CN110368528B - 一种可注射多孔微芯片及其多级分时递送载体的制备方法 - Google Patents

一种可注射多孔微芯片及其多级分时递送载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可注射多孔微芯片及其多级分时递送载体的制备方法。可注射多孔微芯片的制备方法包括步骤：1)将海藻酸钠溶液吸入注射器，通过针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的聚四氟乙烯板上；2)待微液滴滴好后，将聚四氟乙烯板置于4℃冰箱1h，然后静置于‑20℃冰箱12h；3)接着进行冷冻干燥步骤，直至完全冻干；(4)向冻干后的聚四氟乙烯板上的微片滴加适量的2％氯化钙(w/v)交联剂，充分交联5‑10min，然后用PBS浸洗3次；5)将微片转移至装有PBS的离心管中，置于4℃冰箱2‑3d，并隔天换一次PBS；6)将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得可注射多孔微芯片。

Description

一种可注射多孔微芯片及其多级分时递送载体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种可注射多孔载体的制备方法，属于再生医学及细胞治疗领域，特别涉及一种可注射多孔微芯片多级分时递送载体的制备方法。
背景技术
近年来，可注射生物材料的广泛研究，极大地助推了再生医学及细胞治疗的发展；各国科研人员普遍认为可注射生物材料是未来生物材料的重要发展方向。可注射生物材料可通过微创的方式被植入体内，对人体伤害程度小，伤口感染率低，使用简便且安全。另外，可注射生物材料通常具有较好的流动性和可塑性，被注射到缺损区域后能够与缺损断面有更充分的接触。以上这些优点让可注射生物支架在再生医学及细胞治疗临床应用中具有极大的吸引力。
然而，目前的可注射生物支架绝大多数都是凝胶类，少有能够被注射的三维(3D)多孔支架。相比于水凝胶支架，该类支架具有更大的且相互连通的多孔结构，通常也具有更强的机械性能。因此，多孔支架更有利于细胞的生长和迁移，更利于新组织的长入，同时也更有利于营养物质及代谢废物的交换。其中，孔径在100-300μm的多孔支架，在组织工程以及过继性免疫治疗中有着非常广泛的应用。通过文献调研不难发现，目前已有大量的多孔支架应用于组织工程等领域。然而，在这些支架中，绝大多数都具有较大的几何尺寸；虽然这些支架具有高度连通的多孔结构，但是如果整个支架的尺寸较大，那么将同样不利于物质的交换。要想取得良好的组织再生损修复效果，那么支架内的细胞最起码需要得到足够的养分供给以保证存活。因此，需要更进一步地开发出能够有效促进细胞存活和增殖的多孔支架体系。
为此，一些研究人员开发出了比普通支架几何尺寸更小的多孔微支架。如清华大学杜亚楠团队用明胶和聚乙二醇二丙烯酸酯制备了直径约800μm的多孔微支架，结果表明肝细胞在该微支架中有更高的存活和增殖率。然而，无论是传统尺寸多孔支架，还是目前已开发出的多孔微支架，都存在以下两个方面的问题。一是它们都需要使用侵入性较大的外科手术方法才能植入体内；二是这些支架缺乏在细胞不同生长阶递送段递送特定生物因子的能力。
为此，我们在之前提交的“一种纳米多孔微支架的制备方法及其复合体系”专利申请中，研发出了一套能够快速制备可注射纳米载体-海藻酸盐3D多孔微支架(NAC/MS)的方法。NAC/MS几何尺寸较小，内部具有高度连通的多孔结构，孔径较大，利于物质交换以及干细胞的长入和扩增；内含有纳米载体(pep@MSNs)系统，对小分子生长因子(如成骨多肽)有很强的缓释能力；微支架颗粒单体具备较强的弹性模量，能够承受一定的压力作用而不破坏内部多孔结构；具有良好的可注射性，能够在致密的肌肉组织中轻松注射而无反渗现象。虽然我们已证实了NAC/MS具有多方面诸多的优点，但我们发现，在利用液氮速冻快速打碎的方法制备微支架的过程中，将会浪费掉不少的支架材料，成品率较低；另外，该方法制备的微支架总体上呈球体状，相比于薄片状，细胞从支架中迁移出的速率更低。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种可注射多孔微芯片及其多级分时递送载体。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种可注射多孔微芯片载体的制备方法，包括以下步骤：
1)将海藻酸钠溶液吸入注射器，通过针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的聚四氟乙烯板上；
2)待微液滴滴好后，将聚四氟乙烯板置于4℃冰箱1h，然后静置于-20℃冰箱12h；
3)接着进行冷冻干燥步骤，直至完全冻干；
4)向冻干后的聚四氟乙烯板上的微片滴加适量的2％氯化钙(w/v)交联剂，充分交联5-10min，然后用PBS浸洗3次；
5)将微片转移至装有PBS的离心管中，置于4℃冰箱2-3d，并隔天换一次PBS；
6)将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得可注射多孔微芯片。
进一步地，步骤1)中，所述针头为32G不锈钢针头；所述海藻酸钠溶液浓度为1.5％(w/v)。
进一步地，步骤3)中，所述冻干步骤条件为冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa；所述滴加的2％氯化钙(w/v)交联剂需完全浸湿微片。
本发明提供一种可注射多孔微芯片载体，为冷冻干燥聚四氟乙烯板表面的海藻酸钠微液滴，并与氯化钙溶液交联形成的多孔微支架；为薄片状，其直径分布约0.8-1.0mm，厚度分布约150-300μm。
进一步地，俯视视角下，可注射多孔微芯片载体内具有很均一的多孔结构，孔径分布约在50-100μm范围内；侧视视角下，可注射多孔微芯片载体为薄片状形态，其多孔孔径分布不均一，变化范围较大；可注射多孔微芯片载体底部(与Teflon板接触的一面)视角下，其多孔结构在三个视角中最不均一，在底面最外层有少许絮状物。
本发明提供一种可注射多孔微芯片多级分时递送载体的制备方法，包括以下步骤：
1)将海藻酸钠溶液吸入注射器，通过针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的聚四氟乙烯板上；
2)待微液滴滴好后，将聚四氟乙烯板置于4℃冰箱1h，然后静置于-20℃冰箱12h；
3)接着进行冷冻干燥步骤，直至完全冻干；
4)向冻干后的聚四氟乙烯板上的微片滴加适量的2％氯化钙(w/v)交联剂，充分交联5-10min，然后用PBS浸洗3次；
5)将微片转移至装有PBS的离心管中，置于4℃冰箱2-3d，并隔天换一次PBS；
6)将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得可注射多孔微芯片；
7)用PBS将可注射多孔微芯片润湿后装填进注射器中，装入体积约为注射器容积的一半，然后进行常规冷冻干燥；
8)接着向冻干后的注射器中加入PBS，再次润湿可注射多孔微芯片；再用另一只装有适量2％(w/v)海藻酸钠水溶液(体积约为可注射多孔微芯片体积的一半)的注射器，通过鲁尔管接头(母-母)将两只注射器连接，推动活塞将可注射多孔微芯片和海藻酸钠水溶液充分混匀，即制得可注射多孔微芯片多级分时递送载体水凝胶包裹的可注射多孔微芯片双层支架体系。
进一步地，步骤1)中，所述针头为32G不锈钢针头；所述海藻酸钠溶液浓度为1.5％(w/v)。
进一步地，步骤3)中，所述冻干步骤条件为冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa；所述滴加的2％氯化钙(w/v)交联剂需完全浸湿微片。
进一步地，步骤8)中，还包括控制可注射多孔微芯片和海藻酸钠水溶液的浸泡时间调控Ca2+的量；还包括通过控制交联度、海藻酸钠溶液浓度、分子量、G单元含比，以及浸泡溶液理化性质调控支架降解速率。
本发明提供一种可注射多孔微芯片多级分时递送载体，为冷冻干燥聚四氟乙烯板表面的海藻酸钠微液滴，并与氯化钙溶液交联形成的多孔微支架外有一层规整的凝胶层，其为双层结构；各层降解速率的不同，凝胶层降解速率快于可注射多孔微芯片。
本发明提供一种可注射多孔微芯片多级分时递送载体，其特征在于：为微液滴形态的海藻酸钠溶液于聚四氟乙烯板冷冻干燥、与氯化钙交联形成的多孔微支架外有一层规整的凝胶层，其为双层结构；各层降解速率的不同，凝胶层降解速率快于可注射多孔微芯片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、通过仿生模拟夏日清晨荷叶表面露珠现象，研发出了一套用微针产生微液滴并滴于聚四氟乙烯板进行冷冻干燥的多孔微支架制备方法。该方法所制得的微支架呈微片状，不仅几何尺寸小，均一性较好，且完好保存了高度连通的多孔结构；同时还具有较强的机械性能以及可注射能力。该多孔微芯片可用于干细胞、心肌细胞以及免疫细胞的体内局部递送；同时也可以用于多种因子或药物的局部递送。
2、巧妙利用了多孔微芯片内残留的Ca2+，与海藻酸钠溶液混合后发生自交联，并在微支架表面形成一层凝胶层，并以此构建凝胶包裹的微支架体系(G/MC)。该体系除了具有以上多孔微芯片的所有特性外，还具备逐级递送药物或细胞的能力；尤其适用于需要分先后顺序递送药物或细胞的应用需求。该体系对再生医学以及实体肿瘤免疫治疗具有较高的实用价值。
附图说明
图1A为实施例1中聚四氟乙烯板制备MC的方法展示；
图1B为实施例3中MC不同观测角度的SEM照片；
图2为实施例2中G/MC制备流程图及可注射性展示；
图3为实施例3中G/MC结构激光共聚焦显微镜荧光照片(G层：红色；MC层：绿色)及各层结构降解规；
图4为实施例3中G/MC中G层和MC层相对荧光强度变化曲线；
图5为实施例3中G/MC逐级递送药物或细胞示意图。
具体实施方式
虽然我们已证实了NAC/MS具有多方面诸多的优点，但我们仍打算继续探究更多的微支架制备方法，以优化现有方法并开发制备出适用范围更广的可注射多孔微支架体系。我们发现，在利用液氮速冻快速打碎的方法制备微支架的过程中，将会浪费掉不少的支架材料，成品率较低。因此我们经过较长时间的探索，最终成功开发出了一套新的微支架制备方法，该方法相较于液氮速冻快速打碎法，操作更加简单、安全，原料利用率也更高。
本发明成功开发出了一套新的微支架制备方法，该方法相较于液氮速冻快速打碎法，不仅能够制备出几何尺寸更薄的微支架(我们将其称为微芯片MC)，而且操作更加简单、安全，原料利用率也更高。另外，为了更进一步拓宽MC支架的应用范围，我们开发出了一套“时空”响应型多因子和细胞逐级缓释3D多孔MC系统。该系统可以通过注射的方式，在体内同时递送多种因子和细胞，并且可分时段(按先后顺序)将所运载的因子和细胞进行释放；在再生医学、细胞治疗以及过继性免疫治疗中有着非常大的应用潜力。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1聚四氟乙烯板(Teflon plate)制备海藻酸盐基多孔微芯片(MC)
将配制好的1.5％(w/v)海藻酸钠(Sigma-Aldrich，美国)溶液吸入1mL规格的注射器(洪达医疗器械有限公司，江西)，然后如图1A所示，通过32G不锈钢针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的Teflon板上(预冷目的，减缓微液滴蒸发速率)。
待微液滴滴好后，将Teflon板(科信塑胶制品厂，广东)置于4℃冰箱1h，然后静置于-20℃冰箱12h；接着进行冻干步骤，冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa，直至完全冻干(约12h)。向冻干后Teflon板上的微片滴加适量的2％氯化钙(w/v；Sigma-Aldrich)交联剂，完全浸湿微片即可，充分交联5-10min，然后用PBS(Hyclone，美国)浸洗3次。
随后，将微片转移至装有PBS的50mL离心管中，置于4℃冰箱2-3d，并隔天换一次PBS，此步骤目的为去除微片表面残余的部分Ca2+，通过浸泡时间来调控残余Ca2+的量，同时也为充分舒展微片利于后续注射操作。然后将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得MC。
MC的制备与表征：
如图1A所示，仅需简单地通过带有顿口细针(32G)的注射器产生海藻酸钠微液滴，然后快速将液滴落于聚四氟乙烯(Teflon)板上，后面再依次进行常规的冷冻干燥和交联处理即可制得薄片状的微支架，我们为了与前文的NAC/MS区别，特将以该方法制备出的微支架命名为微芯片(microchips,MC)。该方法是受荷叶上的露珠现象启发而开出来的。若不用前文中直接打碎的方法，要制备多孔微支架则可通过冷冻干燥海藻酸钠微液滴(球)的途径制得多孔微支架。
但是,在前文中我们已经论述过，如要经此方法制备结构稳定的多孔微支架，须先将海藻酸钠微液滴冷冻干燥，然后再交联。那么，该途径制备微支架的关键环节即是如何大量产生微液滴，并能在冻干过程稳定存在。我们通过观察发现，夏季黎明时荷叶表面通常会有大量的小露珠，其形成原因主要是因为荷叶表面具有超疏水的特性，蒸汽预冷液化，然后凝聚在超疏水的荷叶表面形成类球状液滴。由此现象我们通过仿生的途径，利用Teflon板模拟荷叶的疏水表面，然后再通过注射器针头在其表面产生微液滴。
实施例2水凝胶包裹的MC双层支架体系(G/MC)构建
利用MC表面残余的Ca2+与海藻酸钠溶液自交联形成水凝胶，并包被于MC外。具体步骤为，用PBS将MC润湿后装填进2mL规格的注射器中，装入体积约为注射器容积的一半，然后进行常规冷冻干燥，冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa。
接着向冻干后的注射器中加入PBS，再次润湿MC；再用另一只装有适量2％(w/v)海藻酸钠水溶液(体积约为MC体积的一半)的注射器，通过鲁尔管接头(母-母；中驰塑料配件有限公司，陕西)将两只注射器连接，推动活塞将MC和海藻酸钠水溶液充分混匀，即制得水凝胶包裹的MC双层支架体系(G/MC)，制备流程可参见图2。
G/MC的制备及评价：
为了进一步拓宽MC支架在再生医学及细胞治疗等中的应用范围，我们开发出了一套“时空”响应型多因子逐级缓释3D多孔微支架系统。下面我们将对该系统的制备原理、材料学特性以及药物逐级缓释能力进行评价。
如图2所示，该系统的制备仅需在MC表面包裹一层海藻酸盐水凝胶(G层)，然后利用G层和MC降解速率的不同，实现对多因子的逐级缓释。我们巧妙地利用了MC残存的Ca2+，自发地交联与MC接触的海藻酸钠水溶液，然后在MC表面形成一层水凝胶层。
虽然该方法与之前制备可注射NAC/MS的方法中，均有添加海藻酸钠溶液的步骤，但其作用和实际效果却不同。NAC/MS制备中，由于残存的Ca2+已被完全清洗掉，所添加的1％(w/v)低浓度海藻酸钠溶液不会与NAC/MS发生交联而形成凝胶层，其作用仅为润滑；而在G/MC的制备中，由于MC中残存有较多的Ca2+，且所添加的海藻酸钠溶液浓度较大(2％，w/v)，所以MC表面将形成一层水凝胶，当然该凝胶也具有润滑作用。接下来我们将对G/MC的结构进行表征。
实施例3 MC和G/MC材料学表征及G/MC可注射性探究
利用SEM表征MC的形貌特征、几何尺寸、多孔结构以及孔径大小等。
样品准备方法为：直接将完全冻干的MC粘于导电胶，喷金20s后即可拍摄，注意MC务必要完全干燥。
为了评价G/MC双层结构的降解速率，我们分别用罗丹明和FITC荧光基团对外层凝胶(G层)和内层MC(MC层)进行标记，通过激光共聚焦显微镜分别监测这两层的降解规律。
具体方法为：分别用荧光标记后的海藻酸钠制备G层和MC层，制备方法与“实施例2水凝胶包裹的MC双层支架体系(G/MC)构建”中所述方法相同。然后将荧光G/MC浸没于PBS中，置于37℃恒温孵箱内、转速为90转/分(rpm)的摇床上，分别于预先设置好的时间点取出样品，用激光共聚焦显微镜(A1R-si，Nikon，日本)进行拍摄。
G/MC可注射性探究方法为：接着“实施例2水凝胶包裹的MC双层支架体系(G/MC)构建”中所制备好的G/MC，取下鲁尔管接头换上内径1.2mm的顿口不锈钢针头，将注射器内G/MC往外挤压。
实验结果：
如图1B所示，该方法所制备出的微支架为薄片状，类似一片微芯片。其形成原因主要是因为微液滴在重力和Teflon板表面疏水张力的合力作用下，将会呈类椭球型，当水分被冻干后，留下支架将显得更加的扁平，因此看上去像一片MC。归因于Teflon的疏水性，微液滴在其表面不会发生粘粘(便于后续操作)，同时也不会像在超疏水的荷叶表面发生滚动。我们从不同的视角对该MC进行了立体的观察。
如图所示，俯视视角下，MC内具有很均一的多孔结构，孔径分布约在50-100μm范围内；侧视视角下，MC为薄片状形态，其多孔孔径分布不均一，变化范围较大；MC底部(与Teflon板接触的一面)视角下，其多孔结构在三个视角中最不均一，在底面最外层有少许絮状物。整个MC的几何尺寸要小于NAC/MS，其大小可以简单地通过控制产生微液滴的大小来调控。MC直径分布约0.8-1.0mm，厚度分布约150-300μm。相比于NAC/MS，MC微支架的内部多孔结构不如前者均一，孔径比前者更小；但MC微支架比前者更薄，制备方法更简单，原料利用率更高。
综合MC的各方面特性，我们认为该微支架更适合用于药物或者免疫细胞的递送，原因有以下几点。其一，约200μm的厚度利于细胞快速迁移出支架；在过继性免疫细胞治疗中，如抗原嵌合受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞、树突细胞(Dendriticcells,DCs)，在实体肿瘤的局部治疗中，需要被运载的免疫细胞能够快速从支架中迁出并浸润至肿瘤中，因此更薄的支架更利于细胞迁移。其二，MC的孔径比NAC/MS更小，不太适合在骨组织工程中应用，更适合更小体积的细胞或者药物的局部递送。
如图3所示，我们分别标记了G层(红色)和MC层(绿色)，可以观察到在Day 0的时候，绿色的MC外有一层规整的红色凝胶层，结果证实了我们所制备的G/MC具有双层结构。随着时间的增加，G层逐渐开始降解，其荧光强度也随之下降(图4)。
在第3d时，G层已降解了大半，而MC层几乎没有发生降解；尤其到第7d时，G层基本上已经完全降解了，而MC层从荧光图上看依然未发生降解。该结果非常直观地展示了G/MC双层结构的存在以及各层降解速率的不同，同时也预示G/MC体系具有逐级缓释药物的能力。海藻酸盐水凝胶以及多孔支架的降解，是由于凝胶或者支架中Ca2+与溶液中的单价阳离子发生置换而引发的，降解是离子交联型海藻酸盐生物材料不可避免的客观现象，但不同交联条件(如Ca2+浓度，海藻酸钠溶液浓度等)制备的支架其降解速率也会不同。
影响Ca2+交联型海藻酸盐生物支架降解速率的因素主要包括，交联度(Ca2+浓度)，海藻酸钠溶液浓度、分子量、G单元含比，以及浸泡溶液理化性质(如pH、温度)等。在G/MC体系中，G层为残存的少量Ca2+所交联形成的水凝胶，其交联度远远低于MC，因此该凝胶层降解速率要远快于MC。
另外，我们可以通过控制MC的浸泡时间在一定范围内调控其残存Ca2+的量，以实现对G层降解速率的调控。
接着，我们进一步探究了G/MC体系的药物逐级缓释能力。为了更加接近体内真实环境，我们特地在动物体内评价了G/MC体系逐级缓释药物的能力。图5展示了G/MC逐级缓释药物的原理，即首先随着G层凝胶的不断降解，其内所载A因子也逐渐释放；在G层凝胶降解前，MC由于无法与体液等环境接触，因此B因子的释放速率将较慢；但当G层凝胶大部分降解后，B因子即开始较快释放。
实验结论：
我们通过仿生模拟夏日清晨荷叶表面露珠现象，研发出了一套用微针产生微液滴并滴于聚四氟乙烯板进行冷冻干燥的多孔微支架制备方法。该方法所制得的微支架呈微片状，不仅几何尺寸小，均一性较好，且完好保存了高度连通的多孔结构；同时还具有较强的机械性能以及可注射能力。该多孔微芯片可用于干细胞、心肌细胞以及免疫细胞的体内局部递送；同时也可以用于多种因子或药物的局部递送。
接着，我们巧妙利用了多孔微芯片内残留的Ca2+，与海藻酸钠溶液混合后发生自交联，并在微支架表面形成一层凝胶层，并以此构建凝胶包裹的微支架体系(G/MC)。该体系除了具有以上多孔微芯片的所有特性外，还具备逐级递送药物或细胞的能力；尤其适用于需要分先后顺序递送药物或细胞的应用需求。该体系对再生医学以及实体肿瘤免疫治疗具有较高的实用价值。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (7)

1.一种可注射多孔微芯片载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将海藻酸钠溶液吸入注射器，通过针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的聚四氟乙烯板上；
2)待微液滴滴好后，将聚四氟乙烯板置于4℃冰箱1h，然后静置于-20℃冰箱12h；
3)接着进行冷冻干燥步骤，直至完全冻干；
4)向冻干后的聚四氟乙烯板上的微片滴加适量的浓度为2％w/v的氯化钙交联剂，充分交联5-10min，然后用PBS浸洗3次；
5)将微片转移至装有PBS的离心管中，置于4℃冰箱2-3d，并隔天换一次PBS；
6)将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得可注射多孔微芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述针头为32G不锈钢针头；所述海藻酸钠溶液浓度为1.5％w/v。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，冻干步骤条件为冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa；所述滴加的浓度为2％w/v的氯化钙交联剂需完全浸湿微片。
4.一种可注射多孔微芯片多级分时递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将海藻酸钠溶液吸入注射器，通过针头将复合溶液挤出形成微液滴，快速将其点至事先预冷过的聚四氟乙烯板上；
2)待微液滴滴好后，将聚四氟乙烯板置于4℃冰箱1h，然后静置于-20℃冰箱12h；
3)接着进行冷冻干燥步骤，直至完全冻干；
4)向冻干后的聚四氟乙烯板上的微片滴加适量的浓度为2％w/v的氯化钙交联剂，充分交联5-10min，然后用PBS浸洗3次；
5)将微片转移至装有PBS的离心管中，置于4℃冰箱2-3d，并隔天换一次PBS；
6)将微片冷冻干燥至完全冻干，即制得可注射多孔微芯片；
7)用PBS将可注射多孔微芯片润湿后装填进注射器中，装入体积为注射器容积的一半，然后进行常规冷冻干燥；
8)接着向冻干后的注射器中加入PBS，再次润湿可注射多孔微芯片；再用另一只装有适量的浓度为2％w/v的海藻酸钠水溶液的注射器，通过鲁尔管接头将两只注射器连接，推动活塞将可注射多孔微芯片和海藻酸钠水溶液充分混匀，即制得可注射多孔微芯片多级分时递送载体水凝胶包裹的可注射多孔微芯片双层支架体系，其中所述海藻酸钠水溶液的体积为所述可注射多孔微芯片体积的一半。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述针头为32G不锈钢针头；所述海藻酸钠溶液浓度为1.5％w/v。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，冻干步骤条件为冷凝室温度-40～-50℃，真空度2～10Pa；所述滴加的浓度为2％w/v的氯化钙交联剂需完全浸湿微片。
7.根据权利要求4的制备方法，其特征在于：步骤8)中，还包括控制可注射多孔微芯片和海藻酸钠水溶液的浸泡时间调控Ca2+的量；还包括通过控制交联度、海藻酸钠溶液浓度、分子量、G单元含量，以及浸泡溶液理化性质调控支架降解速率。
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