CN107343968A - 一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和应用，制备植物单宁水溶液和N,N‑二甲基丙烯酰胺水溶液；将两者混合后再加入交联剂；将引发剂水溶液加入反应体系中；将溶液倒入模具中，置于低温反应釜内反应；将模具从低温反应釜中取出，融化后可得到冷冻水凝胶。本发明操作工艺简单，实施条件温和，制备的冷冻水凝胶生物相容性好，可以在凝胶表面黏附多种不同种类的细胞。

Description

一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于可医用的天然生物高分子材料领域，具体涉及一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是由高分子聚合物通过非共价键的物理结合或共价的化学交联而得到的三维网络。由于具有大量的亲水性基团，水凝胶对水具有很高的亲和力，在水中能够溶胀吸收自身几十倍甚至上千倍的水分，并且具有很好的保持水分的能力，即使在外界压力下水分也不会流失，可以很好地模拟人体内的环境，因此，水凝胶在组织工程领域的应用具有得天独厚的优势。作为组织工程材料，水凝胶必须具备良好的生物相容性、力学性能、细胞或蛋白吸附性等。除此之外，连续均匀的多孔结构对于组织工程模块而言是十分必要的。高度连续、孔径可控的多孔结构有利于细胞的粘附、增殖、分化以及组织的形成。不同的孔径分布很大程度上影响着血管形成、细胞养分的运送以及细胞代谢产物的排出。传统的合成类高分子水凝胶（如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等）具备较理想的机械性能，可控制的化学组成、制备过程以及分子量，但其生物相容性较差、孔结构过于致密、对于外部环境的响应缓慢、缺乏生物活性并且不易降解，导致体系不具备细胞识别信号，不适于活性物质和细胞的负载。
植物单宁广泛地存在于植物的叶、果实、根及树皮等部位中，是重要的天然多酚类活性物质，也是天然产物中研究得比较早和较多的一类化合物。植物单宁的多酚羟基化学结构和独特的化学性质使其呈现出具有较强的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性，而且能与蛋白质、多糖、生物碱反应，与金属离子络合，对细菌和酶的抑制，对某些农作物病虫害的抗性，可被用作抑菌剂、抗肿瘤药物、抗氧化剂、防腐剂、鞣革剂、化妆品、黏合剂、水处理剂以及吸附树脂等。
利用互穿聚合物网络与冷冻聚合联合使用的方法，将植物单宁与高分子聚合物相融合，制备的凝胶材料可以有效地解决合成类高分子水凝胶存在的问题。互穿聚合物网络是制备组织工程类水凝胶的一种简单有效的方法。体系中，植物单宁插入到聚合物三维网络中，与网络中的分子链相互之间物理缠绕，形成多孔的结构，依靠两者之间的氢键等分子间作用力维持网络结构的稳定，最大程度地发挥植物单宁亲水性高、抑菌能力以及合成高分子聚合物机械强度较高的优点。另一方面，通过冷冻聚合制备的凝胶，由于其特殊的聚合机理，凝胶通常具备连续、孔密度高的大孔结构，有助于营养物质的扩散和细胞代谢产物的排泄，更好的模拟生物体内的组织器官，为细胞的渗入、生长扩散提供场所，为组织生长所需营养物质与组织代谢物提供通道。并且凝胶的机械强度较高，可以更好地满足其在组织工程领域的使用。将冷冻聚合和互穿聚合物网络联合使用制备组织工程类水凝胶，可以通过调节植物单宁和高分子聚合物的比例以及制备温度等条件对多孔结构包括孔密度、孔径范围加以控制，有效地降低了对所黏附细胞的刺激性，使得所培养细胞能够在凝胶的孔内部进行粘附以及增殖。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的就是为了克服合成类高分子水凝胶存在的孔结构过于致密、不易降解并且缺乏生物活性的缺陷而提供一种具备连续大孔结构、可降解、生物相容性好的植物单宁水凝胶及其制备方法和应用，该方法操作工艺简单，实施条件温和。
技术方案：一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，步骤为：（1）将植物单宁粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度1%-3%的植物单宁水溶液；（2）将N, N-二甲基丙烯酰胺溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成35%-45%的N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液；（3）将上述植物单宁水溶液以及N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液相混合，再加入交联剂，配制成均匀溶液；所述植物单宁:N, N-二甲基丙烯酰胺:交联剂的质量比为（5 ~15）：（100~ 200）：（12 ~ 36）；（4）将引发剂粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度为2% ~ 4%的引发剂水溶液；将有效量的引发剂水溶液加入步骤（3）所得反应体系中；（5）将步骤（4）中的溶液倒入模具中，置于低温反应釜内，在-10 ℃ ~ -40 ℃反应10 min ~ 30min；（6）将步骤（5）中的模具从低温反应釜中取出，在25 ℃ ~ 35 ℃融化后可得到冷冻水凝胶。
上述植物单宁为化香果单宁、板栗苞单宁或橡椀单宁。
上述植物单宁水溶液其质量分数为3%。
上述N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液其质量分数为35%。
上述引发剂为水溶性引发剂如过硫酸铵、过硫酸钾或硝酸铈铵。
上述交联剂为含有不饱和双键的单体，所述交联剂为N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、二丙烯醛缩季戊四醇、二乙二醇二乙烯基醚、二乙烯基-1,4-丁二醇醚、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、双丙酮丙烯酰胺、四烯丙氧基乙烷或乙二醇二甲基丙烯酸酯。
上述方法制得的植物单宁冷冻水凝胶。
上述植物单宁冷冻水凝胶在制备组织工程材料中的应用。
有益效果：（1）本发明方法制备过程高效、简洁、环保；技术实施的条件温和，反应时间短；技术实施工艺简单、产物无需经特殊的后处理工序，反应原料经冷冻后置于低温环境即可进行聚合，聚合热量容易散去。（2）本发明方法制备的冷冻水凝胶，反应过程中无需添加任何助剂，不存在致孔剂残留的问题；（3）利用本发明方法制备的冷冻水凝胶具有连续的多孔结构，孔径大小可由交联剂的用量进行精确调控；（4）利用本发明方法制备的冷冻水凝胶具备极佳的机械强度，在承受高压时仍然能够恢复原状；（5）利用本发明方法制备的冷冻水凝胶可以高效完成体外降解，降解速率可由植物单宁的用量进行精确调控；（6）利用本发明方法制备的冷冻水凝胶生物相容性好，可以在凝胶表面黏附多种不同种类的细胞。
附图说明
图1是植物单宁冷冻水凝胶的成胶过程示意图；
图2是植物单宁冷冻水凝胶内部孔结构扫描电子显微镜图；其中a为采用24 mg交联剂制备的植物单宁冷冻水凝胶内部孔结构，b为采用72 mg交联剂制备的植物单宁冷冻水凝胶内部孔结构；
图3是植物单宁冷冻水凝胶应力-应变曲线图；
图4是植物单宁冷冻水凝胶在体外PBS溶液中降解示意图；其中a为采用3%植物单宁水溶液制备的植物单宁冷冻水凝胶，b为采用1%植物单宁水溶液制备的植物单宁冷冻水凝胶；
图5是中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）在植物单宁冷冻水凝胶培养4天的生长情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
如图1所示，取板栗苞单宁加入去离子水，磁力搅拌直至板栗苞单宁完全溶解，配制成质量百分比浓度3%的板栗苞单宁水溶液。取N, N-二甲基丙烯酰胺加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度35% N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液。将两种溶液按体积比1:2比例混合后置于0 ℃的冰浴中，氩气环境中搅拌1小时。之后加入24 mg二丙烯醛缩季戊四醇继续搅拌10分钟。取硝酸铈铵加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度2%引发剂水溶液。用移液枪滴加1 mL引发剂水溶液，继续机械搅拌10分钟。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 35 × 50 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-40 ℃反应10 min。然后将模具取出，在25 ℃环境下融化后可得到冷冻水凝胶。
将冻凝胶样品置于冷冻干燥机中进行干燥，48小时后，将冻干样品取出，切成小块。然后导电胶贴到样品台上，再将凝胶小块贴到导电胶上，随后镀金以提高导电率。在扫描电子显微镜下观察不同部位的孔结构，随机选取凝胶内部横截面的孔隙图像，如图2中a所示。由图2-a可知，采用24 mg交联剂制备的冷冻水凝胶具备较为明显的孔结构。
将直径约为35 mm的凝胶切成高度约为10 mm的试样，放到材料测试仪的压缩模具中间，以为2 mm/min的速率进行压缩。压缩期间观察冷冻水凝胶在受压下的形变情况。压缩完成后，以初始横截面积计算凝胶的压缩应力，压缩应变以初始高度，计算得出如图3所示的应力-应变曲线。
将冻干的凝胶样品置于去离子水中3天，待凝胶溶胀平衡后，将样品置于pH 7.4的PBS溶液中，在37 ℃条件下进行测试。在指定的时间内将样品取出，用湿滤纸擦掉表面的溶液，然后称重。利用剩余质量百分率计算公式：剩余质量百分率 (%) = 指定时间凝胶重量/溶胀平衡凝胶初始重量 × 100，计算得到如图4中a所示的降解速率曲线。由图4-a可知，采用24 mg交联剂制备的冷冻水凝胶降解速率较快。
从-70 ℃冰箱取出冻存的CHO细胞，在37 ℃水浴中迅速解冻，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）复苏细胞。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代培养。然后将凝胶样品制成直径为10 mm，厚度为2 mm的薄片，置于40%（v/v）乙醇溶液中灭菌12小时，然后再用37 ℃的PBS溶液以及DMEM浸泡过夜，以除去凝胶表面以及内部的乙醇溶液。以上操作均在超净台中完成。接着将灭菌的凝胶样品平铺到6孔板中，以1 × 105/cm2的密度将CHO细胞接种到凝胶表面，37 ℃、5% CO2的条件下分别培养4天。之后将用3%的戊二醛将CHO细胞固定。10分钟后，用25 ℃的PBS溶液淋洗凝胶样品三次，然后在荧光显微镜下观察细胞，得到如图5所示的细胞生长情况示意图。
实施例2
如图1所示，取化香果单宁加入去离子水，磁力搅拌直至单宁完全溶解，配制成质量百分比浓度3%的板栗苞单宁水溶液。取N, N-二甲基丙烯酰胺加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度35% N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液。将两种溶液按体积比1:2比例混合后置于0 ℃的冰浴中，氩气环境中搅拌1小时。之后加入72 mg二丙烯醛缩季戊四醇继续搅拌10分钟。取硝酸铈铵加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度2%引发剂水溶液。用移液枪滴加1 mL引发剂水溶液，继续机械搅拌10分钟。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 35 ×50 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-40 ℃反应10 min。然后将模具取出，在25℃环境下融化后可得到冷冻水凝胶。
将冻凝胶样品置于冷冻干燥机中进行干燥，48小时后，将冻干样品取出，切成小块。然后导电胶贴到样品台上，再将凝胶小块贴到导电胶上，随后镀金以提高导电率。在扫描电子显微镜下观察不同部位的孔结构，随机选取凝胶内部横截面的孔隙图像，如图2中b所示。由图2-b可知，采用72 mg交联剂制备的冷冻水凝胶的孔结构更为致密。
实施例3
如图1所示，取板栗苞单宁加入去离子水，磁力搅拌直至板栗苞单宁完全溶解，配制成质量百分比浓度1%的板栗苞单宁水溶液。取N, N-二甲基丙烯酰胺加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度35% N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液。将两种溶液按体积比1:2比例混合后置于0 ℃的冰浴中，氩气环境中搅拌1小时。之后加入24 mg二丙烯醛缩季戊四醇继续搅拌10分钟。取硝酸铈铵加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度2%引发剂水溶液。用移液枪滴加1 mL引发剂水溶液，继续机械搅拌10分钟。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 35 × 50 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-40 ℃反应10 min。然后将模具取出，在25 ℃环境下融化后可得到冷冻水凝胶。
将冻干的凝胶样品置于去离子水中3天，待凝胶溶胀平衡后，将样品置于pH 7.4的PBS溶液中，在37 ℃条件下进行测试。在指定的时间内将样品取出，用湿滤纸擦掉表面的溶液，然后称重。利用剩余质量百分率计算公式：剩余质量百分率 (%) = 指定时间凝胶重量/溶胀平衡凝胶初始重量 × 100，计算得到如图4中b所示的降解速率曲线。

Claims (8)

1.一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）将植物单宁粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度1%-3%的植物单宁水溶液；
（2）将N, N-二甲基丙烯酰胺溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成35%-45%的N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液；
（3）将上述植物单宁水溶液以及N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液相混合，再加入交联剂，配制成均匀溶液；所述植物单宁:N, N-二甲基丙烯酰胺:交联剂的质量比为（5 ~ 15）：（100~ 200）：（12 ~ 36）；
（4）将引发剂粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度为2% ~ 4%的引发剂水溶液；将有效量的引发剂水溶液加入步骤（3）所得反应体系中；
（5）将步骤（4）中的溶液倒入模具中，置于低温反应釜内，在-10 ℃ ~ -40 ℃反应10min ~ 30 min；
（6）将步骤（5）中的模具从低温反应釜中取出，在25 ℃ ~ 35 ℃融化后可得到冷冻水凝胶。
2.根据权利要求1所述的可用于组织工程植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于所述植物单宁为化香果单宁、板栗苞单宁或橡椀单宁。
3.根据权利要求1所述的可用于组织工程植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于所述植物单宁水溶液其质量分数为3%。
4.根据权利要求1所述的可用于组织工程植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于所述N, N-二甲基丙烯酰胺水溶液其质量分数为35%。
5.根据权利要求1所述的可用于组织工程植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于所述引发剂为水溶性引发剂如过硫酸铵、过硫酸钾或硝酸铈铵。
6.根据权利要求1所述的可用于组织工程植物单宁冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于所述交联剂为含有不饱和双键的单体，所述交联剂为N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、二丙烯醛缩季戊四醇、二乙二醇二乙烯基醚、二乙烯基-1,4-丁二醇醚、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、双丙酮丙烯酰胺、四烯丙氧基乙烷或乙二醇二甲基丙烯酸酯。
7.权利要求1~6任一所述方法制得的植物单宁冷冻水凝胶。
8.权利要求7所述植物单宁冷冻水凝胶在制备组织工程材料中的应用。
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