用方法和应用。
第一方面，本申请提供的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，采用如下的技术方案：
一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，由以下原料制得：葡萄糖，柠檬酸，卵黄，螯合剂，碳酸氢钠，氯化钾，青霉素，链霉素，甘油，SDBS，类黄酮化合物，血红蛋白与蒸馏水；SDBS的浓度为0-10g/L。
通过采用上述技术方案，本申请提供一种抗氧化性好的犬用冻精稀释液，主要机理分析为以下三方面：一、上述冻精稀释液中的SDBS为阴离子表面活性剂，添加在冻精稀释液中能够显著提高解冻后精子的精子活力，且能够对冻精稀释液起到分散，抗污的作用。由于血红蛋白能够起到过氧化物酶的作用，因此，血红蛋白能诱导氧化还原反应，使得外界起到氧化剂与还原剂的物质首先与血红蛋白反应，以保护冻精；而类黄酮化合物清除自由基能力较强，抗氧化性较强，对血红蛋白的氧化损伤具有保护作用，还能够清除高氧化态的血红素，因此，冻精稀释液中的SDBS、血红蛋白与类黄酮化合物协同，能够起到较好的抗氧化作用，保证解冻后的精子活力较高。
二、由于血红蛋白含有较多Fe2+离子，能够与SDBS上的阴离子稳定的连接，并分散在SDBS中；且类黄酮化合物能够与血红蛋白结合，促使血红蛋白的抗氧化性进一步增强的同时，与SDBS连接，并发挥类黄酮化合物本身的抗氧化性；从而使得血红蛋白-黄酮-SDBS稳定的分散在冻精稀释液中，协同提高解冻后的精子活力。
三、SDBS的存在也会相应的破坏血红蛋白质分子内的疏水相互作用，使血红蛋白质分子的非极性基团暴露于水中，但是SDBS对血红蛋白质分子的疏水相互作用破坏是处于动态中的，不是一成不变的，这就促使不同的黄酮分子能够不断的随机与血红蛋白结合并分离，使得类黄酮化合物提升血红蛋白的抗氧化性的时间延长；从而使得冻精稀释液的抗氧化性能长时间维持在较高的水平，对精子的有效冷冻时间延长。
上述犬用冻精稀释液配方简单，且相对于现有技术，仅需要上述一种冻精稀释液即可进行精液冷冻，在提高解冻后精子质量的同时，简化精子冷冻步骤。
可选的，所述螯合剂为EDTA或PVP。
可选的，所述SDBS浓度为2.5-5g/L。
通过采用上述技术方案，浓度为2.5-5g/L的SDBS能够恰好提高冷冻精子的精子活力；且能够与血红蛋白、类黄酮化合物协同，共同提高解冻后精子的精子活力。
可选的，所述类黄酮化合物与血红蛋白的总浓度为0.5-2μmol/L。
通过采用上述技术方案，合适浓度的类黄酮化合物与血红蛋白能够与SDBS协同，更好的提高冻精稀释液的抗氧化性，从而提高解冻后精子的活力。
可选的，所述类黄酮化合物与血红蛋白的摩尔比为1：(0.0002-0.0008)。
通过采用上述技术方案，合适的类黄酮化合物与血红蛋白的比例，能够使得类黄酮化合物在促进血红蛋白提高抗氧化性能的同时，与血红蛋白保持动态的结合能力，从而维持血红蛋白-黄酮-SDBS对冻精稀释液中的精子长久的活性保持作用。
可选的，所述冻精稀释液的pH为6.4-6.7。
通过采用上述技术方案，pH为6.4-6.7的冻精稀释液一方面能够为精子提供一个良好的保存环境；另一方面，偏于酸性的冻精稀释液使得血红蛋白表面携带酸性阳离子，从而与SDBS的结合能力更强；使得冻精稀释液稀释后的解冻精子的活力更强。
可选的，所述冻精稀释液由以下浓度的原料制得：葡萄糖30-40g/L，柠檬酸3-7g/L，卵黄150-250mL/L，螯合剂150-200mg/L，碳酸氢钠150-200mg/L，氯化钾700-800mg/L，青霉素350-450万IU/L，链霉素150-250万IU，甘油50-70mL/L，SDBS 2.5-5g/L，类黄酮化合物与血红蛋白0.5-2μmol/L，蒸馏水为溶剂。
通过采用上述技术方案，合适浓度的原料组成的冻精稀释液，能够保持冻精解冻后的高活力；且能够简化冻精稀释液使用方法的步骤，使得该犬冻精液具备推广性。
可选的，所述含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液包括以下制备步骤：将所述含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液加蒸馏水定容到所需体积，磁力搅拌，滤膜过滤，灭菌冷藏。
通过采用上述技术方案，上述犬用冻精稀释液的制备方法相比于现有技术，极大的简化了制备步骤；仅需要将原料添加在一起，用犬用冻精稀释液稀释至所需体积，即可制备得到犬用冻精稀释液；犬用冻精稀释液的制备方法简单，具备推广性。
第二方面，本申请提供一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液的使用方法，采用如下的技术方案：
一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液的使用方法，包括以下步骤：
S1：冻精稀释液制备，采用上述的方法制备冻精稀释液；
S2：采集精液，精子活率在80％以上用于实验；
S3：精液冷冻，将精液与冻精稀释液混匀，甘油终浓度保证在3％以上；在-4-0℃温度下降温平衡4-6小时；密封，置于液氮面1.5-2.5cm处，冷冻3-6分钟，投入液氮中；
S4：精液解冻，在34-38℃的温度下解冻15-25s，静置1-2h后，检测精子质量。
通过采用上述技术方案，上述犬用冻精稀释液的使用方法相比于现有技术中的犬用冻精稀释液的使用方法，精液冷冻与精液解冻的步骤均较简单，犬用冻精稀释液及其使用方法具备推广性。
第三方面，本申请提供一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液在拉布拉多犬、罗威纳犬、德国牧羊犬、杜伯文犬、史宾格犬、马里努阿犬、拉布拉多犬、昆明犬等犬的精液冷冻中的应用。
通过采用上述技术方案，本申请的犬用冻精稀释液适用于多种犬的精液冷冻；具备推广性。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中，血红蛋白能与外界起到氧化剂与还原剂的物质首先反应，以保护冻精；类黄酮化合物对血红蛋白的氧化损伤具有保护作用，还能够清除高氧化态的血红素；且血红蛋白-黄酮-SDBS能够连接，并稳定的分散在犬用冻精稀释液中，协同提高解冻后的精子活力；
2、本申请中，合适的类黄酮化合物与血红蛋白的比例，能够使得类黄酮化合物在促进血红蛋白提高抗氧化性能的同时，与血红蛋白保持动态的结合能力，从而维持血红蛋白-黄酮-SDBS对冻精稀释液中的精子长久的活性保持作用；
3、本申请中，上述犬用冻精稀释液的使用方法相比于现有技术中的犬用冻精稀释液的使用方法，精液冷冻与精液解冻的步骤均较简单，犬用冻精稀释液及其使用方法具备推广性。
具体实施方式
以下结合实施例与对比例对本申请作进一步详细说明。
提供以下实施例和对比例的原料来源：实施例与对比例的原料均可市售购得，EDTA，纯度：99.995％，品牌：克拉玛尔；PVP使用PVP-K30；青霉素与链霉素，货号：1227166363，品牌：克拉玛尔；牛血红蛋白，货号：1227151350，品牌：克拉玛尔；黄烷酮，纯度：>98％，品牌：阿拉丁；异黄酮为金雀异黄酮，纯度：>98％，品牌：阿拉丁；SDBS，纯度：>95％，品牌：阿拉丁。
一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液的实施例
实施例1
一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液的使用方法，包括以下步骤：
S1：冻精稀释液制备，将葡萄糖3000mg，柠檬酸700mg，鸡卵黄15mL，EDTA 20mg，碳酸氢钠15mg，氯化钾800mg，青霉素35万IU，链霉素25万IU，甘油5mL，SDBS1000mg，黄烷酮与牛血红蛋白0.05μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.0005，并用蒸馏水定容到100mL，在100rpm的速度下磁力搅拌5min，用0.22微米滤膜过滤，灭菌冷藏，冷藏温度0℃，得到冻精稀释液，冻精稀释液的pH为6.5；
S2：采集精液，采用常规的假阴道法采集精液，每只拉布拉多公犬每天采精1次，采完后迅速送回实验室进行初步的精液品质检查，精液的颜色、气味和密度正常，精子活率在80％以上才可用于实验；
S3：精液冷冻，将精液与等温的冻精稀释液在降温前1次混匀，使得甘油的体积浓度的终浓度保证在4％；在0℃冰箱中水浴降温平衡5小时；在冰箱中将平衡好的精液吸入0.5mL细管，聚乙烯醇封口，置于液氮面上2cm处，冷冻5min，投入液氮中；
S4：精液解冻，在37℃的水浴锅中解冻20s，用全自动精子分析仪测定精子活力，吉姆萨染色检测顶体完整性，静置1h后，检测精子存活指数。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，S1中原料用量不同，螯合剂不同，类黄酮化合物不同；
具体步骤为，S1：冻精稀释液制备，将葡萄糖4000mg，柠檬酸300mg，鸡卵黄25mL，PVP-K30 15mg，碳酸氢钠20mg，氯化钾700mg，青霉素45万IU，链霉素15万IU，甘油7mL，SDBS250mg，异黄酮与牛血红蛋白2μmol加入蒸馏水中，其中，异黄酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.0005，并用蒸馏水定容到100mL，在100rpm的速度下磁力搅拌5min，用0.22微米滤膜过滤，灭菌冷藏，冷藏温度为0℃，得到冻精稀释液，冻精稀释液的pH为6.5。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，S1中原料用量不同；
具体步骤为，S1：冻精稀释液制备，将葡萄糖3700mg，柠檬酸600mg，鸡卵黄20mL，EDTA 17.5mg，碳酸氢钠17.5mg，氯化钾750mg，青霉素40万IU，链霉素20万IU，甘油6mL，SDBS500mg，黄烷酮与牛血红蛋白1μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.0005，并用蒸馏水定容到100mL，在100rpm的速度下磁力搅拌5min，用0.22微米滤膜过滤，灭菌冷藏，冷藏温度为0℃，得到冻精稀释液，冻精稀释液的pH为6.5。
实施例4
与实施例3的不同之处在于，SDBS的添加量为250mg。
实施例5
与实施例3的不同之处在于，SDBS的添加量为1000mg。
实施例6
与实施例3的不同之处在于，黄烷酮与牛血红蛋白1μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.0002。
实施例7
与实施例3的不同之处在于，黄烷酮与牛血红蛋白1μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.0008。
实施例8
与实施例3的不同之处在于，黄烷酮与牛血红蛋白4μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.00001。
实施例9
与实施例3的不同之处在于，黄烷酮与牛血红蛋白0.1μmol加入蒸馏水中，其中，黄烷酮与牛血红蛋白的摩尔比为1：0.001。
实施例10
与实施例3的不同之处在于，S1后还包括使用碳酸氢钠水溶液将冻精稀释液pH调节至6.7的步骤。
实施例11
与实施例3的不同之处在于，S1后还包括使用碳酸氢钠水溶液将冻精稀释液pH调节至8的步骤。
对比例1
与实施例3的不同之处在于，SDBS的添加量为2000mg。
对比例2
与实施例3的不同之处在于，不添加SDBS。
对比例3
与实施例3的不同之处在于，不添加黄烷酮。
对比例4
与实施例3的不同之处在于，不添加牛血红蛋白。
对比例5
与实施例3的不同之处在于，不添加黄烷酮与牛血红蛋白。
对比例5
与实施例3的不同之处在于，不添加SDBS、黄烷酮与牛血红蛋白。
性能检测试验
采用实施例1至11和对比例1至5中制得的冻精稀释液稀释并解冻的精子进行性能测试，检测精子活力、顶体不完整率与精子存活指数；检测依据：用全自动精子分析仪检测精子活力与精子存活指数，用姬姆萨染色法检测顶体不完整率；测试结果如表1所示；
表1
| 精子活力(％) | 顶体不完整率(％) | 精子存活指数(％) | |
| 实施例1 | 52.66±3.01 | 8.99±1.52 | 21.13±1.95 |
| 实施例2 | 51.87±2.98 | 9.04±1.38 | 20.74±1.87 |
| 实施例3 | 55.62±3.35 | 8.84±1.45 | 22.36±2.12 |
| 实施例4 | 50.45±2.74 | 9.87±1.57 | 18.23±1.85 |
| 实施例5 | 48.28±3.12 | 10.23±1.64 | 14.97±1.67 |
| 实施例6 | 51.36±2.44 | 9.12±1.61 | 20.35±2.01 |
| 实施例7 | 52.16±3.22 | 9.08±1.55 | 20.97±1.88 |
| 实施例8 | 48.56±2.81 | 10.11±1.34 | 15.74±1.65 |
| 实施例9 | 49.12±3.01 | 10.05±1.36 | 15.86±1.58 |
| 实施例10 | 54.38±3.16 | 8.96±1.51 | 21.54±1.74 |
| 实施例11 | 48.18±2.65 | 10.42±1.57 | 13.77±1.64 |
| 对比例1 | 38.42±2.42 | 18.64±1.92 | 10.85±1.34 |
| 对比例2 | 46.37±2.68 | 14.24±1.85 | 13.17±1.45 |
| 对比例3 | 36.36±2.61 | 19.87±1.98 | 9.68±1.38 |
| 对比例4 | 37.42±2.59 | 19.13±1.68 | 10.15±1.65 |
| 对比例5 | 35.56±2.43 | 18.66±1.73 | 9.25±1.55 |
| 对比例6 | 34.12±2.31 | 18.01±1.58 | 8.66±1.49 |
结合实施例1、2和实施例3，可以看出，实施例1、2、3的不同之处仅在于冻精稀释液原料配比不同，最终稀释保存的犬精子解冻后的精子活力较高，顶体不完整率较低，精子存活指数较高；证明，本申请权要保护范围内的原料配比制得的冻精稀释液均较好。
结合实施例3、4和5，对比例1、2，可以看出，实施例3与实施例4解冻后精子活力高于实施例5和对比例1、2，证明，SDBS浓度在250mg/L-500mg/L范围内，制备得到的冻精稀释液冷冻精子效果好；实施例3的解冻后精子活力高于实施例4的解冻后精子活力，证明，SDBS浓度为500mg/L时，制得的冻精稀释液冷冻精子的效果最好。
结合实施例3和6、7、8、9，可以看出，五个实施例中，不同之处在于，黄烷酮与牛血红蛋白的含量与比例，实施例3、6、7制得的冻精稀释液稀释后的解冻精子活力高于实施例8、9，证明，本申请的黄烷酮与牛血红蛋白总浓度为1μmol/L时，黄烷酮与牛血红蛋白的比例在1：(0.0002-0.0008)范围内时，冻精稀释液质量较好；实施例3制得冻精稀释液稀释精子后的精子解冻活力高于实施例6、7，证明，本申请的黄烷酮与牛血红蛋白总浓度为1μmol/L时，黄烷酮与牛血红蛋白的比例为1：0.0005时，冻精稀释液质量最好。
结合实施例3和实施例10、11，可以看出，实施例3与实施例10制得的稀释后的精子活力高于实施例11，证明，本申请的冻精稀释液最佳酸碱范围为6.4-6.7，碱性较大的冻精稀释液会大大影响冻精稀释液的质量。
结合实施例3和对比例3、4、5、6，可以看出，对比例3、4、5、6相比于实施例3，分别未添加黄烷酮，牛血红蛋白，黄烷酮与牛血红蛋白，SDBS、黄烷酮与牛血红蛋白，结果显示，对比例3、4、5、6的解冻后精子活力相比与实施例3均变差；证明，SDBS、黄烷酮与牛血红蛋白在冻精稀释液中的添加，缺一不可。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，由以下原料制得：葡萄糖，柠檬酸，卵黄，螯合剂，碳酸氢钠，氯化钾，青霉素，链霉素，甘油，SDBS，类黄酮化合物，血红蛋白与蒸馏水；SDBS的浓度为0-10g/L。
2.根据权利要求1所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，所述SDBS浓度为2.5-5g/L。
3.根据权利要求1所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，所述类黄酮化合物与血红蛋白的总浓度为0.5-2μmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，所述类黄酮化合物与血红蛋白的摩尔比为1：（0.0002-0.0008）。
5.根据权利要求1所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，所述稀释液的pH为6.4-6.7。
6.根据权利要求1所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，由以下浓度的原料制得：葡萄糖30-40g/L，柠檬酸3-7g/L，卵黄150-250mL/L，螯合剂150-200mg/L，碳酸氢钠150-200mg/L，氯化钾700-800mg/L，青霉素350-450万IU/L，链霉素150-250万IU，甘油50-70mL/L，SDBS 2.5-5g/L，类黄酮化合物与血红蛋白0.5-2μmol/L，蒸馏水为溶剂。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液，其特征在于，包括以下制备步骤：将所述含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液加蒸馏水定容到所需体积，磁力搅拌，滤膜过滤，灭菌冷藏。
8.一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：稀释液制备，采用权利要求7的步骤制备稀释液；
S2：采集精液，精子活率在80%以上；
S3：精液冷冻，将精液与稀释液混匀，甘油最终体积浓度保证在3%以上；在-4-0℃温度下降温平衡4-6小时；密封，置于液氮面1.5-2.5cm处，冷冻3-6分钟，投入液氮中；
S4：精液解冻，在34-38℃的温度下解冻15-25s，静置1-2h后，检测精子质量。
9.一种含十二烷基苯磺酸钠的犬用冻精稀释液在拉布拉多犬、罗威纳犬、德国牧羊犬、杜伯文犬、史宾格犬、马里努阿犬、拉布拉多犬、昆明犬，等犬的精液冷冻中的应用。
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