CN113170778B - 一种细胞冻存液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞冻存液及其制备方法与应用，属于细胞保存技术领域。所述的细胞冻存液，包括甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖，还包括磷酸盐缓冲液。本发明将甘露糖赤藓糖醇脂作为细胞冻存液组分，能够促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。采用本发明的细胞冻存液，方便快速，将细胞和细胞冻存液混匀后可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存即可保持较高的细胞存活率。

Description

一种细胞冻存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，特别涉及一种细胞冻存液及其制备方法与应用。

背景技术

表面活性剂广泛应用于人们日常生活中的多个方面，可用于清洁或作为配方助剂，以增加其他分子在化学品、化妆品、洗涤剂，食品，纺织品和药品等产品中的溶解、乳化和分散性能。

目前红细胞的冷冻保存主要采用高浓度甘油或者二甲基亚砜。研究发现甘油与二甲基亚砜在非冷冻条件下具有细胞毒性，例如，DMSO会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物学功能，因此，如果DMSO作为细胞冷冻保护剂，必须尽可能的缩短其在非冻结状态下与细胞的接触时间，在细胞使用前也要充分冲洗去除DMSO，而已进入细胞内的DMSO难以清洗掉，DMSO可能对细胞的生理功能和活性产生有害的影响。使用甘油作为红细胞冷冻保护剂，解冻后需要复杂的洗涤程序去除甘油，并且仍有甘油残留在细胞内部，对人体具有潜在危害。

专利CN101333514B公开了一种利用含有DMSO和大分子胶体物质的高渗保存液配制成的红细胞冻存保护液。该保护剂可使红细胞进入高渗状态，同时相对锁住水分，降低溶质扩散速度，不会引起大量溶血且可以抑制红细胞外冰晶对细胞膜的破坏作用，简单、省时。但是该专利不能确保在解冻后洗涤程序中充分去除DMSO，对人体可能具有一定的毒害作用。

近年来，新的冻存保护剂如海藻糖等被用于细胞低温冻存中，海藻糖是由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成的非还原性双糖，具有对生物抗脱水、抗冷冻、抗高渗的作用，但由于细胞膜对海藻糖的非渗透性，所以一般情况下海藻糖不能透过细胞膜，而越来越多的研究表明，只有当海藻糖进入细胞内部后才能更好的对细胞膜和胞内蛋白起到有效的保护作用。

甘露糖赤藓糖醇脂是一类由霉菌或酵母菌产生的生物表面活性剂，其生产菌株为非致病菌，与人体和环境有良好的相容性。除此以外，甘露糖赤藓糖醇脂具有良好的分散、乳化、增溶特性等优点，还具有很好的抗肿瘤、抗病毒、抑制白细胞的增长等特点，为生物分子、细胞膜、细胞器以及医用生物制品的研究和使用带来了极大方便，为人类健康作出很大的贡献，具有巨大的研究价值和经济效益。然而，目前尚未见有将甘露糖赤藓糖醇脂应用于细胞冻存液中的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服由于海藻糖无法进入细胞内部导致对细胞膜和胞内蛋白的冻存效果不佳的缺陷，提供一种细胞冻存液，旨在促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。

本发明的另一个目的在于提供上述细胞冻存液的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述细胞冻存液的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种细胞冻存液，包括甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液。

所述的细胞优选包括红细胞。

所述的红细胞优选来自脐血和外周血中的至少一种。

所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂与海藻糖优选按摩尔浓度比1～10:0.2～0.3计算；

更优选地，所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为1～10mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。

所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。

一种细胞冻存液的制备方法，通过将甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖混匀，然后再加入磷酸盐缓冲液搅拌混匀得到。

所述的细胞冻存液在细胞冻存中的应用。

上述细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：

(1)细胞冻存：将待冻存细胞加入到盛有细胞冻存液的容器中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器浸入液氮中，即可实现对细胞的保存；

其中，待冻存细胞与细胞冻存液按体积比15～25:85～75计算。

(2)细胞解冻：将盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器从液氮中取出，水浴加热，直至细胞解冻复苏，得到解冻复苏后的细胞，然后加入生理盐水离心去上清，洗涤，将洗涤后的细胞用生理盐水配置成细胞盐水悬液，即得解冻去冻存液且复苏的红细胞。

步骤(1)中所述的细胞优选包括红细胞。

步骤(2)中所述的水浴加热的条件优选为37℃水浴加热0.5～1.5min；更优选为37℃水浴加热1min。

步骤(2)中所述的离心的条件优选为：800g离心5分钟。

步骤(2)中所述的洗涤优选为用生理盐水洗涤。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明将甘露糖赤藓糖醇脂作为细胞冻存液组分，能够促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。

(2)采用本发明的细胞冻存液，方便快速，将细胞和细胞冻存液混匀后可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存即可保持较高的细胞存活率。

(3)甘露糖赤藓糖醇脂可增加细胞膜表面通透性，促进对海藻糖的吸收，在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小，可以不用常规的先程序降温，再转移至液氮中的复杂的“慢冻”过程。

(4)相较于采用传统的甘油和DMSO作为红细胞冻存液，本发明在解冻时不需要使用不同浓度的甘油进行梯度洗脱，而且本发明中的甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖与人体具有良好的相容性。

附图说明

图1为实施例2中红细胞内海藻糖含量随甘露糖赤藓糖醇脂加入量变化结果图。

图2为实施例2中红细胞溶血率随甘露糖赤藓糖醇脂加入量的变化结果图。

图3为实施例1和对比例3的方法冻存后红细胞的形态结果图；其中，图A为实施例1的方法冻存后红细胞的形态结果图；图B为对比例3的方法冻存后红细胞的形态结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

脐血来源于广东省脐带血造血干细胞库；甘露糖赤藓糖醇脂购于武汉远成共创科技有限公司；海藻糖购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液(pH 7.4、0.01mol/L)购于赛默飞世尔科技有限公司。

细胞复苏活率(％)采用MTT法检测。

实施例1：

取脐血50mL，加入枸橼酸钠抗凝剂10mL，800g离心10min去除血浆和血小板，得到预处理后的红细胞。

一种细胞冻存液，由甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液组成；其中甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为10mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.25mol/L，磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。

上述细胞冻存液的使用方法，具体操作如下：

(1)细胞冻存：将20mL红细胞加入到盛有80mL细胞冻存液的冻存管中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管浸入液氮中，即可实现对细胞的保存；

(2)细胞解冻：将盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管从液氮中取出，37℃水浴加热约1min，直至细胞解冻复苏，得到解冻复苏后的细胞，然后细胞用100mL生理盐水于800g离心5分钟去上清后，将细胞用100mL生理盐水反复洗涤2次，去上清，得到洗涤后的细胞；将洗涤后的细胞用100mL生理盐水配置成细胞盐水悬液，即得解冻去冻存液且复苏的红细胞，整个复苏过程耗时10min。

实施例2：甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖浓度对红细胞冻存效果的影响

本实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：细胞冻存液中甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖的浓度不同；具体如下表1所示：

表1：不同浓度甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖对红细胞冻存后细胞复苏活率的影响

甘露糖赤藓糖醇脂浓度(mol/L)	海藻糖浓度(mol/L)	细胞复苏活率
			0	0.25	60.2％
1	0.25	80.2％
			2	0.25	81.4％
3	0.25	86.7％
			4	0.25	91.2％
10	0.25	92.4％
			0	0	20.2％
10	0	30.5％
			0	10	28.5％
11	0.25	74.6％
			12	0.25	68.4％
16	0.25	65.6％
			20	0.35	60.5％
4	0.35	78.3％

从上表1可以看出，甘露糖赤藓糖醇脂与海藻糖按摩尔浓度比1～10:0.2～0.3加入时，能够显著提高红细胞的复苏活率，且在该范围内，甘露糖赤藓糖醇脂浓度越高，效果越明显。说明上述添加比例下的甘露糖赤藓糖醇脂能够促进细胞对海藻糖的吸收。当甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖摩尔浓度比不在上述范围内时，红细胞的复苏活率大大降低，这可能是由于甘露糖赤藓糖醇脂浓度过高，使细胞膜表面的脂大量溶解，造成细胞膜通透性增加过大，大量水份进入细胞导致细胞破碎的原因。

发明人通过采用硫酸蒽酮法，取1mL洗涤后的红细胞加入3mL 10％(v/v)三氯乙酸混合均匀，密封试管并在80℃恒温水浴中加热1h，加入4mL含0.2％(v/v)硫酸的蒽酮溶液，冰水浴中摇匀、冷却，然后放入沸水精确煮沸10min，随后立即放入冰水浴10min，在625nm处测定其吸光度，检测当甘露糖赤藓糖醇脂浓度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、10mol/L，海藻糖浓度为0.25mol/L时，红细胞内海藻糖的浓度，结果如图1所示。

从上图1可以看出，通过检测红细胞内海藻糖的浓度发现，当细胞冻存液中海藻糖的浓度为0.25mol/L时，随着甘露糖赤藓糖醇脂浓度的增加，红细胞内海藻糖的浓度也增加，说明甘露糖赤藓糖醇脂能够促进细胞对海藻糖的吸收。

发明人通过用氰化高铁血红蛋白试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)将血红蛋白转变为高铁血红蛋白，在最大吸收波长540nm下测定其吸光度并计算溶血率，检测红细胞溶血率随甘露糖赤藓糖醇脂加入量的变化情况。

结果如图2所示。

从上图2可以看出，通过检测游离上清血红蛋白浓度与全血血红蛋白浓度的比值(即溶血率)，发现随着细胞冻存液中甘露糖赤藓糖醇脂浓度的增加，溶血率会明显降低，说明细胞膜较为完整，没有发生较多破裂，表明甘露糖赤藓糖醇脂能够促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，使细胞膜更加完整，细胞没有破裂溶血，进而显著提高细胞的存活率。

对比例1：

本对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：细胞冻存液中将甘露糖赤藓糖醇脂分别替换为甘油、二甲基亚砜(DMSO)、异硫氰酸苯乙酯、鞘氨糖脂、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘氨磷脂、藻蛋白糖脂、槐糖脂、磷脂、卵磷脂、脂多糖；解冻复苏后的红细胞的复苏活率分别如下表2所示：

表2

对比例2：

本对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于：所述的细胞冻存液中还含有0.15mol/L的聚乙烯基吡咯烷酮(国药集团上海化学试剂公司)、0.2mol/L的羟乙基淀粉(国药集团上海化学试剂公司)、0.12mol/L人血白蛋白溶液(国药集团上海血液制品有限公司)、0.1mol/L胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)、0.1mol/L乙酰胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)和0.25mol/L DMSO(国药集团上海化学试剂公司)。解冻复苏后的红细胞的复苏活率如下表3所示：

表3：

方法	细胞复苏活率(％)
		实施例1	92.4％
对比例2	78.2％

以上结果可看出，与实施例1的细胞冻存液相比，对比例2的细胞冻存液在加入一些其他细胞冻存常用的组分后，细胞复苏活率反而下降，这可能是由于添加其他组分后会影响海藻糖进入细胞内的效率，导致进入细胞内的海藻糖量减少，进而冻存效果下降。并且相比实施例1的细胞冻存液，对比例2的细胞冻存液加入胎牛血清及人血白蛋白溶液等组分，这样的方案存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。

对比例3：

本对比例3采用经典的甘油冻存法对红细胞进行冻存和解冻。

经典方法：取脐血50mL，加入枸橼酸钠抗凝剂10mL，800g离心10min去除血浆和血小板，得到预处理后的红细胞。将预处理后的红细胞与待添加的57％(v/v)复方甘油溶液按红细胞与复方甘油溶液的体积比5:4的比例混合后放入37℃水浴中平衡10min，然后将其置于程序降温仪降温到-80℃后转移至液氮中保存。复苏时从液氮中取出，迅速放入37℃水浴箱中，轻微振荡至全部融化，然后加入9％(m/v)氯化钠溶液800g离心10min洗涤一次，平衡后再用0.9％氯化钠溶液800g离心10min洗涤2-3次，洗涤结束后用生理盐水配制成红细胞盐水悬液，即得冻存解冻去甘油且复苏的红细胞。

实施例1的方法得到的解冻去冻存液且复苏的红细胞与对比例3的方法得到的解冻去甘油且复苏的红细胞的细胞形态如图3所示，复苏活率如表4所示。

正常红细胞形态为双凹圆盘状，透明发亮。从图3可以看出，按照实施例1的方法冻存解冻红细胞，得到的冻存解冻去冻存液且复苏后的正常红细胞的数量更多，说明本发明的细胞冻存液具有良好的冻存解冻效果。

表4：

方法	细胞复苏活率(％)	复苏耗时
			实施例1方法	92.4％	10min
对比例3方法	45％	1h

从以上结果可看出，与对比例3的经典的甘油冻存法相比，本发明使用的红细胞冻存液不使用高浓度的甘油，因此不会在红细胞内部造成高渗透压，避免复苏时细胞溶血破裂，相对于冻存前的红细胞量，冻存复苏后剩余红细胞比例明显高于经典方法(对比例3方法)，且无需多次洗涤除去甘油，复苏耗时明显缩短，发明人分析可能是甘露糖赤藓糖醇脂促进细胞对海藻糖的吸收，同时避免了细胞在复苏时溶血破裂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，由甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液组成；

所述的细胞包括红细胞；

所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为1～10 mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.25 mol/L；

所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。

2.一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于，通过将权利要求1所述细胞冻存液中的甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖混匀，然后再加入磷酸盐缓冲液搅拌混匀得到。

3.权利要求1所述的细胞冻存液在细胞冻存中的应用。

4.一种细胞冻存液的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）细胞冻存：将待冻存细胞加入到盛有权利要求1所述细胞冻存液的容器中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器浸入液氮中，即可实现对细胞的保存；

其中，待冻存细胞与权利要求1所述细胞冻存液按体积比15～25 : 85～75计算；

（2）细胞解冻：将盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器从液氮中取出，水浴加热，直至细胞解冻复苏，得到解冻复苏后的细胞，然后加入生理盐水离心去上清，洗涤，将洗涤后的细胞用生理盐水配置成细胞盐水悬液，即得解冻去冻存液且复苏的红细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的水浴加热的条件为：37℃水浴加热0.5～1.5 min。

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