CN107050509A - 一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料及其制备方法 - Google Patents

一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种以海藻酸钠、壳聚糖为原料的具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料及其制备方法，属于组织工程骨支架材料领域。支架材料由缓释微球和疏松多孔海绵状结构组成，两者均可搭载药物。缓释微球为“海藻酸钠‑壳聚糖多层复合缓释微球”的多层球结构，核心球为海藻酸钠，奇数层球壳为壳聚糖，偶数层球壳为海藻酸钠；疏松多孔海绵状结构是海藻酸钠、壳聚糖通过正负离子交联形成的，具有良好的内部三维孔隙结构。缓释微球和疏松多孔海绵状结构间通过正负电荷的相互作用在不改变两者原有结构的基础上有机的结合在一起。本发明可以根据需要制备出搭载缓释不同药物的不同物理特性的个性化新型可塑性缓释微球型支架材料。

Description

一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料及 其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程骨支架材料领域，具体涉及一种以海藻酸钠、壳聚糖为原料的具有搭载多种药物功能的新型可塑性缓释微球型支架材料及其制备方法。
背景技术
随着人们物质生活水平提高，严重意外事故创伤、患者肿瘤切除、感染等因素所致的骨缺损的诊治变得更加复杂。目前临床上自体骨移植是最有效的方法，但自体骨的来源有限，其提取会对患者生理、心理造成二次伤害。因此同种异体骨以较好的骨传导性成为目前临床上最主要的骨移植材料，但在处理过程中，为了降低异体骨的免疫原性，除去了异体骨细胞成分因而使异体骨丧失了直接成骨活性，造成成骨能力下降及部分移植骨坏死的发生。
近年来，组织工程学通过种子细胞体外扩增并复合于支架材料构建有生物活性的骨移植物，弥补了单纯异体骨无直接成骨活性的不足。但在骨移植过程中，新移植的组织工程骨与宿主相容性差，短期内不能与宿主建立良好的血供关系，并且骨移植手术存在创口且骨缺损处存在感染或潜在感染几率，血液中生物因子和药物很难在移植组织工程骨内部聚集并发挥作用，缺乏生物因子调节的组织工程骨成骨活性潜能不能完全发挥，潜在细菌的大量繁殖可引起移植组织工程骨的感染，导致移植失败。
海藻酸钠和壳聚糖是近年来在生物医药、组织工程领域得到广泛应用的天然生物高分子材料，具有生物相容性好、无毒可降解等优良性能。海藻酸钠与壳聚糖均为天然高分子多糖，壳聚糖的侧链化学结构中含有大量游离的氨基，呈现为聚阳离子性；海藻酸钠的侧链化学结构中含有大量游离的羧基，呈现聚阴离子性，二者通过正负电荷相互吸引可发生络合反应，生成的复合物即可用于制备负载药物的缓释微球，又可用于构建组织工程骨的支架材料。
本发明首先利用两种原料层层自组装成负载药物的缓释微球结构，又按一定质量比例复合成疏松多孔海绵状结构，将缓释微球结构嵌入疏松多孔海绵状结构之中，在正负电荷的吸引下发生络合反应，制备得到具有搭载多种药物功能的新型可塑性缓释微球型支架材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以海藻酸钠、壳聚糖为原料的具有搭载多种药物功能的新型可塑性缓释微球型支架材料及其制备方法。
本发明所述支架材料由缓释微球和疏松多孔海绵状结构组成。缓释微球为海藻酸钠-壳聚糖多层复合缓释微球的多层球结构，核心球为海藻酸钠，可以搭载一种以上的药物，奇数层球壳为壳聚糖(如第一层、第三层球壳为壳聚糖)，偶数层球壳为海藻酸钠(如第二层、第四层球壳为海藻酸钠)，每一层球壳均可搭载相同或不同的药物；疏松多孔海绵状结构是海藻酸钠、壳聚糖通过正负离子交联形成的，具有良好的内部三维孔隙结构。以上提到的药物包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、成骨生长肽、万古霉素(VAN)、头孢氨苄(Cef)等。海藻酸钠侧链羧基基团带负电，壳聚糖侧链氨基基团带正电，通过正负电荷相互吸引发生络合反应的原理，缓释微球和疏松多孔海绵状结构间通过正负电荷的相互作用在不改变两者原有结构的基础上有机的结合在一起。
本发明所述的一种具有搭载多种药物功能的新型可塑性缓释微球型支架材料的制备方法，其步骤如下：
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液：
取海藻酸钠固体溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液(以下内容如非特殊指明，均为无菌去离子水溶液)中，制备得到海藻酸钠质量分数1～4％的海藻酸钠醋酸溶液；
按壳聚糖与海藻酸钠质量比为1:1～1.5的比例，称取壳聚糖固体溶解于上述海藻酸钠醋酸溶液；再加入0.5～1mol/L NaOH溶液调pH＝5～5.5，制备得到壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液；
(1.2)制备缓释微球：
(1.2.1)将海藻酸钠溶解于无菌去离子水，制备得到海藻酸钠质量分数2～6％的海藻酸钠溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的海藻酸钠溶液，药物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0～5：100(当体积用量为0：100时，表示不载药)；将氯化钙溶于无菌去离子水，制备得到氯化钙质量分数10～20％的氯化钙溶液；按载药或不载药的海藻酸钠溶液与氯化钙溶液体积比为1：1～3的比例，将海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入氯化钙溶液中，200～300r/min匀速搅拌20～40min，过滤制备得到载药或不载药的核心微球；
(1.2.2)将壳聚糖溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液中，制备得到壳聚糖质量分数1～2％的壳聚糖醋酸溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与壳聚糖醋酸溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液，药物溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为0～5：100(当体积用量为0：100时，表示不载药)；将步骤(1.2.1)制备得到的载药或不载药的核心微球逐粒投入到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液中，载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液的体积为投入核心微球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌10～20min，过滤制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球；
(1.2.3)将海藻酸钠溶解于无菌去离子水，制备得到海藻酸钠质量分数0.5～1％的海藻酸钠溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的海藻酸钠溶液，药物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0～5：100(当体积用量为0：100时，表示不载药)；将步骤(1.2.2)制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入到载药或不载药的海藻酸钠溶液中，载药或不载药的海藻酸钠溶液的体积为投入单层核心球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌2～4min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球；
(1.2.4)将壳聚糖溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液中，制备得到壳聚糖质量分数1～2％的壳聚糖醋酸溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与壳聚糖醋酸溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液，药物溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为0～5：100(当体积用量为0：100时，表示不载药)；将步骤(1.2.3)制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液中，载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液的体积为投入二层微球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌10～20min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
重复步骤(1.2.3)和步骤(1.2.4)可依次制备得到多层缓释微球，将制备得到的多层缓释微球于-20～-30℃预冻12～24h，再于-60～-80℃冻干直至重量不再发生变化，即得缓释微球成品；
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为1：1～19的比例，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300～500r/min匀速搅拌10～30min至缓释微球分布均匀后，倒入柱形或方形或其他形状的模具中，-20～-30℃下预冻12～24h，后于-60～-80℃冻干18～32h，恢复至室温再经3％～5％(w/v)的氯化钙溶液浸泡处理30min～2h后，-20～-30℃下预冻12～24h，再于-60～-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到本发明所述的可塑性缓释微球型支架材料。
本发明利用缓释微球具有良好的生物相容性，优秀的载药及缓释功能；壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液冻干后呈疏松多孔海绵状结构，具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、特定的三维外形、优化的内部三维孔隙结构，基本满足作为组织工程骨支架材料所要求的物理特性；通过海藻酸钠侧链羧基基团带负电，壳聚糖侧链氨基基团带正电，正负电荷相互吸引发生络合反应的原理，将缓释微球与海绵状结构通过正负电荷的相互作用在不改变两者原有结构的基础上有机的结合在了一起。
本发明与现有技术相比优点在于：
1)作为一种新型组织工程骨支架材料，除了满足支架材料所要求的可控的生物降解性、特定的三维外形、优化的内部三维孔隙结构等物理特性，还能够搭载多种药物，有助于组织工程骨早期移植坏死率的降低。
2)本发明使用的两种天然高分子原料，具有一定的生物活性，抗菌性，促成骨活性。
3)作为一种新型组织工程骨支架材料，在冻干前为液态，具有一定的流动性，冻干后的形态与冻干前入模具形态一致，因此具有很强的可塑性，即可批量生产，又可根据患者骨缺损的大小、形状进行个体化组织工程骨修复骨缺损的治疗。
4)作为一种新型组织工程骨支架材料，原料种类少，制作工艺简单。无需有机溶剂，安全无污染，可操作性强，前景广阔。两种原料结合的原理为正负电荷互相吸引发生络合反应，对包裹的药物没有影响。缓释微球结构和海绵状结构结合的原理也为正负电荷互相吸引发生络合反应，连接紧密的同时又不影响二者原有结构，最大限度的保证了缓释微球结构搭载缓释药物的功能和海绵状结构的物理特性。
5)本发明可以通过调整缓释微球与海绵状结构的比例，来达到在一定范围内调整新型可塑性缓释微球型支架材料搭载缓释药物的总药量、瞬时药物浓度、缓释时间以及孔隙率、收缩率、溶胀度、降解速率等物理特性，可以根据需要制备得到搭载缓释不同药物的不同物理特性的个性化新型可塑性缓释微球型支架材料。
附图说明
图1：为新型可塑性缓释微球型支架材料的圆柱体成品照片的俯视图，主体为海绵状结构，箭头指示的位置是支架材料中的缓释微球结构。
图2：为新型可塑性缓释微球型支架材料的圆柱体成品照片的侧视图，主体为海绵状结构，箭头指示的位置是支架材料中的缓释微球结构。
图3：为单一缓释微球结构(a)和新型可塑性缓释微球型支架材料的扫描电镜照片(b，其中虚线部分为缓释微球结构与疏松多孔海绵状结构结合部分大致的分界处，c为疏松多孔海绵状结构外表面部分，d为疏松多孔海绵状结构纵剖面结构。)。
图4：为新型可塑性缓释微球型支架材料的红外曲线(前后箭头的指示分别为海藻酸钠与壳聚糖特异性官能团峰值，表明新型可塑性缓释微球型支架材料由海藻酸钠和壳聚糖组合制成)；
图5：为新型可塑性缓释微球型支架材料中缓释微球不同组分比下的孔隙率(图中percentage＝10％、20％、30％、40％分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4)；
图6：为新型可塑性缓释微球型支架材料中缓释微球不同组分比下的收缩率曲线(图中percentage＝10％、20％、30％、40％分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4)；
图7：为新型可塑性缓释微球型支架材料中缓释微球不同组分比下的溶胀率曲线(图中percentage＝10％、20％、30％、40％分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4)；
图8：为新型可塑性缓释微球型支架材料中缓释微球不同组分比下的降解速率曲线(图中example1、2、3、4分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4)；
图9：为新型可塑性缓释微球型支架材料的细胞毒性试验结果(图中controlgroup对应对照组，experimental group对应实验组)。
具体实施办式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不仅限于此。
实施例1
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取2g海藻酸钠固体，加入100mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到海藻酸钠质量分数为2％的海藻酸钠醋酸溶液。称取1.67g壳聚糖固体，加入100mL海藻酸钠醋酸溶液搅拌溶解，滴加1mol/L NaOH溶液调pH＝5，制备得到100mL壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液。
(1.2)制备缓释微球：
称取4g海藻酸钠固体溶解于96mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为4％的海藻酸钠溶液；称取15g氯化钙固体溶解于85mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为15％的氯化钙溶液。量取20mL质量分数为4％的海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入30mL质量分数为15％的氯化钙溶液中，300r/min匀速搅拌30min，过滤，制备得到核心微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的核心微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球。
称取0.5g海藻酸钠固体溶解于99.5mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为0.5％的海藻酸钠溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入30mL质量分数为0.5％海藻酸钠溶液，500r/min匀速搅拌2min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球。将制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球于-20℃预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，制备得到缓释微球成品。
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
称取3g氯化钙固体溶解于97mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为3％的氯化钙溶液。
按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为1：9，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300r/min匀速搅拌15min至缓释微球分布均匀后，取2mL倒入24孔板一板孔，-20℃下预冻24h，后于-80℃冻干24h，恢复室温后质量分数为3％的氯化钙溶液浸泡处理(液面没过支架材料)1h后，-20℃下预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到组分比为1:9的新型可塑性缓释微球型支架材料，产物质量为0.154±0.005g。
实施例2
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取2g海藻酸钠固体，加入100mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到海藻酸钠质量分数为2％的海藻酸钠醋酸溶液。称取1.67g壳聚糖固体，加入100mL海藻酸钠醋酸溶液搅拌溶解，滴加1mol/L NaOH溶液调pH＝5，制备得到100mL壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液。
(1.2)制备缓释微球：
称取4g海藻酸钠固体溶解于96mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为4％的海藻酸钠溶液称取；15g氯化钙固体溶解于85mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为15％的氯化钙溶液。量取20mL质量分数为4％的海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入30mL质量分数为15％的氯化钙溶液中，300r/min匀速搅拌30min，过滤，制备得到核心微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的核心微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球。
称取0.5g海藻酸钠固体溶解于99.5mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为0.5％的海藻酸钠溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入30mL质量分数为0.5％海藻酸钠溶液，500r/min匀速搅拌2min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球。将制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球于-20℃预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，制备得到缓释微球成品。
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
称取3g氯化钙固体溶解于97mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为3％的氯化钙溶液。按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为2:8，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300r/min匀速搅拌15min至缓释微球分布均匀后，取2mL倒入24孔板一板孔，-20℃下预冻24h，后于-80℃冻干24h，恢复室温后经3％(w/v)的氯化钙溶液浸泡处理(液面没过支架材料)1h后，-20℃下预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到组分比为2:8的新型可塑性缓释微球型支架材料，产物质量为0.159±0.003g。
实施例3：
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取2g海藻酸钠固体，加入100mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到海藻酸钠质量分数为2％的海藻酸钠醋酸溶液。称取1.67g壳聚糖固体，加入100mL海藻酸钠醋酸溶液搅拌溶解，滴加1mol/L NaOH溶液调pH＝5，制备得到100mL壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液。
(1.2)制备缓释微球：
称取4g海藻酸钠固体溶解于96mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为4％的海藻酸钠溶液称取；15g氯化钙固体溶解于85mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为15％的氯化钙溶液。量取20mL质量分数为4％的海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入30mL质量分数为15％的氯化钙溶液中，300r/min匀速搅拌30min，过滤，制备得到核心微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的核心微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球。
称取0.5g海藻酸钠固体溶解于99.5mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为0.5％的海藻酸钠溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入30mL质量分数为0.5％海藻酸钠溶液，500r/min匀速搅拌2min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球。将制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球于-20℃预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，制备得到缓释微球成品。
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
称取3g氯化钙固体溶解于97mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为3％的氯化钙溶液。按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为3:7，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300r/min匀速搅拌15min至缓释微球分布均匀后，取2mL倒入24孔板一板孔，-20℃下预冻24h，后于-80℃冻干24h，恢复室温后经3％(w/v)的氯化钙溶液浸泡处理(液面没过支架材料)1h后，-20℃下预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到组分比为3:7的新型可塑性缓释微球型支架材料，产物质量为0.171±0.005g。
实施例4：
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取2g海藻酸钠固体，加入100mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到海藻酸钠质量分数为2％的海藻酸钠醋酸溶液。称取1.67g壳聚糖固体，加入100mL海藻酸钠醋酸溶液搅拌溶解，滴加1mol/L NaOH溶液调pH＝5，制备得到100mL壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液。
(1.2)制备缓释微球：
称取4g海藻酸钠固体溶解于96mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为4％的海藻酸钠溶液称取；15g氯化钙固体溶解于85mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为15％的氯化钙溶液。量取20mL质量分数为4％的海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入30mL质量分数为15％的氯化钙溶液中，300r/min匀速搅拌30min，过滤，制备得到核心微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的核心微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球。
称取0.5g海藻酸钠固体溶解于99.5mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为0.5％的海藻酸钠溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入30mL质量分数为0.5％海藻酸钠溶液，500r/min匀速搅拌2min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球。
量取1mL冰醋酸加入100mL的容量瓶无菌去离子水定容，制备得到体积分数1％醋酸溶液；称取1g壳聚糖固体，加入99mL体积分数1％醋酸溶液中搅拌溶解，制备得到壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液。将制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入30mL壳聚糖质量分数为1％的壳聚糖醋酸溶液，500r/min匀速搅拌10min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球。将制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球于-20℃预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，制备得到缓释微球成品。
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
称取3g氯化钙固体溶解于97mL无菌去离子水溶液中制备得到质量分数为3％的氯化钙溶液。按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为4:6，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300r/min匀速搅拌15min至缓释微球分布均匀后，取2mL倒入24孔板一板孔，-20℃下预冻24h，后于-80℃冻干24h，恢复室温后经3％(w/v)的氯化钙溶液浸泡处理(液面没过支架材料)1h后，-20℃下预冻24h，再于-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到组分比为4:6的新型可塑性缓释微球型支架材料，产物质量为0.206±0.013g。
新型可塑性缓释微球型支架材料性能测定：
表观形态：
将实施例1制备得到新型可塑性缓释微球型支架材料根据实验要求制备得到合适的扫描样品，经表面喷金处理后，置于扫描电镜下观察表观结构。
红外扫描：
将实施例1根据实验要求制备得到合适的扫描样品，置于红外光谱仪，分析所得红外光谱。
孔隙率测定：
采用乙醇位移法测定孔隙率，将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备得到新型可塑性缓释微球型支架材料放入干燥箱(50℃)中烘干30min，用游标卡尺精确测量圆柱形材料的高(h)，底面半径(r)，体积(V)＝S×h＝πr2h。分析天平称干重为m1。将圆柱形支架材料充分浸入无水乙醇中，摇床震荡30min使气泡完全消失，取出立即称重m2，无水乙醇密度记做ρ。孔隙率按以下公式计算。重复5次。实验结果如图5所示。
支架孔隙率(R)的计算式为：
收缩率测定：
将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备得到新型可塑性缓释微球型支架材料放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷却至室温。使用游标卡尺精确测量24孔板孔底内径d0，测量圆柱体材料底面直径d1。收缩率按以下公式计算。重复5次。实验结果如图6所示。
收缩率(C)的计算公式为：C＝(d0-d1)/d0×100％。
溶胀度测定：
将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备得到新型可塑性缓释微球型支架材料，放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷却至室温，称重m1，置于无菌PBS溶液中浸泡，摇床震荡24h，取出称重m2。溶胀度按以下公式计算。重复5次。实验结果如图7所示。
溶胀度(r)的计算公式为：r＝m2/m1×100％。
降解速率测定：
将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备得到新型可塑性缓释微球型支架材料，放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷却至室温，分析天平测得干重m0，置于无菌PBS溶液中浸泡。每隔5天，将材料从PBS溶液中取出，放置干燥箱(50℃)中烘干24h，完全干燥后冷却至室温，称重m1，计数后置于PBS溶液中浸泡。直至第20天。重复5次。支架剩余质量分数按以下公式计算并绘制降解曲线。
支架剩余质量分数(w)的计算公式为：w＝m1/m0×100％。
细胞毒性实验：
将实施例1制备得到的材料放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷却至室温，置于24孔板板孔，浸泡2mL无菌细胞培养液中，放置72小时后吸出浸出液，无菌滤纸过滤1次，细菌滤器过滤3次，制备得到含支架浸出液的细胞培养液。0.25％胰蛋白酶消化的第三代间充质干细胞，调整细胞密度为2×103个/孔接种于96孔板中，将细胞分为对照组和实验组，对照组更换完全细胞培养液培养细胞，实验组更换含有支架浸出液的完全细胞培养液培养细胞，每组设3个复孔。37℃培养箱中培养。分别与24h，48h，72h取出，按照cck-8试剂盒操作，每孔100微升加入含10％cck-8试剂的完全细胞培养液(加入试剂前使用完全细胞培养基清洗一次)，37℃培养箱中孵育2h，吸出含10％cck-8试剂的培养液于新96孔板中450nm全自动酶标仪测O.D.值。
实验结果分析：
表观形态：
扫描电镜下观察缓释微球型支架的结果如图3。其表面结构疏松多孔，各空隙间相互连通，横断面结构疏松。多个镜下视野观察，孔径直径在90～240微米。疏松多孔海绵状结构紧密包裹缓释微球结构，缓释微球结构完整。
红外扫描：
所得红外光谱如图4。图中箭头所指的部分为海藻酸钠及壳聚糖特异性官能团峰值，表明疏松多孔海绵状结构与缓释微球结构通过静电作用结合。
物理学特性检测：
测得实施例1样品孔隙率为70±1％，收缩率为4.8±0.4％，溶胀度为927.8±29.0％。
测得实施例2样品孔隙率为64±1％，收缩率为11.0±0.2％，溶胀度为784.6±24.7％。
测得实施例3样品孔隙率为60±1％，收缩率为14.8±0.9％，溶胀度为589.1±12.3％。
测得实施例4样品孔隙率为54±2％，收缩率为16.1±0.3％，溶胀度为489.1±8.2％。
实施例1、实施例2、实施例3、实施例4样品降解速率曲线见图8。
细胞毒性实验：
测得细胞生长形况如图9，数据进行SPSS18.0处理，计量资料采用均数±标准差表示，p>0.05认为对照组和实验组没有统计学意义，不认为缓释微球支架材料浸出液对细胞增值存在毒性。

Claims (3)

1.一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料的制备方法，其步骤如下：
(1)制备壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液和缓释微球：
(1.1)配置壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液：
取海藻酸钠固体溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液中，制备得到海藻酸钠质量分数1～4％的海藻酸钠醋酸溶液；
按壳聚糖与海藻酸钠质量比为1:1～1.5的比例，称取壳聚糖固体溶解于上述海藻酸钠醋酸溶液；再加入0.5～1mol/L NaOH溶液调pH＝5～5.5，制备得到壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液；
(1.2)制备缓释微球：
(1.2.1)将海藻酸钠溶解于无菌去离子水，制备得到海藻酸钠质量分数2～6％的海藻酸钠溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的海藻酸钠溶液，药物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0～5：100；将氯化钙溶于无菌去离子水，制备得到氯化钙质量分数10～20％的氯化钙溶液；按载药或不载药的海藻酸钠溶液与氯化钙溶液体积比为1：1～3的比例，将海藻酸钠溶液逐滴匀速滴入氯化钙溶液中，200～300r/min匀速搅拌20～40min，过滤制备得到载药或不载药的核心微球；
(1.2.2)将壳聚糖溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液中，制备得到壳聚糖质量分数1～2％的壳聚糖醋酸溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与壳聚糖醋酸溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液，药物溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为0～5：100；将步骤(1.2.1)制备得到的载药或不载药的核心微球逐粒投入到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液中，载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液的体积为投入核心微球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌10～20min，过滤制备得到海藻酸钠-壳聚糖单层核心球；
(1.2.3)将海藻酸钠溶解于无菌去离子水，制备得到海藻酸钠质量分数0.5～1％的海藻酸钠溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的海藻酸钠溶液，药物溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0～5：100；将步骤(1.2.2)制备得到的海藻酸钠-壳聚糖单层核心球逐粒投入到载药或不载药的海藻酸钠溶液中，载药或不载药的海藻酸钠溶液的体积为投入单层核心球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌2～4min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球；
(1.2.4)将壳聚糖溶解于体积分数1～2％的醋酸溶液中，制备得到壳聚糖质量分数1～2％的壳聚糖醋酸溶液；将药物溶解于无菌去离子水，制备得到药物质量分数1～5％的药物溶液；再将药物溶液与壳聚糖醋酸溶液混合均匀，制备得到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液，药物溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为0～5：100；将步骤(1.2.3)制备得到的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠二层微球逐粒投入到载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液中，载药或不载药的壳聚糖醋酸溶液的体积为投入二层微球总体积的1～3倍，500～800r/min匀速搅拌10～20min，过滤，制备得到海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
重复步骤(1.2.3)和步骤(1.2.4)可依次制备得到多层缓释微球，将制备得到的多层缓释微球于-20～-30℃预冻12～24h，再于-60～-80℃冻干直至重量不再发生变化，即得缓释微球成品；
(2)制备可塑性缓释微球型支架材料：
按步骤(1.2)制备得到的缓释微球成品与步骤(1.1)制备得到的壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液体积比为1：1～19的比例，将缓释微球成品逐粒加入壳聚糖海藻酸钠醋酸溶液，300～500r/min匀速搅拌10～30min至缓释微球分布均匀后，倒入柱形或方形或其他形状的模具中，-20～-30℃下预冻12～24h，后于-60～-80℃冻干18～32h，恢复至室温再经3％～5％(w/v)的氯化钙溶液浸泡处理30min～2h后，-20～-30℃下预冻12～24h，再于-60～-80℃冻干直至重量不再发生变化，即可制备得到本发明所述的可塑性缓释微球型支架材料。
2.如权利要求1所述的一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料的制备方法，其步骤如下：药物为血管内皮生长因子、成骨生长肽、万古霉素或头孢氨苄。
3.一种具有搭载多种药物功能的可塑性缓释微球型支架材料，其特征在于：是由权利要求1～2任何一项方法制备得到。
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