CN114404394A - 一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法,所述干细胞水凝胶呈片状结构,厚度为1~2mm,具有组织粘性和形态可扩展性,包括:(1)制备负载干细胞的水凝胶模板,以倒模的方式制备水凝胶模具,在其上制备片状干细胞水凝胶;(2)配制合适的冷冻保护剂配方,对干细胞水凝胶进行冷冻保存;(3)确定合适的解冻工艺,提高水凝胶中干细胞的存活率。本发明能够长时间地维持干细胞的活力和功能,并且通过多个干细胞水凝胶贴片的联合使用,修复大尺寸、形状不匹配的慢性伤口。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程、新型医药研发领域,尤其涉及一种面向临床应用的干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法、复苏方法。
背景技术
间充质干细胞具有广泛的免疫调节能力和组织修复特性,可以通过旁分泌特性来治疗多种疾病,如慢性伤口愈合、骨关节炎和纤维化疾病等。干细胞可以通过分泌多种生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子和外泌体等来发挥抗凋亡、免疫调节和血管生成功能。基于此,干细胞在生物医学领域显示出广泛的应用潜力,为治疗疾病提供了巨大的希望。
干细胞常用的递送方式有注射、喷雾等。这些方法通常会导致细胞的泄露、迁移甚至死亡,导致干细胞低的植入效率和存活率,还可能会引起机体自身的免疫反应,严重限制了干细胞疗法的临床转化。负载干细胞的水凝胶被认为是一种提高干细胞保留率和存活率的有效策略。水凝胶具有良好的生物相容性,不仅可以维持干细胞的活性和功能,克服宿主对干细胞的免疫排斥,而且可以防止干细胞在伤口中迁移和渗漏。因此,干细胞水凝胶具有广泛的前景,是细胞治疗技术发展的关键方向。
干细胞治疗的临床转化要求其能在体外保存和运输,确保细胞在供应链中保持足够的活性与功能。目前,干细胞水凝胶的冷冻保存存在以下几个问题:(1)临床应用一般需要宏观尺度的水凝胶,其传热传质过程比较缓慢,导致水凝胶的降温和升温速率比较低,冷冻保护剂的加载和洗脱比较缓慢。(2)传统干细胞冷冻保存的金标准是采用10%的二甲基亚砜。其毒性比较强烈,不仅会影响干细胞的活力和功能,还会使患者产生严重的不良反应,如不适、恶心、呕吐、震颤和发烧等。因此,临床要求DMSO浓度需要低于0.1%。这些问题严重降低了干细胞水凝胶的冷冻保存效果,影响了干细胞的活性和功能,增加了干细胞水凝胶冷冻保存的难度。因此,如何实现干细胞水凝胶的体外保存仍面临着重要挑战。
鉴于此,需要开发一种可规模化制备干细胞水凝胶的方法和实现干细胞水凝胶的长期保存以维持其活性和功能的方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法,能够长时间的维持干细胞的活力,并且不会损害其功能。
本发明通过一下技术方案实现:
一种干细胞水凝胶,所述干细胞水凝胶呈片状结构,厚度为1~2mm。
所述干细胞水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备厚度为1~2mm的PMMA模片,将PMMA模片固定于PMMA板的上表面,得到模板;
(2)将PDMS溶液浇铸在模板上,模板上PDMS溶液的上表面高出PMMA模片的上表面,真空脱气后,固化,脱模,得到模具。
(3)将含干细胞的凝胶悬液倒入模具,在模具上表面铺放一张半透膜,将交联溶液倒在半透膜上,交联溶液渗透完成后,去除半透膜,得到片状的干细胞水凝胶。
优选的,步骤(3)中,含干细胞的凝胶悬液通过如下方法得到:
将非渗透性保护剂加入到凝胶溶液中,过滤除菌,得到含非渗透性保护剂的凝胶溶液;
将培养的干细胞重悬于含非渗透性保护剂的凝胶溶液中,得到含干细胞的凝胶悬液。
进一步的,所述的凝胶溶液为海藻酸钠-多巴胺溶液,其中的溶剂为干细胞用培养基。
进一步的,所述的干细胞为脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胎盘间充质干细胞的任一种,所用干细胞的代数为P3~P6代。
进一步的,所述的非渗透性冷冻保护剂为海藻糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、半乳糖、聚乙二醇和聚乙烯醇中的任一种。
进一步的,所述的交联溶液为氯化钙溶液,交联时间为5~15min。
所述干细胞水凝胶的冷冻保存方法,包括以下步骤:
(1)将干细胞水凝胶置于渗透性冷冻保护剂溶液中,在4~10℃静置15~30分钟;所述的渗透性冷冻保护剂为DMSO、1,2-丙二醇、甘油和3-OMG中的一种或多种,其中,当渗透性冷冻保护剂包含DMSO时,DMSO在渗透性冷冻保护剂溶液中的质量浓度为4%~5%;
(2)对干细胞水凝胶以0.5~5℃/min的速度进行梯度降温,直至降至-80℃~-196℃,然后转移至液氮中保存;
优选的,渗透性冷冻保护剂溶液的溶剂成分为无血清培养基。
所述冷冻保存的干细胞水凝胶的复苏方法,包括以下步骤:
(1)将冷冻保存的干细胞水凝胶置于37℃的水浴中复温;
(2)将复温后的干细胞水凝胶转移至无血清培养基溶液中洗脱。
优选的,步骤(2)中,洗脱时间为10~30分钟。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
本发明干细胞水凝胶为片状水凝胶,片状水凝胶具有大的比表面积,可以获得较高的降温和升温速率,因此进行冷冻时,可以降低冷冻保护剂的浓度,从而降低其副作用,而且可以加快物质传递过程,缩短冷冻保护剂的加载和洗脱时间,提高冷冻保存效果。并且该干细胞水凝胶贴片具有组织粘性,且干细胞通过旁分泌特性来来发挥组织修复和免疫调控等特性,因此可以通过多个水凝胶贴片的联合使用来发挥治疗效果。
本发明用于制备模具的膜片厚度很薄,半透膜的存在可以使氯化钙溶液均匀的扩散到凝胶溶液中,因此所制备的干细胞水凝胶为大小、厚度均一,表面平整的片状水凝胶,片状水凝胶具有大的比表面积,可以获得较高的降温和升温速率,因此进行冷冻时,可以降低冷冻保护剂的浓度,从而降低其副作用,而且可以加快物质传递过程,缩短冷冻保护剂的加载和洗脱时间,提高冷冻保存效果。
本发明冷冻保存方法冷冻保护剂加载时间明显缩短,能显著降低所需冷冻保护剂DMSO的浓度,洗脱后残留DMSO浓度低于0.1%,不具备毒性,并且片状干细胞水凝胶能以较高的降温速率快速降温,提高冷冻保护效果。本发明冷冻保存效果好,冷冻保存后的干细胞活力高(80%以上),功能不受影响。
本发明片状干细胞水凝胶复苏时能在2分钟内快速复温,且在短时间内洗脱完毕,使用更方便。多个干细胞水凝胶贴片的联合使用可以用于多种形态伤口可修复,扩大其临床应用的范围。
附图说明
图1为本发明的凝胶制备示意图;
图2为本发明的冷冻保存过程示意图;
图3为实施例1所制得的干细胞水凝胶的外观图;
图4为实施例1冷冻保存前后干细胞水凝胶的微观结构图;
图5为实施例1与对比例1冷冻保存后的细胞染色图像;
图6为实施例1与对比例1冷冻保存的干细胞水凝胶DMSO的残留浓度;
图7为实施例1与未冷冻保存的干细胞水凝胶的干细胞标志物表达水平对比图。
图8为实施例1与未冷冻保存的干细胞水凝胶的干细胞表面受体荧光染色对比图。
图9为实施例1与未冷冻保存的干细胞水凝胶用于糖尿病伤口愈合的宏观愈合情况和相对疤痕面积。
图10为实施例1用于大型糖尿病伤口愈合的宏观愈合情况和相对疤痕面积。多个干细胞水凝胶贴片是联合使用可以修复大尺度、形状不匹配的慢性伤口。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行描述,这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点,并非用于限制本发明的权利要求。
本发明主要包括:(1)制备负载干细胞的水凝胶模板,以倒模的方式制备水凝胶模具,在其上制备干细胞水凝胶;(2)配制合适的冷冻保护剂配方,对干细胞水凝胶进行冷冻保存;(3)确定合适的解冻工艺,提高水凝胶中干细胞的存活率。
本发明面向临床应用的干细胞水凝胶的制备方法,如图1,包括以下步骤:
(1)使用激光切割机对PMMA板进行切割,获得相应的模片,将模片固定于未切割的PMMA板上表面,获得制备水凝胶用的模板;
(2)将PDMS溶液浇铸在模板上,模板上PDMS溶液的上表面高出模片上表面,真空脱气后,60℃下固化2小时,最后脱模,获得制备水凝胶用的模具。模具在与膜片对应的位置处具有槽型结构。
(3)将非渗透性保护剂加入到凝胶溶液中,过滤除菌;
(4)将培养的干细胞重悬于凝胶溶液中,然后将得到的含干细胞的凝胶悬液倒入模具,在模具上表面铺放一张半透膜,将交联溶液倒在半透膜上,数分钟后,去除半透膜,即可获得片状干细胞水凝胶。
切割后得到的模片规格为:直径5~15mm,厚度1~2mm。
所述的凝胶溶液为2%的海藻酸钠-多巴胺溶液,溶剂成分为干细胞用培养基。海藻酸钠-多巴胺是通过酰胺化反应将多巴胺和海藻酸钠溶液合成的,可以使水凝胶具有良好的组织粘附性。
所述的干细胞为脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞的任一种,所用代数为P3~P6代,含量为5×105~3×106个/mL,进一步优选浓度为1×106个/mL。
所述的交联溶液为0.2mM的氯化钙溶液,交联时间为5~15min。
所述非渗透性冷冻保护剂成分为海藻糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、半乳糖、聚乙二醇(35KD)、聚乙烯醇(9KD)中的任一种;
所制备的干细胞水凝胶为片状水凝胶。片状水凝胶具有大的比表面积,可以获得较高的降温和升温速率,以降低冷冻保护剂的浓度及其副作用,而且可以加快物质传递过程,缩短冷冻保护剂的加载和洗脱时间,提高冷冻保存效果。
如图2,本发明所述的干细胞水凝胶的冷冻保存方法,包括如下步骤:
(1)将干细胞水凝胶放置于含渗透性冷冻保护剂溶液的冻存管中,4~10℃静置15~30分钟;
(2)对干细胞水凝胶以0.5~5℃/min的速度进行梯度降温,直至降至-80~-196℃,然后转移至液氮中长期保存;
所述的渗透性冷冻保护剂成分为DMSO、1,2-丙二醇(PROH)、甘油和3-OMG的任意组合,当渗透性冷冻保护剂包含DMSO时,DMSO在渗透性冷冻保护剂溶液中的质量浓度为4%~5%,溶剂成分为无血清培养基。
本发明需提供上述冷冻保存的干细胞水凝胶的复苏方法,以用于后续应用,如图2,具体步骤为:
(1)将冷冻保存的干细胞水凝胶置于37℃的水浴中2分钟内快速复温;
(2)将复温后的干细胞水凝胶转移至无血清培养基溶液中洗脱一定时间后应用。
所述的洗脱所用无血清培养基温度为4℃~37℃。
所述的洗脱时间为10~30分钟,优选的洗脱时间为15分钟。
实施例
本发明给出如下6个实施例(即实施例1~实施例6)和3个对比例,实施例和对比例均按照上述干细胞水凝胶的制备方法和冷冻保存方法进行,其中,实施例和对比例的水凝胶大小、非渗透性保护剂的类型和浓度、渗透性保护剂的类型和浓度列举于下表1:
表1实施例和对比例的实验参数
注:%表示的是质量浓度,M表示的是摩尔浓度。
本发明冷冻保存和复苏过程的实验参数列举于下表2。
表2实施例和对比例冷冻保存和复苏过程的实验参数
本发明实施例1制得的干细胞水凝胶外观图如图3所示。另外,本发明通过扫描电镜观察了实施例1制得的干细胞水凝胶微观结构,结果如图4所示。该结果说明,冷冻保存过程不会对干细胞水凝胶的结构造成影响。
将用实施例1~6和对比例1~3所述方案保存的干细胞水凝胶进行复苏后,在0h和24h分别计算干细胞的存活率,结果如表3所示。
表3干细胞的存活率
从表3可以看出,实施例的细胞活力显著高于对比例,特别是复苏后培养24小时后,实施例的细胞活力显著提高,说明本发明提供的冷冻保存方法可以显著维持干细胞的活力。图5进一步说明实施例1的冻存效果优于对比例1。
另外,本发明还对上述实施例和对比例中复苏后的干细胞水凝胶0h和24h的DMSO残留浓度进行了测定,结果如图6所示。该结果说明,本发明提供的冷冻保存方法DMSO浓度几乎无残留,所获得的干细胞水凝胶无毒,可直接用于临床应用。
另外,本发明分别通过qRT-PCR和免疫荧光染色测定了实施例1中冷冻保存的干细胞水凝胶的标志物的表达水平,并与新鲜的干细胞水凝胶进行了对比,结果如图7和图8所示。冷冻保存后的干细胞标记物的表达与新鲜组无差异。该结果说明冷冻保存不会损害干细胞的功能,进一步说明了本发明的优越性。
最后,为了验证本发明制备的干细胞水凝胶性能的优越性,选取了特定实例进行了验证。
糖尿病伤口由于持续的炎症、组织缺血往往难以实现自我愈合。基于干细胞水凝胶的多功能性和免疫调节特性,本发明通过糖尿病伤口模型对本发明的实际效果进行验证。
通过给SD大鼠单次注射链脲霉素(70mg/kg)构建了1型糖尿病大鼠模型,然后在大鼠背部使用组织活检器构造了两个全层皮肤伤口模型,然后分为4组:(1)未处理;(2)单纯用干细胞处理;(3)按照实施例1制备的新鲜的干细胞水凝胶;(4)实施例1复苏的干细胞水凝胶。通过伤口的宏观伤口愈合情况和愈合后的疤痕面积评估了本发明制备的干细胞水凝胶的效果,结果如图9所示。可以看到,实施例1复苏的干细胞水凝胶对糖尿病伤口的愈合效果(愈合速度和疤痕面积)不弱于新鲜的干细胞水凝胶,显著高于未处理的组和单纯用干细胞处理的组,进一步表明本发明制备的干细胞水凝胶具有优异的免疫调节和组织修复特性,并且本发明提出的冷冻保存工艺不会对干细胞水凝胶的效果产生影响。
此外,考虑到临床患者中的糖尿病伤口的大小和形状通常差异很大。为了验证本发明制备的干细胞水凝胶对治愈大的、形状不匹配的伤口的适用性,本发明通过大型糖尿病伤口对本发明的实际效果进行验证。
在构建1型糖尿病大鼠模型后,在大鼠背部构建了一个2×3cm的大型全层皮肤伤口模型,然后分为2组:(1)未处理;(2)实施例1复苏的干细胞水凝胶,其中将8片复苏的干细胞水凝胶均匀的覆盖住伤口。通过伤口的宏观伤口愈合情况和愈合后的疤痕面积评估了本发明制备的干细胞水凝胶的效果,结果如图10所示。可以看到,实施例1复苏的干细胞水凝胶愈合效果显著高于未处理的组别,进一步表明本发明冷冻保存的水凝胶对组织修复的优异效果,并且可以适用于大的、形状不匹配的伤口。
本发明提出的工艺操作简单,冷冻保护剂来源方便、成本低、利于临床转化。本发明实现了干细胞水凝胶的长期低温保存,并可进行远距离运输,扩大了配送距离,解冻复苏后可直接使用,减少了繁琐的步骤带来的安全隐患。该干细胞水凝胶具有优异的免疫调节特性和组织修复特性,可充分满足临床需求,具有巨大的应用价值。本发明实现了宏观尺度水凝胶的保存,易于规模化应用,制备效率和成品率高,经济效益高,临床应用价值大。
申请人说明,本发明通过上述实例来说明本发明详细的工艺流程,以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明并不局限于上述工艺流程。对于本发明所属领域的技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种干细胞水凝胶,其特征在于,所述干细胞水凝胶呈片状结构,厚度为1~2mm。
2.权利要求1所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备厚度为1~2mm的PMMA模片,将PMMA模片固定于PMMA板的上表面,得到模板;
(2)将PDMS溶液浇铸在模板上,模板上PDMS溶液的上表面高出PMMA模片的上表面,真空脱气后,固化,脱模,得到模具;
(3)将含干细胞的凝胶悬液倒入模具,在模具上表面铺放一张半透膜,将交联溶液倒在半透膜上,交联溶液渗透完成后,去除半透膜,得到片状的干细胞水凝胶。
3.根据权利要求1所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,含干细胞的凝胶悬液通过如下方法得到:
将非渗透性保护剂加入到凝胶溶液中,过滤除菌,得到含非渗透性保护剂的凝胶溶液;
将培养的干细胞重悬于含非渗透性保护剂的凝胶溶液中,得到含干细胞的凝胶悬液。
4.根据权利要求3所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,所述的凝胶溶液为海藻酸钠-多巴胺溶液,其中的溶剂为干细胞用培养基。
5.根据权利要求3所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,所述的干细胞为脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胎盘间充质干细胞的任一种,所用干细胞的代数为P3~P6代。
6.根据权利要求3所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,所述的非渗透性冷冻保护剂为海藻糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、半乳糖、聚乙二醇和聚乙烯醇中的任一种。
7.根据权利要求3所述的干细胞水凝胶的制备方法,其特征在于,所述的交联溶液为氯化钙溶液,交联时间为5~15min。
8.权利要求1所述干细胞水凝胶的冷冻保存方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将干细胞水凝胶置于渗透性冷冻保护剂溶液中,在4~10℃静置15~30分钟;所述的渗透性冷冻保护剂为DMSO、1,2-丙二醇、甘油和3-OMG中的一种或多种,其中,当渗透性冷冻保护剂包含DMSO时,DMSO在渗透性冷冻保护剂溶液中的质量浓度为4%~5%;
(2)对干细胞水凝胶以0.5~5℃/min的速度进行梯度降温,直至降至-80℃~-196℃,然后转移至液氮中保存。
9.一种冷冻保存的干细胞水凝胶的复苏方法,其特征在于,所述冷冻保存的干细胞水凝胶是采用权利要求8所述方法得到的干细胞水凝胶,包括以下步骤:
(1)将冷冻保存的干细胞水凝胶置于37℃的水浴中复温;
(2)将复温后的干细胞水凝胶转移至无血清培养基溶液中洗脱。
10.根据权利要求9所述的冷冻保存的干细胞水凝胶的复苏方法,其特征在于,步骤(2)中,洗脱时间为10~30分钟。
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