CN115299432A - 一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法，属于生物低温保存技术领域。操作步骤如下：（1）利用壳聚糖、稀醋酸溶液、羟乙基纤维素和蒸馏水配制基体溶液；（2）将干细胞加入到基体溶液中混合均匀，冰浴条件下，逐滴加入β甘油磷酸钠溶液，冰浴混合得到细胞悬浮液；（3）将细胞悬浮液转移至冻存管或水凝胶成胶模具中，在37℃中静置，观察水凝胶形成，倒置3s不流动，得到封装了干细胞的水凝胶；（4）将封装有细胞的水凝胶转移至冻存管或其他冷冻载体中，直接进行低温保存。本发明选用的水凝胶配方具有生物相容性、可降解性和无菌性，接近生物软组织，输入人体后不会造成严重免疫排斥反应，输入人体后可自动降解对人体无明显伤害。
Description
技术领域
本发明属于生物低温保存技术领域，具体涉及一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法。
背景技术
在细胞的低温保存过程中，为了减少冰晶生长导致的低温损伤，经常需要在被保存的细胞悬浮液中加入特定种类和特定浓度的低温保护剂。例如，保存各类干细胞常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO），而保存人类红细胞常用的是甘油。低温保护剂的添加和去除过程常会对引起渗透性体积变化对细胞结构造成伤害，具体原因在于：添加低温保护剂过程中，胞内水会大量渗透到胞外，细胞体积显著皱缩；复温后去除低温保护剂过程中，常需要大量生理盐水稀释保护剂，在细胞内外渗透压差作用下大量水分进入细胞内，细胞体积显著膨胀。细胞体积的显著变化很容易对细胞产生不可逆转的伤害。
此外，常规低温保护剂，如DMSO有一定的毒副作用，添加和去除保护剂过程中的离心过程也会对细胞产生一定的机械应力损伤。这一系列的损伤作用会影响细胞的功能和结构，进而影响低温保存细胞的后续使用，如干细胞结构受损会影响其分化能力，对后续细胞治疗过程产生不可保量影响。
发明内容
为提高干细胞的低温保存质量，减小低温保护剂的不利影响，本发明提供一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法。
一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备操作步骤如下：
（1）配制基体溶液
将壳聚糖溶解于浓度0.1mol/l-0.2mol/l的稀醋酸溶液中，得到质量浓度10-20mg/ml的壳聚糖溶液；使用蒸馏水溶解羟乙基纤维素，加热至完全溶解，得到质量浓度10mg/ml的羟乙基纤维素溶液；将质量浓度10-20mg/ml的壳聚糖溶液和质量浓度10-20mg/ml的羟乙基纤维素溶液按体积比6：1-2混合，得到基体溶液；
（2）制备细胞悬浮液
按体积比为1：7将干细胞加入到基体溶液中，混合均匀，得到干细胞溶液；在冰浴条件下，逐滴加入质量浓度40%-56%的β甘油磷酸钠溶液，冰浴混合15-30min，得到细胞悬浮液；质量浓度40%-56%的β甘油磷酸钠溶液与干细胞溶液的体积比为1：8；
（3）制备水凝胶
将细胞悬浮液转移至冻存管或水凝胶成胶模具中，在37℃恒温无菌环境中静置，观察水凝胶形成，倒置3s不流动，得到水凝胶；
（4）封装了细胞的水凝胶，直接投入-196℃的液氮进行降温并低温保存。
进一步的技术方案如下：
步骤（1）中，其特征在于：所述壳聚糖为水溶性壳聚糖或酸溶性壳聚糖，脱乙酰度为85%-99.9%，分子量选用50000-100000。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
（1）本发明选用的水凝胶配方具有生物相容性、可降解性和无菌性，接近生物软组织，输入人体后不会造成严重免疫排斥反应，输入人体后可自动降解对人体无明显伤害，壳聚糖已广泛用于食品领域和医疗领域；如壳聚糖水凝胶用于果蔬肉类保鲜，在表面形成一层透气性良好的可降解抑菌膜、Wang C等人使用壳聚糖水凝胶包裹脂肪干细胞修复受损心肌组织。
（2）本发明的制备的水凝胶是三维空间网状结构，含大量水，具有良好的吸水性和持水性，对水分子有较强束缚力；很大程度上降低由于细胞失水、吸水引起的渗透压对细胞造成的损伤，从而保证细胞的完整性和细胞膜的功能性；由于胞内冰的形成是冰晶因子通过活性降低、失去功能性的细胞膜进入胞内，因此水凝胶在降温和复温过程中具有显著的冰晶抑制作用，可以很好的代替常规低温保护剂且不会对细胞造成损伤。
（3）复温后无需洗脱，可直接注射于人体，可避免洗脱过程中的渗透性损伤、离心机械损伤和分离过程中造成的细胞丢失。
附图说明
图1为使用细胞计数仪检测新鲜细胞在明场和荧光下细胞的状态图。
图2为新鲜细胞的细胞的尺寸。
图3为细胞在悬浮液中的状态。
图4为制备薄膜化水凝胶的模具。
图5为薄膜化水凝胶冷冻载片。
图6为冻存管中制备的水凝胶。
图7为薄膜化模具制备的水凝胶。
图8为经过降复温后细胞明场和荧光下活死细胞状态。
图9为细胞经过降复温后的细胞尺寸。
图10为复温后显微镜下观察到的细胞处于水凝胶中的状态。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
以下实施例所用材料说明如下：干细胞购于上海纪宁实业有限公司；壳聚糖、β-甘油磷酸钠、羟乙基纤维素均为市场所售的常规产品。所用试剂未注明生产厂家者，均为市场所售的常规产品。未注明条件者，均可按照常规条件或制造商建议的条件进行使用。
将市场购得的干细胞进行如下处理：
（1）.细胞培养：将细胞接种于150mm培养皿中，使用90%DMEM培养基和10%胎牛血清培养3d后观察生长情况。
（2）.细胞收集：在70%-80%时收集，移去培养基，使用生理盐水清洗两遍加入0.25%含EDTA的胰酶将细胞消化下来，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1000r/min离心5min，弃上清，使用生理盐水重悬1000r/min离心5min去除细胞碎片，弃上清后将细胞浓度调整到所需体积备用。离心后加入2ml生理盐水重悬备用，并取样测得新鲜细胞活率97%；如图1所示，图1中a为细胞在明场下的状态，图1中b为细胞在荧光下的状态；渗透压287mmol/kg。图2为新鲜细胞在缓冲液中的尺寸，在后续操作中经过低温保存后细胞尺寸会发生变化。
实施例1
一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备操作步骤如下：
（1）配制基体溶液
将2g脱乙酰度99.9%、Mn=50000的酸溶性壳聚糖溶解于100mL浓度0.1mol/L的稀醋酸中，充分搅拌2h，得到浓度20mg/ml的壳聚糖溶液；4℃保存备用；
使用10ml蒸馏水溶解0.1g羟乙基纤维素，加热完全溶解再停止加热继续搅拌10min，得到浓度10mg/ml羟乙基纤维素溶液；4℃保存备用；
将质量浓度20mg/ml壳聚糖溶液和质量浓度10mg/ml羟乙基纤维素溶液按体积比6：1混合，搅拌20min，得到基体溶液。
（2）制备细胞悬浮液
按体积比为1：7将干细胞加入到基体溶液中，混合均匀，得到干细胞溶液；在冰浴条件下，逐滴加入质量浓度56%的β甘油磷酸钠溶液冰浴混合30min，得到细胞悬浮液，参见图3；质量浓度56%的β甘油磷酸钠溶液与干细胞溶液的体积比为1：8。
取样测得细胞悬浮液中干细胞的活率97.30%、渗透压232mmol/kg。
（3）制备水凝胶
将细胞悬浮液转移至冻存管或平底浅槽水凝胶成胶模具中，参见图4；在37℃恒温无菌环境中，静置观察将装有细胞悬浮液的水凝胶冻存管倒置3s，细胞悬浮液不流动，水凝胶凝结完成；使干细胞封装在水凝胶中。
参见图5，冷冻载片夹住水凝胶薄膜；参见图6，形成的水凝胶位于冻存管中；参见图7，水凝胶为薄膜状。
（4）低温保存
将封装有干细胞的水凝胶转移至冻存管或其他冷冻载体中，在-196℃的液氮中进行低温保存。
关于复温处理说明如下：
将封装了干细胞的水凝胶从液氮中取出，放入37℃恒温水浴锅中，快速复温；复温后，直接取样测得干细胞的活率为97%，图8中的a为明场下活死细胞状态，图8中的b为荧光下活死细胞状态；
图9中的a为活细胞细胞尺寸分布，图9中的b为死细胞尺寸分布，图9中的c为活细胞和死细胞的尺寸分布，图9中的d为所有细胞的尺寸分布，由此可见细胞经过降复温后尺寸减小；
参见图10，复温后显微镜下观察到的干细胞处于水凝胶中的状态，说明水凝胶在细胞保存方面有良好的效果。
且壳聚糖水凝胶在如今被广泛应用于食品医疗行业；如用于食品的保鲜：在食品表面形成可降解的透气隔菌膜、作为食品添加剂加入到食品中等；如用于包裹各类细胞并进行体外细胞增殖和构建后移植到人体病灶部位，如骨骼、牙龈、器官等组织器官。
Claims (2)
1.一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：
（1）配制基体溶液
将壳聚糖溶解于浓度0.1mol/l-0.2mol/l的稀醋酸溶液中，得到质量浓度10-20mg/ml的壳聚糖溶液；使用蒸馏水溶解羟乙基纤维素，加热至完全溶解，得到质量浓度10mg/ml的羟乙基纤维素溶液；将质量浓度10-20mg/ml的壳聚糖溶液和质量浓度10-20mg/ml的羟乙基纤维素溶液按体积比6：1-2混合，得到基体溶液；
（2）制备细胞悬浮液
按体积比为1：7将细胞加入到基体溶液中，混合均匀，得到细胞溶液；在冰浴条件下，逐滴加入质量浓度40%-56%的β甘油磷酸钠溶液，冰浴混合15-30min，得到细胞悬浮液；质量浓度40%-56%的β甘油磷酸钠溶液与细胞溶液的体积比为1：8；
（3）制备水凝胶
将细胞悬浮液转移至冻存管或水凝胶成胶模具中，于37℃恒温无菌环境中静置，观察水凝胶形成，倒置3s不流动，得到水凝胶；
（4）封装了细胞的水凝胶，直接投入在-196℃的液氮进行降温并低温保存。
2.根据权利要求1的所述一种用于干细胞封装保存的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，其特征在于：所述壳聚糖为水溶性壳聚糖或酸溶性壳聚糖，脱乙酰度85%-99.9%，分子量选用50000-100000。
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