CN114230811A - 一种可用作细胞载体的构树叶片蛋白水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种可用作细胞载体的构树叶片蛋白水凝胶及其制备方法和应用，制备构树叶片蛋白水溶液和N‑羟乙基丙烯酰胺水溶液；将两者混合后再加入交联剂；将引发剂加入反应体系中；将溶液倒入玻璃模具中，置于低温反应釜内反应；将模具从反应器中取出，融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。本发明操作工艺简单，实施条件温和，制备的构树叶片蛋白水凝胶生物相容性好，可以在凝胶表面黏附多种不同种类的细胞。
Description
技术领域
本发明属于可医用的天然生物高分子材料领域，具体涉及一种可用作细胞载体的构树叶片蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一种具有亲水性的三维网络结构材料，在水中可迅速溶胀并保持溶胀状态而不溶解。由于存在交联网络，溶胀状态的水凝胶可保有大量的水，并很好地模拟人体内的亲水性环境，非常适合不同种类细胞在其三维网络结构的黏附与增殖。作为一种理想的细胞载体材料，水凝胶必须具备良好的生物相容性、力学性能以及连续均匀的多孔-大孔结构。这种高度连续、孔径可控的多孔-大孔结构有利于细胞的粘附、增殖、细胞养分的运送及细胞代谢产物的排出。由单一的小分子单体合成的水凝胶，如聚丙烯酰胺水凝胶、聚丙烯酸水凝胶及聚丙烯酸酯类水凝胶等，虽然具备较理想的机械性能、可控制的化学组成及制备过程，但其生物相容性较差、孔径狭小、孔结构过于致密并且缺乏细胞响应因子，致使这种传统的高分子水凝胶不适于用作细胞载体材料。
构树叶片蛋白安全无毒，属优良的蛋白质天然高分子物质。目前，构树叶片蛋白主要应用在饲料方面，可部分替代豆柏、麦麸等常规饲料，用于猪、牛、羊等家畜养殖。然而，这种蛋白在水凝胶材料制备方面的应用研究则少之又少。蛋白凝胶是变性的蛋白质分子间排斥和吸引相互作用力相平衡的结果。一般认为，形成和维持蛋白质凝胶的作用力主要是疏水相互作用、氢键、静电相互作用等物理作用力，但含有巯基的蛋白质分子间巯基与二硫键的交换反应也可能对蛋白质的凝胶作用有贡献。蛋白凝胶可为不同种类的细胞提供充分的活性位点及细胞响应因子，因此非常适合用作细胞载体。
利用冷冻聚合技术将构树叶片蛋白与高分子聚合物相融合，制备的凝胶材料可以有效地解决单一高分子水凝胶存在的问题。在这一体系中，当含有构树叶片蛋白、高分子单体及引发剂的水溶液在低温下凝固后，这些溶质分子从结冰的溶剂中排出，在冰晶之间没有结冰的微相区域富集。聚合反应在该区域内进行，当冰晶融化之后就可以得到具有大孔隙的材料。在聚合过程中由于非冻结区域的面积较小，使得这一区域的“表面积-体积比”较高，反应物聚集在此完成聚合反应后，冻凝胶的孔壁由密度更高的聚合物组成，因此凝胶在承受高压时仍然能够恢复原状。凝胶所具备的连续多孔-大孔结构，有助于营养物质的扩散和细胞代谢产物的排泄，更好的模拟生物体内的组织器官，为细胞的黏附、增殖提供理想的环境，也为细胞生长所需营养物质与组织代谢物提供通道，更好地满足其作为细胞载体的应用。与此同时，通过构树叶片蛋白、高分子聚合物及交联剂的比例、制备温度等条件对多孔-大孔结构的孔径进行调控，有效增加了不同种类细胞黏附与增殖的适应性，并充分暴露构树叶片蛋白为细胞生长所提供的响应因子。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是为了解决合成类高分子水凝胶存在的孔结构过于狭小、致密并且缺乏细胞响应因子的问题，从而提供一种具有连续的多孔-大孔结构、具备细胞响应因子及生物相容性好的构树叶片蛋白水凝胶及其制备方法和应用，该方法操作工艺简单，实施条件温和。
技术方案：一种可用作细胞载体的构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，步骤为：（1）将构树叶片蛋白粉末置于水溶液中，超声震荡均匀，制成质量浓度2% ~ 4%的构树叶片蛋白水溶液；（2）将N-羟乙基丙烯酰胺溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成30% ~ 40%的N-羟乙基丙烯酰胺水溶液；（3）将上述构树叶片蛋白水溶液以及N-羟乙基丙烯酰胺水溶液相混合，再加入交联剂，配制成混合溶液；所述构树叶片蛋白：N-羟乙基丙烯酰胺：交联剂的质量比为（4 ~ 12）：（80 ~ 160）：（8 ~ 32）；（4）将引发剂粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度为1% ~ 3%的引发剂水溶液；将引发剂水溶液加入步骤（3）所得反应体系中；所述引发剂水溶液：反应体系的质量比为（1 ~ 2）：（120 ~ 360）（5）将步骤（4）中的溶液倒入模具中，置于低温反应釜内，在-20 ℃ ~ -40 ℃反应12 h ~ 24 h；（6）将步骤（5）中的模具从低温反应釜中取出，在25 ℃ ~ 35 ℃融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。
优选的，上述构树叶片蛋白水溶液其质量分数为4%。
优选的，上述N-羟乙基丙烯酰胺水溶液其质量分数为40%。
上述引发剂为水溶性引发剂如过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲酰、过氧化苯甲酰叔丁酯或过氧化甲乙酮。
上述交联剂为含有不饱和双键的单体，所述交联剂为N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、二丙烯醛缩季戊四醇、二乙二醇二乙烯基醚、二乙烯基-1,4-丁二醇醚、乙二醇二甲基丙烯酸酯、一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚氰酸三烯丙酯或四烯丙氧基乙烷。
上述方法制得的构树叶片蛋白水凝胶。
上述构树叶片蛋白水凝胶在制备细胞载体材料中的应用。
有益效果：（1）本发明方法制备过程高效、简洁、环保；技术实施的条件温和；技术实施工艺简单、产物无需经特殊的后处理工序，反应原料经冷冻后置于低温环境即可进行聚合，聚合热量容易散去；（2）利用本发明方法制备的构树叶片蛋白水凝胶，反应过程中无需添加任何助剂，不存在致孔剂残留的问题；（3）利用本发明方法制备的构树叶片蛋白水凝胶具有连续的多孔-大孔结构，孔径大小可由构树叶片蛋白、小分子单体及交联剂的用量进行精确调控；（4）利用本发明方法制备的构树叶片蛋白水凝胶具备极佳的机械强度，在承受高压时仍然能够恢复原状；（5）利用本发明方法制备的构树叶片蛋白水凝胶生物相容性好，可以在凝胶表面黏附多种不同种类的细胞。
附图说明
图1是构树叶片蛋白水凝胶的合成过程示意图；
图2是构树叶片蛋白水凝胶内部孔结构扫描电子显微镜图；其中a为采用16 mg交联剂制备的构树叶片蛋白水凝胶内部孔结构，b为采用64 mg交联剂制备的构树叶片蛋白水凝胶内部孔结构；
图3是构树叶片蛋白水凝胶的含水量；其中a为采用2%构树叶片蛋白水溶液制备的构树叶片蛋白水凝胶12 h后的含水量，b为采用4%构树叶片蛋白水溶液制备的构树叶片蛋白水凝胶12 h后的含水量；
图4是构树叶片蛋白水凝胶应力-应变曲线图；
图5是不同种类细胞在构树叶片蛋白水凝胶培养72 h的生长情况示意图。a为非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7细胞）；b为人肾上皮细胞（293T细胞）；c为中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
如图1所示，将构树叶片蛋白粉末加入去离子水，超声震荡均匀，配制成质量百分比浓度4%的构树叶片蛋白水溶液。将N-羟乙基丙烯酰胺加入去离子水，磁力搅拌搅拌均匀，制成质量百分比浓度40%的N-羟乙基丙烯酰胺水溶液。将构树叶片蛋白水溶液和N-羟乙基丙烯酰胺水溶液按体积比1:3比例混合后置于0 ℃的冰盐浴中，氮气环境中搅拌30 min。之后在12 mL混合溶液中加入16 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯继续搅拌10 min。取过硫酸钾加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度1%引发剂水溶液。用胶头滴管逐滴滴加2 mL引发剂水溶液，继续搅拌30 min。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 25 × 40 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-30 ℃反应12 h。然后将模具取出，在30 ℃环境下融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。
将构树叶片蛋白水凝胶置于500 mL去离子水中，每隔4 h换一次水。12 h后取出水凝胶，置于-18 ℃冰箱中继续冷冻12 h。将冷冻样品取出后置于冻干机中进行干燥，24 h后取出干燥好的样品，切成2 mm见方小块。将凝胶小块贴到铜制样品台上，喷金后在扫描电子显微镜下观察其内部孔结构。随机选取凝胶内部横截面的孔隙图像，如图2中a所示。由图2-a可知，采用16 mg交联剂制备的构树叶片蛋白水凝胶孔径更大。
将已知重量的构树叶片蛋白冻干凝胶置于500 mL去离子水中，12 h后取出溶胀平衡的水凝胶，用湿滤纸擦掉表面的离子水后称重。利用含水量计算公式：含水量（%）=（溶胀平衡凝胶重量-冻干凝胶重量）/溶胀平衡凝胶重量 × 100，计算得到如图3中所示的含水量情况。由图3-a可知，采用4%的构树叶片蛋白水溶液制备的水凝胶含水量更高。
利用环形切刀将构树叶片蛋白水凝胶切成直径15 mm、高度10 mm的试样，然后在万能材料测试机的压缩模具中以2 mm/min的速率进行压缩。测试完成后，首先观察构树叶片蛋白水凝胶的恢复情况，有无明显压缩裂痕出现；然后以初始横截面积计算凝胶的压缩应力，压缩应变以初始高度为准，得出如图4所示的应力-应变曲线，最大应力0.0372 MPa，对应应变94.7%。
从细胞冷冻箱取出冻存的COS-7、293T及CHO细胞，在37 ℃水浴中迅速解冻，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）复苏细胞。在37℃、5% CO2的培养箱中培养，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代培养。在超净台中，将构树叶片蛋白水凝胶样品制成厚度为2 mm的薄片，利用紫外线灭菌12 h，然后将构树叶片蛋白水凝胶样品平铺到24孔细胞培养板中，以1 × 104/每孔的密度将三种细胞接种到凝胶表面，37 ℃、5% CO2的条件下分别培养72 h。之后将用3%的戊二醛将细胞固定。10 min后，用37 ℃的PBS溶液淋洗凝胶样品三次，然后在荧光显微镜下观察细胞，得到如图5所示的细胞生长情况示意图。其中，COS-7细胞舒展地平铺在凝胶表面，细胞体积增大、胞体伸出突起并且出现分枝和伪足，证明构树叶片蛋白水凝胶对COS-7细胞的黏附效果最为理想。
实施例2
如图1所示，将构树叶片蛋白粉末加入去离子水，超声震荡均匀，配制成质量百分比浓度4%的构树叶片蛋白水溶液。将N-羟乙基丙烯酰胺加入去离子水，磁力搅拌搅拌均匀，制成质量百分比浓度40%的N-羟乙基丙烯酰胺水溶液。将构树叶片蛋白水溶液和N-羟乙基丙烯酰胺水溶液按体积比1:3比例混合后置于0 ℃的冰盐浴中，氮气环境中搅拌30 min。之后在12 mL混合溶液中加入64 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯继续搅拌10 min。取过硫酸钾加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度1%引发剂水溶液。用胶头滴管逐滴滴加2 mL引发剂水溶液，继续搅拌30 min。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 25 × 40 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-30 ℃反应12 h。然后将模具取出，在30 ℃环境下融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。
将构树叶片蛋白水凝胶置于500 mL去离子水中，每隔4 h换一次水。12 h后取出水凝胶，置于-18 ℃冰箱中继续冷冻12 h。将冷冻样品取出后置于冻干机中进行干燥，24 h后取出干燥好的样品，切成2 mm见方小块。将凝胶小块贴到铜制样品台上，喷金后在扫描电子显微镜下观察其内部孔结构。随机选取凝胶内部横截面的孔隙图像，如图2中b所示，采用64mg交联剂制备的构树叶片蛋白水凝胶的孔径更小。
实施例3
如图1所示，将构树叶片蛋白粉末加入去离子水，超声震荡均匀，配制成质量百分比浓度2%的构树叶片蛋白水溶液。将N-羟乙基丙烯酰胺加入去离子水，磁力搅拌搅拌均匀，制成质量百分比浓度40%的N-羟乙基丙烯酰胺水溶液。将构树叶片蛋白水溶液和N-羟乙基丙烯酰胺水溶液按体积比1:3比例混合后置于0 ℃的冰盐浴中，氮气环境中搅拌30 min。之后在12 mL混合溶液中加入16 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯继续搅拌10 min。取过硫酸钾加入去离子水，搅拌均匀，制成质量百分比浓度1%引发剂水溶液。用胶头滴管逐滴滴加2 mL引发剂水溶液，继续搅拌30 min。将此混合液从冰浴中取出，倒入Ø 25 × 40 mm模具中，将此模具置于低温反应釜中，在-30 ℃反应12 h。然后将模具取出，在30 ℃环境下融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。
将已知重量的构树叶片蛋白冻干凝胶置于500 mL去离子水中，12 h后取出溶胀平衡的水凝胶，用湿滤纸擦掉表面的离子水后称重。利用含水量计算公式：含水量（%）=（溶胀平衡凝胶重量-冻干凝胶重量）/溶胀平衡凝胶重量 × 100，计算得到如图3中所示的含水量情况。由图3-b可知，采用2%的构树叶片蛋白水溶液制备的水凝胶含水量更低。
Claims (7)
1.一种可用作细胞载体的构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于步骤为：（1）将构树叶片蛋白粉末置于水溶液中，超声震荡均匀，制成质量浓度2% ~ 4%的构树叶片蛋白水溶液；（2）将N-羟乙基丙烯酰胺溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成30% ~ 40%的N-羟乙基丙烯酰胺水溶液；（3）将上述构树叶片蛋白水溶液以及N-羟乙基丙烯酰胺水溶液相混合，再加入交联剂，配制成混合溶液；所述构树叶片蛋白：N-羟乙基丙烯酰胺：交联剂的质量比为（4~ 12）：（80 ~ 160）：（8 ~ 32）；（4）将引发剂粉末溶解于去离子水中，搅拌均匀，制成质量浓度为1% ~ 3%的引发剂水溶液；将引发剂水溶液加入步骤（3）所得反应体系中；所述引发剂水溶液:反应体系的质量比为（1 ~ 2）：（120 ~ 360）；（5）将步骤（4）中的溶液倒入模具中，置于低温反应釜内，在-20 ℃ ~ -40 ℃反应12 h ~ 24 h；（6）将步骤（5）中的模具从低温反应釜中取出，在25 ℃ ~ 35 ℃融化后可得到构树叶片蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用作细胞载体构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述构树叶片蛋白水溶液其质量分数为4%。
3.根据权利要求1所述的用作细胞载体构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述N-羟乙基丙烯酰胺水溶液其质量分数为40%。
4.根据权利要求1所述的用作细胞载体构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述引发剂为水溶性引发剂如过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲酰、过氧化苯甲酰叔丁酯或过氧化甲乙酮。
5.根据权利要求1所述的用作细胞载体构树叶片蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述交联剂为含有不饱和双键的单体，所述交联剂为N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、二丙烯醛缩季戊四醇、二乙二醇二乙烯基醚、二乙烯基-1,4-丁二醇醚、乙二醇二甲基丙烯酸酯、一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚氰酸三烯丙酯或四烯丙氧基乙烷。
6.权利要求1~5任一所述方法制得的构树叶片蛋白水凝胶。
7.权利要求6所述构树叶片蛋白水凝胶在制备细胞载体材料中的应用。
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| KR101419271B1 (ko) * | 2014-03-14 | 2014-07-14 | 김주덕 | 실온 반응형 캡슐이 혼합된 하이드로겔 팩제의 제조방법 및 그 제조방법에 의한 하이드로겔 팩제 |
| CN107343968A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-11-14 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 一种可用于组织工程的植物单宁冷冻水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN108066160A (zh) * | 2016-11-18 | 2018-05-25 | 吴汉善 | 形成微穿孔的水凝胶贴片的制造方法以及使用该方法制造的水凝胶贴片 |
| CN113045717A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-06-29 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 一种负载脂肪干细胞和血浆的明胶-丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
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