KR101757063B1 - 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤 - Google Patents

그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것으로, 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도를 조절하여 하이드로젤의 배지 성분 방출을 조절할 수 있고, 이러한 하이드로젤으로 구성된 세포 배양용 배지는 배양 성분 방출 조절 능력을 구현할 수 있다.

Description

그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤{Hydrogel for cell culturing comprising graphene oxide and medium components}
본 발명은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤 및 이를 이용한 세포 배양방법에 관한 것이다.
최근 다양한 생체재료가 3차원적인 세포 배양과 효율적인 세포 전달을 위해 개발이 되고 있다. 그 중 이 목적에 부합하는 가장 효과적인 물질이 하이드로젤인 것으로 부각되었고, 다양한 연구가 진행되고 있다.
하이드로젤(hydrogel)은 그물망 구조를 가진 수용성 고분자로서, 물에는 녹지 않으면서 높은 수분 함유량을 가져 조직과 비슷한 성질을 가진다. 하이드로젤은 반응성이 좋은 화학물질을 이용하여 작용기 사이의 공유결합을 유도하여 젤 형태를 유도할 수 있다. 하이드로젤은 화학적 또는 물리적 여러 가지 가교방법이 있고, 다양한 가교방법으로 원하는 물성의 하이드로젤을 얻을 수 있다. 하이드로젤은 생체조직의 구성성분인 세포외 기질(extracellular matrix)과 유사한 수화 구조를 가지고 있어서 생체 적합성이 우수하며, 창상피복재, 조직공학용 지지체, 소프트 렌즈, 서방성 약물 전달계에 적용되고 있는 의학 또는 약학적으로 각광받는 생체재료이다.
그래핀(graphene)은 탄소원자가 2차원(2D) 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 의미하며, 이것은 모든 다른 차원구조의 흑연(graphite) 물질의 기본 구조를 이룬다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러렌(fullerene), 1차원 구조인 카본나노튜브 또는 3차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)은 바이오센서의 구성물, 세포 이미징(cellular imaging), 약물 전달 등에 있어서 활용 가능성이 높은 물질로 알려져 있다. 이는 기존의 흑연보다 매우 큰 표면적을 가지며, 높은 전기전도도 및 강력한 기계적 강도를 가진다. 또한 부서지기 쉬운 흑연보다 유연하여, 유연성이 필요한 전기제품 등에 대해서 장점을 가지며, 흑연보다 더 많은 균일 분포된 전기화학적 활성사이트를 가진다.
한편, 하이드로젤을 통한 약물 전달 시, 높은 다공성과 함수율 때문에 상대적으로 빠른 약물 방출 속도와 그에 대한 조절이 힘들다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점은 약물의 전달 및 방출 제어에서의 응용에 제한이 따르게 되므로, 약물 방출의 조절이 가능한 하이드로젤에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
한국특허공개 제2013-0092408호
본 발명의 목적은 하이드로젤을 이용하여 세포를 배양했을 때, 배지 성분의 방출 조절 능력을 구현할 수 있는 하이드로젤을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 전술한 세포 배양용 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 전술한 세포 배양용 하이드로젤을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 배양방법을 제공한다.
본 발명은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤 및 이를 이용한 세포 배양방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포 배양용 하이드로젤은 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도를 조절하여 배지 성분의 방출을 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로젤의 모형을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도 변화에 따라 제조된 하이드로젤의 모형 및 사진을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 콜라겐 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도 변화에 따른 제조된 하이드로젤의 SEM 사진을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 하이드로젤의 FGF-2 방출 실험결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 및 비교예의 배지 모식도 및 상기 배지들에서 3일 및 7일 동안 배양된 만능유도줄기세포의 세포수와 세포 활성도(AP activity)를 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 세포 배양용 하이드로젤에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 배양용 하이드로젤은 그래핀 옥사이드가 하이드로젤 내에 분산되어 상기 세포 배양용 하이드로젤의 약물 방출 속도를 조절할 수 있다.
종래 단백질, 유기 고분자 등의 물질들을 젤화한 하이드로젤은 일반적으로 높은 투과도를 지닌다. 따라서 성장인자 등과 같이 세포 배지에 필요한 물질들을 하이드로젤 내에 담지할 경우, 그 방출 속도를 조절하기 어려워 세포 배양 배지로 이용이 제한적이다.
본 발명에서는 투과도가 낮은 그래핀 옥사이드를 통해 하이드로젤 내에서 나노미터 단위의 저지층 역할을 구현할 수 있으며, 상기 하이드로젤 내의 그래핀 옥사이드의 함량을 조절하여 약물 방출 속도를 조절할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명에 따른 세포 배양용 하이드로젤의 밀도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 1 내지 4 mg/ml 또는 2 내지 3 mg/ml일 수 있다. 상기 밀도 범위에서 약물의 방출이 용이하다.
또한, 일 구체예에서 상기 세포 배양용 하이드로젤에서 37℃에서 100 시간 경과 후의 배지 성분의 방출량은 40 내지 100%, 60 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%일 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 하이드로젤에서 하이드로젤은 세포 배양을 위한 지지체의 역할을 수행할 수 있다.
이러한 하이드로젤을 구성하는 성분(하이드로젤 구성 성분)의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알긴산, 키토산 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 하이드로젤이 형성될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 하이드로젤은 콜라겐으로부터 형성될 수 있다.
본 발명에서는 하이드로젤의 제조시 용매 대비 상기 하이드로젤 구성 성분의 함량을 조절하여 하이드로젤의 밀도를 조절할 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 하이드로젤은 그래핀 옥사이드를 포함한다. 상기 그래핀 옥사이드는 하이드로젤의 강도를 향상시킬 수 있다. 상기 그래핀 옥사이드는 낮은 투과성과 높은 인장강도를 가지므로, 하이드로젤에 적용하면 그래핀 옥사이드와 하이드로젤 간의 수소결합, 정전기적 인력 및 π- π 결합으로 인해 더욱 견고하고 밀집된 구조의 하이드로젤을 제공할 수 있다.
상기 그래핀 옥사이드의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 세포 배양용 하이드로젤 전체 중량 대비 1 내지 15 중량% 또는 3 내지 10 중량%일 수 있다. 상기 범위에서 37℃에서 100 시간 경과 후의 배지 성분의 방출 양을 40% 이상으로 조절할 수 있다. 그래핀 옥사이드의 함량이 1 중량% 미만이면 배지 성분의 방출 속도 제어 효과에 크게 기여하지 못하며, 15 중량%를 초과하면 그래핀 옥사이드의 뭉침 현상이 발생하여 분산성이 저하될 우려가 있다.
본 발명의 세포 배양용 하이드로젤은 그래핀 옥사이드 외에 배지 성분을 함께 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “배지 성분”은 통상적으로 세포 배양에 이용되는 배지 성분으로서, 예를 들면, 사이토카인 및/또는 성장 인자, 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 식물 호르몬, 글루코스 함유 당, 항생제 및 유사물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 구체예에서 상기 성장 인자로는, 예를 들면, FGF(Fibroblast Growth Factor), KGF(Keratinocyte Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor), PDGF-AA(Platelet Derived Growth Factor AA), PDGF-AB(Platelet Derived Growth Factor AB), PDGF-BB(Platelet Derived Growth Factor BB), TGF-α(Transforming Growth Factor-α), TGF-β, IGF(Insulin-like Growth Factor), TNF(Tumor Necrosis Factor), GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), NGF(NGF(Nerve Growth Factor) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
목적에 따라서 배지 성분은 예정된 위치에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게 서방출 되도록 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 세포 배양용 하이드로젤을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
상기 하이드로젤에 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 주입하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
상기 하이드로젤의 제조 방법에서 하이드로젤을 이루는 성분은 전술한 성분을 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 콜라겐을 사용할 수 있다.
상기 하이드로젤의 제조는 당업계의 일반적인 방법을 통해 제조될 수 있으며, 일 구체예에서 하이드로젤을 이루는 성분을 용매에 용해시킨 후 젤화하여 제조할 수 있다.
이때, 하이드로젤을 이루는 성분의 농도는 용매 100 중량부에 대해 0.01 내지 10 중량부일 수 있다. 상기 성분의 농도에 따라 제조되는 하이드로젤의 강도, 밀도 및 함수율 등의 물성을 변화시킬 수 있으며, 농도가 높을수록 강도 및 밀도가 증가하며 함수율은 감소한다. 상기 성분의 0.01 중량부 미만이면 젤화가 일어나지 않을 우려가 있으며, 10 중량부를 초과하면 젤화 후 함수율이 감소하여 너무 딱딱해지기 때문에 하이드로젤 고유의 특성을 살리지 못할 우려가 있다.
일 구체예에서 젤화는 pH 7 내지 9 또는 7 내지 8, 및 30 내지 40℃ 또는 35 내지 40℃에서 10 내지 60 분 또는 20 내지 40 분간 수행할 수 있다.
본 발명에서는 하이드로젤에 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 주입하여 세포 배양용 하이드로젤을 최종 제조할 수 있다.
그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 주입의 주입은 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 함께 포함하는 용액을 하이드로젤에 주입할 수 있으며, 또는 그래핀 옥사이드를 용액 및 배지 성분을 포함하는 용액을 각각 하이드로젤에 주입할 수 있다.
배지 성분을 포함하는 용액은 예를 들어, 배지 성분을 완충액과 혼합하여 저장액을 제작한 후, 상기 하이드로젤에 상기 저장액을 주입할 수 있다. 상기 배지 성분은 정전기적 인력과 수소결합을 통해 성장인자를 담지한 하이드로젤이 평형 상태에 도달하여 네트워크를 형성하여 강도를 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 세포 배양용 하이드로젤을 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양 방법은 전술한 세포 배양용 하이드로젤, 즉 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 포함하는 하이드로젤을 세포와 접촉시키는 단계를 통해 수행할 수 있다.
본 발명에서는 하이드로젤과 세포를 접촉시킨 후 배양할 수 있다.
일 구체예에서, 세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 줄기세포일 수 있으며, 상기 줄기세포는 만능유도줄기세포일 수 있다.
상기 하이드로젤을 이용하여 배양한 만능유도줄기세포는 일반 배지를 사용한 경우에 비하여 높은 세포활성도를 가질 수 있다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에서 첨부된 도면은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 이해되어야 한다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
제조예 1. 하이드로젤 제조
1) 콜라겐 하이드로젤의 제조
타입1 콜라겐(BD BioScience MA, USA) 및 탈이온수(DI water)를 혼합한 후, pH 7.4 및 37℃ 조건에서 30 분간 젤화하여 콜라겐 하이드로젤을 제조하였다. 이때, 합성된 콜라겐 하이드로 젤의 밀도는 2 mg/ml, 2.5 mg/ml 또는 3 mg/ml가 되도록, 콜라겐의 사용량을 달리하여 제조하였다.
2) 성장인자 및 그래핀 옥사이드가 포함된 콜라겐 하이드로젤 제조
성장인자 FGF-2(fibroblast growth factor)를 10 wt% 농도로 인산완충식염수(PBS)와 혼합하여 저장액을 제작한 후, 22℃에서 상기 1)에서 제조한 2.5mg/ml 콜라겐 하이드로젤에 FGF-2 저장액을 주입하여 5시간 동안 배양하였다. FGF-2를 담지한 하이드로젤은 정전기적 인력과 수소 결합을 통해 평행상태에 도달하도록 하였다.
그래핀 옥사이드는 기존에 공지된 방법(Hummer's method, modified Hummer's method 등)을 통해 합성하였고, 상기 그래핀 옥사이드는 각각 3 wt%, 6 wt% 또는 10 wt%의 농도로 하이드로젤에 주입하였다.
본 발명에서 도 1은 상기 제조예 1에서 제조된 콜라겐 하이드로젤의 모형으로, 6-웰(well) 플레이트에 콜라겐 하이드로젤이 형성될 수 있으며, 상기 콜라겐 하이드로젤은 내부에 성장 인자 및 그래핀 옥사이드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도 2는 콜라겐 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도 변화에 따라 제조된 하이드로젤의 모형 및 사진을 나타낸다.
구체적으로, (a) 및 (b)는 콜라겐의 함량(농도)을 달리했을 때의 하이드로젤 모형(a) 및 사진(b)으로, 콜라겐의 함량이 증가할수록 제조되는 하이드로젤의 밀도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, (a) 및 (c)는 그래핀 옥사이드의 농도(3, 6 또는 10wt%)를 달리했을 때의 하이드로젤 모형(a) 및 사진(c)으로, 그래핀 옥사이드의 농도가 증가할수록 제조되는 하이드로젤의 밀도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, (d)는 제조되는 하이드로젤의 밀도에 따른 배양 성분의 방출을 표현한 모형으로, 하이드로젤의 밀도가 증가할수록 배양 성분의 방출 속도가 저하되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도 3은 콜라겐 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도 변화에 따른 제조된 하이드로젤의 SEM 사진을 나타낸다.
구체적으로 (a), (b), (c)는 콜라겐 하이드로젤의 밀도가 각각 2, 2.5, 3 mg/ml인 하이드로젤의 SEM 사진을 나타내고, (d), (e), (f)는 그래핀 옥사이드의 농도를 각각 3, 6, 10 wt%로 주입한 하이드로젤의 SEM 사진을 나타낸다. 상기 사진에서 나타나듯이, 콜라겐 하이드로젤의 밀도 및 그래핀 옥사이드의 농도가 증가할수록 더욱 밀집된 하이드로젤 네트워크 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 1.
전술한 제조예 1에서 제조한 하이드로젤을 이용한 배지에서 만능유도줄기세포를 배양하였다.
비교예 1.
성장인자 FGF-2가 제외된 일반 배지(동물세포배양배지, DEME)에서 만능유도줄기세포를 배양하였다.
비교예 2.
일반 배지(동물세포배양배지, DEME)에서 만능유도줄기세포를 배양하였다.
실험예 1. 하이드로젤의 FGF-2 방출 확인
상기 제조예 1에서 제조한 FGF-2 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 하이드로젤의 FGF-2 방출 양상을 확인하기 위해, 생체 환경인 37℃에서 동물세포배양배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM) 3.0ml 가 담긴 6-웰(well) 플레이트에 제조예 1에서 제조한 하이드로젤(6 wt% 그래핀 옥사이드가 함유된 2.5 mg.ml의 하이드로젤)을 침전시켰다. 이 후, 일정한 시간 간격으로 같은 부피의 혈청 용액을 첨가하였다. 하이드로젤에서 방출되는 FGF-2의 양은 효소면역 측정방법(enzyme-linked immunosorbent assay)으로 확인하였고, 실험이 완료된 후 FGF-2의 총 방출양을 기준으로 각 시료의 방출양을 정규화하였다.
상기 하이드로젤의 FGF-2 방출 실험결과는 도4의 그래프에 나타내었다. 도 4의 (a)는 하이드로젤의 밀도를 각각 2, 2.5, 3mg/ml로 다르게 하여 FGF-2의 방출양을 측정한 결과 그래프이고, (b)는 밀도가 2.5 mg/ml인 콜라겐 하이드로젤에 그래핀 옥사이드의 농도를 3, 6, 10wt%로 다르게 주입한 하이드로젤의 방출양을 측정한 결과 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로젤의 밀도와 그래핀 옥사이드의 농도를 달리했을 때, FGF-2 성장인자의 방출양은, 하이드로젤의 밀도가 높을수록, 그래핀 옥사이드의 농도가 증가할수록 FGF-2 성장 인자의 방출속도가 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 하이드로젤과 그래핀 옥사이드의 농도를 조절하여 성장 인자(FGF-2)의 방출 속도를 제어할 수 있다.
실험예 2. 만능유도줄기세포의 배양
운반 수단인 렌티바이러스(lentivirus)에 4개의 전사인자(Oct4, Sox2, cMyc, Klf4)를 실어 인간의 피부 세포에 주입한 뒤, 역분화를 통해 배아줄기세포와 유사한 유도만능줄기세포를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 인간 만능유도줄기 세포주는 상기 제조예 1의 하이드로젤(6 wt% 그래핀 옥사이드가 함유된 2.5 mg.ml의 하이드로젤)을 침전시킨 동물세포배양배지(DMEM)에 미토마이신 C 처리된 생쥐의 배아 섬유세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)를 지지세포로 삼아 증식 및 배양하였다. 이때, 배지 성분으로 2mM의 I-글루타민(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1mM의 β-멀캅토에탄올, 1X 비필수 아미노산(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 20%의 knock-out 혈청 대체물(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스테렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 25ng/mL basic FGF(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 공급하였다.
본 발명에서 도 5는 실시예 및 비교예의 배지 모식도(a) 및 상기 배지들에서 3일 및 7일 동안 배양된 만능유도줄기세포의 세포수(b)와 세포 활성도(AP activity)(c)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5(a)에서 hydrogel은 실시예 1에 따른 배지, none는 비교예 1에 따른 배지 및 media는 비교예 2에 따른 배지를 의미한다.
(b)에 나타난 바와 같이, 3일 후의 세포 수는 media(비교예 2), hydrogel(실시예 1), none(비교예 1)으로 media에서 세포수가 가장 많이 측정되었지만, 7일 후에는 실시예 1의 배지에서 생존 세포수가 가장 많이 측정되었다.
또한, (c)에서도 실시예 1의 배지에서 세포 활성도가 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
    상기 하이드로젤에 그래핀 옥사이드 및 배지 성분을 주입하는 단계를 포함하는 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하이드로젤의 밀도는 1 내지 4mg/ml인 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    세포 배양용 하이드로젤의 37℃에서 100 시간 경과 후의 배지 성분의 방출량은 40 내지 100%인 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    그래핀 옥사이드의 함량은 하이드로젤 중량 대비 2 내지 15 중량%인 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    배지 성분은 성장 인자를 포함하는 세포 배양용 하이드로젤의 제조 방법.
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