CN109646713B - 一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置 - Google Patents

一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明属于组织工程生物支架材料及其制造技术领域，公开了一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置，首先分别配制藻酸钠溶液与纳米黏土溶胶，两者均匀混合得到藻酸钠/纳米黏土纳米复合水凝胶。进一步在此水凝胶中混入干细胞悬液，另外还可加入生物活性因子或药物成分。然后，采用主要由高压电源和微量注射泵组成的静电液滴法微载体制备装置，使用盛有稀氯化钙溶液的敞口玻璃容器作为微载体的接收装置，设置适宜的注射速度和电压。本发明制得的藻酸盐/纳米黏土复合微载体和单纯藻酸盐微载体相比机械性能更强，且具有藻酸盐微载体所不具备的药物缓释能力，在干细胞治疗和组织工程领域具有极佳的应用前景。

Description

一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置
技术领域
本发明属于组织工程生物支架材料及其制造技术领域，涉及一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体及制备方法及装置。
背景技术
上个世纪八十年代，出现了“组织工程”的概念，在组织和器官损伤方面是一种的革命性的治疗手段。在“组织工程”领域，最受关注的问题之一就是如何获得足够数量的原始表型的种子细胞，以及如何制备出性能优异的生物支架材料，使支架材料能够装载生物活性成分如各类细胞因子，并使其达到长时间的缓慢释放，充分发挥其效能。细胞、支架材料和生物活性因子可以分别看成是种子、土壤和肥料，三者协同作用才能达到最优的生物学效能。
细胞微载体是指用生物相容性优良的材料包裹细胞以形成微球体或使细胞附着于已成形的微球表面形成细胞聚集体的技术，自1967年Van Wezel成功制作微载体并应用于细胞培养以来，微载体技术快速发展，各种各样商业化微载体的不断地研制成功和上市。尽管微载体技术的发明最初是为了以3D的方式培养细胞，但是其特有的性质与“组织工程”技术不谋而合。微载体材料可以看做是“组织工程”中的支架材料，将微载体技术应用于组织工程最大的优势就是，由微载体及其负载的细胞形成的微组织可以直接转移到受损部位，避免了胰酶消化对细胞产生的不利影响。同时，值得注意的是微载体具有良好的生物相容性，合适的半透性、较强的机械稳定性和较低的免疫原性能保证细胞在微载体中形成一种三维微组织。此外，微载体的多孔性结构允许白蛋白、营养物质及代谢物的自由弥散，细胞可以从外界获得养分，同时微载体又能抵抗外界物理刺激以保护细胞。海藻酸盐材料是一种天然来源的多糖碳水化合物，其优良的生物相容性和遇Ca2+迅速物理交联的性质使其成为组织工程中最早应用的细胞支架材料之一。近年来已有研究者将该材料用于制作微载体，将脂肪干细胞装载于海藻酸盐微球中，具有很高的细胞的存活率，然而其药物缓释功能较差。
近年来，纳米黏土材料在生物材料、药物缓释和组织再生领域受到重点关注，在组织再生领域，将纳米黏土材料与其他种类的聚合物生物材料相混合，通过聚合物分子链和纳米黏土粒子之间物理性的有力连接，能显著提升生物材料的机械性能和生物学性能，Xavier等将纳米硅酸镁锂(Laponite)作为赋形剂与具有光固化能力的明胶-甲基丙烯酸酯(GelMA) 相结合，得到了一种具有优良生物相容性的水凝胶材料，能够促进细胞的粘附、增殖和分化。而在药物缓释领域，Dawson等成功应用纳米硅酸镁锂(Laponite)作为药物缓释载体将纳米黏土作为药物缓释载体，材料能持续的缓释白蛋白，溶菌酶以及具有生物活性的血管内皮生长因子。
澳大利亚专利AU2015101219A公开了一种3D细胞支架材料的制备方法，主要是通过将自体细胞与灭菌后的水凝胶材料均匀混合，将混合材料挤出到促交联介质中以获得包裹细胞的微球体。此方法制作微载体方法简便易行，效率较高，然而该方法受限于所用材料本身的性质，无法实现在微载体中装载各类生物活性因子。
美国专利US20170065746A公开了一种使用特殊的温敏水凝胶材料将心脏细胞包裹，使用微孔模具制作成微球体的方法。该方法对凝胶材料本身的要求较高，制作方法较为繁琐，微载体制造效率较低。另外也无法实现生物活性成分的负载。
中国专利CN201110135834.X公开了一种海藻酸盐水凝胶微载体的制备方法。利用悬浮交联法，通过化学反应使海藻酸盐发生交联，冷冻干燥后形成微球体，应用时将微球体浸入肝素溶液、纤连蛋白溶液、生长因子溶液等将海藻酸盐材料改性以符合间充质干细胞粘附生长要求。该方法简便易行，但未能克服海藻酸盐材料无法长时间缓释生长因子，药物或其他生物活性成分的缺点，现有的反应体系中生物材料灭菌要求较高。
综上所述，国内外现有的专利技术方法均是将使用各类细胞支架材料与细胞结合制成微载体，而不能赋予微载体较好的药物缓释能力以及更佳的机械性能。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体的制备方法及装置，纳米黏土材料与海藻酸盐材料相结合，并通过静电挤出方法制成微载体以一种新颖，简便的方式实现了微载体的载药，同时保证了细胞存活率；具有较好的药物缓释性能，根据药物性质不同，药物可持续释放7天以上。
解决以上技术问题的本发明中的一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体，其特征在于：所述载体包括藻酸盐溶液和纳米黏土溶胶，藻酸盐溶液与纳米黏土溶胶用量体积比例为1：1，藻酸盐主要以藻酸钙形式存在，其中Ca2+的质量分数为10％-13％，优选为12％。
优化方案中，所述载体包括待缓释药物和/或细胞；所述待缓释药物为生物活性因子或药物分子，包括各种多肽、蛋白质等生长因子或小分子药物或其组合，优选分子量小于80kD的因子以达到较好的缓释效果；所述细胞为贴壁性细胞或干细胞，优选干细胞，如骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞，通过移植干细胞的方法以达到组织再生的目的。
所述藻酸钠溶液质量百分比浓度为1～3％，优选2％；所述纳米黏土溶胶质量百分比浓度为0.1～3％，优选1％；所述Ca2+溶液为CaCl2溶液，溶液摩尔浓度为0.05～0.3mol/L。
所述藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，25℃时以1％质量分数溶于水中，其粘度范围为4- 12cP，纯度应高于99％；所述纳米黏土材料为具有纳米片层结构的天然提取或人工合成的各种层状硅酸盐材料的一种或几种的混合物，优选方案中为纳米蒙脱土(MMT)，纳米皂石 (Saponite)或纳米硅酸锂镁(Laponite)一种或几种，各组分纯度应高于95％；所述藻酸盐溶液的溶剂为生理盐水或超纯水，纳米黏土溶胶的助溶剂为超纯水。
进一步优化方案中，所述载体呈球形，粒径100μm～600μm，优选200μm～400μm。
所述载体在5kV～20kV的高压静电场中流动形成；优选12kV。
本发明中一种藻酸盐/纳米黏土复合微载体的制备方法，包括以下步骤:
(1)原材料准备和粉碎：准备各样原材料，并将藻酸盐和纳米黏土粉碎成粉，两种成分粒度小于50μm。
(2)水凝胶配制：将藻酸盐粉末溶于溶剂中，配制成海藻酸钠溶液；将纳米黏土材料粉末溶于助溶剂中，配制成纳米黏土溶胶，再将两者混合，以300r/min振荡5分钟以上后静置，得到藻酸盐/纳米黏土复合水凝胶；
(3)静电液滴法制备：将复合水凝胶装入静电液微滴装置中，使复合水凝胶液滴连续滴出到含Ca2+溶液中，边滴出边搅拌，形成藻酸盐/纳米黏土复合微载体；
(4)收集：使用过滤装置收集微载体，再经过生理盐水冲洗即可。经过50目或小于50 目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；生理盐水冲洗的目的是去除多余的Ca2+，以避免其对细胞的损伤。
优化方案中，所述步骤(2)中滴出速度为4～12ml/h，搅拌速度为150～500rpm，优选 300rpm。若滴出速度太慢，则微载体形态不稳定，且制造效率低；若挤出速度太快，制作出的微载体粒径可能大于600μm，不利于细胞与外界的营养交换。
制备方法中藻酸盐溶液质量百分比浓度1～3％，纳米黏土溶液质量百分比浓度为0.1～ 3％，溶剂为生理盐水或超纯水，助溶剂为超纯水，含Ca2+溶液为0.05～0.3mol/l的CaCl2溶液。微球的形成机制为藻酸钠材料遇Ca2+成胶，加入纳米黏土获得其缓释效果和机械性能的提高。CaCl2有好的效果，较其他如CaSO4、CaCO3这类钙盐的话，溶液里面解离出的Ca2+较少，成胶较慢，无法保证最后微球的形态完整均匀。
CaCl2溶液的搅拌速度为150rpm～500rpm，若搅拌速度太慢，则微载体球形度不佳；若搅拌速度太快，制作出的微载体形态破碎。CaCl2溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/l，若浓度太高，造成CaCl2浪费；若浓度太低，则不利于Ca2+与海藻酸钠反应，无法获得成形的微载体。
藻酸盐溶液和纳米黏土溶液浓度过低或浓度过高均无法成功制作微载体：浓度过低，水凝胶材料无法与接收装置中的Ca2+反应形成形状稳定的微球体结构；浓度过高，水凝胶材料无法通过静电液滴法微载体制备装置挤出。
步骤(2)中滴出的微液滴在5kV～20kV的高压静电场中向下滴入含Ca2+溶液中；优选 12kV。步骤(2)中所述反应体系的温度为室温。
所述步骤(2)和步骤(3)之间还有细胞微囊化步骤：在复合水凝胶中加入以1000r/5min离心沉淀的细胞，用复合水凝胶重悬细胞，细胞浓度为5×105/ml～2×106/ml，优选1×106/ml。其应用于细胞微囊化：将藻酸盐/纳米黏土微载体置于二氧化碳孵箱中培养 7天以上，形成微组织，后续可用于干细胞治疗。
或在复合水凝胶中加入配置好的生物活性因子或药物分子，均匀混合；再加入离心沉淀的细胞，用复合水凝胶重悬细胞，细胞浓度为5×105/ml～2×106/ml，优选1×106/ml，后面的操作步骤和工艺参数不变，按照前面制备方法所述，可得到包裹细胞且复合药物的藻酸盐/纳米黏土微载体。
本发明中一种制备藻酸盐/纳米黏土复合微载体的装置，其特征在于：所述装置为静电液微滴装置，包括设有微量注射泵、高压电源器、滴液接收器和过滤器，高压电源器分别与微量滴加泵和滴液接收器连接，使微量滴加泵和滴液接收器形成一个静电场；滴液接收器和过滤器连接，微量注射泵包括设有控制器，执行机构和注射器组成，执行机构位于控制器侧面，相对于控制器上下移动；注射器固定在控制器上，并垂直位于液体接收器上方，注射器距离滴液接收器一段距离；所述注射器包括设有溶液外管、内管、活塞、手柄和滴液针，溶液外管内为中空，内管和活塞位于溶液管内，相对于溶液外管内壁上下移动；活塞设在内管底端，与溶液外管内壁完全贴合；手柄与内管连接，延伸于餐管外；注射器手柄随控制器移动而移动。活塞与外管底端之间的管中装有纳米复合水凝胶(或包裹细胞和生物活性成分)，当手柄往上拉时，吸入凝胶；当手柄往下压时，则排出凝胶。
优化方案中所述滴液接收器为敞口玻璃容器，如烧杯等，内装有含钙离子溶液。复合水凝胶装入在活塞和溶液外管之间的空间中。敞口的容器为了方便接收上方滴落的微小液滴，用玻璃是因为塑料容器在静电场中使液滴飞行不稳定，不利于收集。若使用窄口容器，或塑料容器，装置挤出的液滴无法形成稳定的流向，造成材料和细胞的损失。
高压电源器使微量滴加泵和滴液接收器之间形成的高压静电场，使从滴液针滴出的向下流动的液体处于5kV～20kV的高压静电场中，优选12kV。若电压太高，则挤出速率慢，微载体形态也不稳定；若电压太低，制作出的微载体粒径可能大于600μm，不利于细胞与外界的营养交换。
滴液针内孔孔径应小于或等于250μm，否则会造成液滴直径过大；针尖用平头型，以形成良好的静电分布，使液滴成球形。
所述注射器针尖与CaCl2液面的距离为2-10cm。距离过近，无法形成稳定的球形微载体；距离过远，无法通过接收装置稳定的收集挤出的液滴，造成材料和细胞的损失。
本发明中藻酸钙和纳米黏土组成的微球体，球形度佳，能耐受最高达3000rcf/5min的离心力；药物可持续释放7天以上。
本发明中使用纳米黏土利用其缓释能力，使产品有着好的缓释效果，使一些生长因子、药物之类的能在微球中实现缓释。因其微观结构中带有较强的电荷，与聚合物的链式结构进行物理式的交联，提高整体水凝胶的交联程度。纳米粘土上的电荷以及交联后形成的塔屋式的结构使得一些小分子蛋白，或者一些药物分子可以在水凝胶体系中实现缓释效果。纳米黏土也能提高聚合物材料机械性能。
复合微载体中各组分用量比例是重要：纳米黏土的量多少直接影响到载体的效果，若它用量太多，其电荷太强，要缓释的药物、生长因子之类的分子根本无法摆脱这个水凝胶体系或者其扩散极慢，无法使这些活性成分对细胞产生正向的影响。若用量太少，机械性能太差，微球容易破碎，无法达到细胞微囊化的结果，缓释效果也无法实现。藻酸钠材料的浓度也是决定材料内部交联程度重要的因素，若浓度太高，水凝胶体系变得粘稠，内部含水量低，微观空间小，细胞的存活率会急剧下降。
当流动的液体处于5kV～20kV的高压静电场中时，液体的表面张力显著增强，无法再保持连续的液体状态，迅速形成微小液滴并落下。藻酸钠纳米复合水凝胶的微小液滴在CaCl2溶液中与Ca2+迅速反应成胶，即可得到本发明所制备的微载体。
本发明中藻酸钙纳米复合微载体为主要由藻酸钙和纳米黏土组成的微球体。球形度尚佳，粒径100μm～600μm，优选300μm～400μm；能耐受最高达3000rcf/5min的离心力；药物可持续释放7天以上。
除了粒径，还有其能经受的离心力大小(机械性能的体现)、其中生长因子等小分子的缓释效果。
本发明中分别配制藻酸钠溶液与纳米黏土溶胶，两者均匀混合得到藻酸钠/纳米黏土纳米复合水凝胶。进一步在此水凝胶中混入干细胞悬液，另外还可加入生物活性因子或药物成分。然后，采用主要由高压电源和微量注射泵组成的静电液滴法微载体制备装置，使用盛有稀氯化钙溶液的敞口玻璃容器作为微载体的接收装置，设置适宜的注射速度和电压，启动装置后，水凝胶液滴将滴入搅拌中的稀氯化钙溶液中，在溶液中发生交联形成球形的包裹细胞的微载体，最后从溶液中收集形成的微载体即可。
本发明制得的藻酸盐/纳米黏土复合微载体和单纯藻酸盐微载体相比机械性能更强，且具有藻酸盐微载体所不具备的药物缓释能力，在干细胞治疗和组织工程领域具有极佳的应用前景。具有比单纯的藻酸盐材料制备的微载体更高的机械性能，表现为能耐受最高达 3000rcf/5min的离心力，单纯的藻酸盐微载体只能耐受不高于2500rcf/5min的离心力。
以上任一所述方法制备得到的藻酸盐/纳米黏土复合微载体均属于本发明的保护范围。本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/ 或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1为本发明中静电液滴法微载体制备装置结构示意图
图2为本发明中图1的局部结构示意和原理图
图3为本发明中纳米复合微球SEM图
图4为本发明中纳米复合微球EDS分析图
图5为本发明中纳米复合微载体细胞荧光图
图6为本发明中BSA缓释曲线图
其中，图中标识为：
1.微量注射泵,2.高压电源器,3.滴液接收器,4.注射器,5.过滤器,6.溶液外管，7. 内管，8.活塞，9.滴液针，10.控制器，11.执行机构，11.纳米复合水凝胶，12.含Ca2+溶液，13.手柄，14.电源线，15.磁力搅拌器
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
实施例1
藻酸盐/纳米黏土复合微载体包括藻酸盐溶液和纳米黏土溶胶，藻酸盐溶液与纳米黏土溶胶用量体积比例为1：1，藻酸盐主要以藻酸钙形式存在，其中Ca2+的质量分数为10％。载体呈球形，粒径100μm～600μm。载体在5kV～20kV的高压静电场中流动形成。
藻酸钠溶液质量百分比浓度为1％；纳米黏土溶胶质量百分比浓度为0.1％；Ca2+溶液为CaCl2溶液，溶液摩尔浓度为0.05mol/L。
藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，25℃时以1％质量分数溶于水中，其粘度范围为4-12cP，纯度应高于99％；纳米黏土材料为具有纳米片层结构的天然提取或人工合成的各种层状硅酸盐材料的一种或几种的混合物，各组分纯度应高于95％；藻酸盐溶液的溶剂为生理盐水，纳米黏土溶胶的助溶剂为超纯水。
制备方法如以下步骤:
(1)原材料准备和粉碎：准备各样原材料，并将藻酸盐和纳米黏土粉碎成粉，两种成分粒度小于50μm。
(2)水凝胶配制：将藻酸盐粉末溶于溶剂中，配制成海藻酸钠溶液；将纳米黏土材料粉末溶于助溶剂中，配制成纳米黏土溶胶，再将两者混合，以300r/min振荡5分钟以上后静置，得到藻酸盐/纳米黏土复合水凝胶；
滴出速度为4ml/h，搅拌速度为150rpm。
(3)静电液滴法制备：将复合水凝胶装入静电液微滴装置中，使复合水凝胶液滴连续滴出到含Ca2+溶液中，边滴出边搅拌，形成藻酸盐/纳米黏土复合微载体；滴出的微液滴在5kV～20kV的高压静电场中向下滴入含Ca2+溶液中；优选12kV。反应体系的温度为室温。
CaCl2溶液的搅拌速度为150rpm，CaCl2溶液的浓度为0.05mol/L。
(4)收集：使用过滤装置收集微载体，再经过生理盐水冲洗即可。经过50目或小于50 目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；生理盐水冲洗的目的是去除多余的Ca2+，以避免其对细胞的损伤。
实施例2
藻酸盐/纳米黏土复合微载体包括藻酸盐溶液和纳米黏土溶胶，藻酸盐溶液与纳米黏土溶胶用量体积比例为1：1，藻酸盐主要以藻酸钙形式存在，其中Ca2+的质量分数为13％。载体呈球形，粒径200μm～400μm。载体在20kV的高压静电场中流动形成。
载体还包括细胞，细胞为贴壁性细胞。
藻酸钠溶液质量百分比浓度为3％；纳米黏土溶胶质量百分比浓度为3％；Ca2+溶液为 CaCl2溶液，溶液摩尔浓度为0.3mol/L。
藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，25℃时以1％质量分数溶于水中，其粘度范围为4-12cP，纯度高于99％；纳米黏土材料为纳米蒙脱土(MMT)，纳米皂石(Saponite)或纳米硅酸锂镁(Laponite)3种，各组分纯度高于95％；藻酸盐溶液的溶剂为超纯水，纳米黏土溶胶的助溶剂为超纯水。
制备方法如以下步骤:
(1)原材料准备和粉碎：准备各样原材料，并将藻酸盐和纳米黏土粉碎成粉，两种成分粒度小于50μm。
(2)水凝胶配制：将藻酸盐粉末溶于溶剂中，配制成海藻酸钠溶液；将纳米黏土材料粉末溶于助溶剂中，配制成纳米黏土溶胶，再将两者混合，以300r/min振荡5分钟以上后静置，得到藻酸盐/纳米黏土复合水凝胶；滴出速度为12ml/h，搅拌速度为500rpm。
(3)细胞微囊化步骤：在复合水凝胶中加入以1000r/5min离心沉淀的细胞，用复合水凝胶重悬细胞，细胞浓度为5×105/ml。其应用于细胞微囊化：将藻酸盐/纳米黏土微载体置于二氧化碳孵箱中培养7天以上，形成微组织，后续可用于干细胞治疗。
(4)静电液滴法制备：将复合水凝胶装入静电液微滴装置中，使复合水凝胶液滴连续滴出到含Ca2+溶液中，边滴出边搅拌，形成藻酸盐/纳米黏土复合微载体；滴出的微液滴在20kV的高压静电场中向下滴入含Ca2+溶液中；反应体系的温度为室温。
CaCl2溶液的搅拌速度为500rpm，CaCl2溶液的浓度为0.3mol/l。
(5)收集：使用过滤装置收集微载体，再经过生理盐水冲洗即可。经过50目或小于50 目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用。
实施例3
藻酸盐/纳米黏土复合微载体包括藻酸盐溶液和纳米黏土溶胶，藻酸盐溶液与纳米黏土溶胶用量体积比例为1：1，藻酸盐主要以藻酸钙形式存在，其中Ca2+的质量分数为12％。载体呈球形，粒径200μm～400μm。载体在12kV的高压静电场中流动形成。
载体还包括待缓释药物和细胞；待缓释药物为生物活性因子或药物分子，包括各种多肽、蛋白质等生长因子或小分子药物或其组合，优选分子量小于80kD的因子以达到较好的缓释效果；细胞为干细胞，如骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞，通过移植干细胞的方法以达到组织再生的目的。
藻酸钠溶液质量百分比浓度为2％；纳米黏土溶胶质量百分比浓度为1％；Ca2+溶液为 CaCl2溶液，溶液摩尔浓度为0.1mol/L。
藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾，25℃时以1％质量分数溶于水中，其粘度范围为8cP，纯度高于99％；纳米黏土材料为具有纳米片层结构的天然提取或人工合成的各种层状硅酸盐材料的一种或几种的混合物，优选方案中为纳米蒙脱土(MMT)，组分纯度应高于95％；藻酸盐溶液的溶剂为生理盐水，纳米黏土溶胶的助溶剂为超纯水。
制备方法如以下步骤:
(1)原材料准备和粉碎：准备各样原材料，并将藻酸盐和纳米黏土粉碎成粉，两种成分粒度小于50μm。
(2)水凝胶配制：将藻酸盐粉末溶于溶剂中，配制成海藻酸钠溶液；将纳米黏土材料粉末溶于助溶剂中，配制成纳米黏土溶胶，再将两者混合，以300r/min振荡5分钟以上后静置，得到藻酸盐/纳米黏土复合水凝胶；滴出速度为8ml/h，搅拌速度为300rpm。
(3)细胞微囊化步骤：在复合水凝胶中加入配置好的生物活性因子或药物分子，均匀混合；再加入以1000r/5min离心沉淀的细胞，用复合水凝胶重悬细胞，细胞浓度为1×106/ml，其应用于细胞微囊化：将藻酸盐/纳米黏土微载体置于二氧化碳孵箱中培养7天以上，形成微组织，后续可用于干细胞治疗。
(4)静电液滴法制备：将复合水凝胶装入静电液微滴装置中，使复合水凝胶液滴连续滴出到含Ca2+溶液中，边滴出边搅拌，形成藻酸盐/纳米黏土复合微载体；滴出的微液滴在5kV～20kV的高压静电场中向下滴入含Ca2+溶液中；优选12kV。反应体系的温度为室温。
CaCl2溶液的搅拌速度为400rpm，CaCl2溶液的浓度为0.1mol/L。
(5)收集：使用过滤装置收集微载体，再经过生理盐水冲洗即可。经过50目或小于50 目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用。
实施例4
(1)材料预备和水凝胶配制：使用生理盐水配制1％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1.5％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶，保存于4℃冰箱待用；
纳米黏土与藻酸钠的结合需要严格按照protocol来，即预先配制纳米黏土凝胶，静置，再与其他材料混合。若是一开始就一起配制的话，无法使纳米黏土均匀扩散和混合，产生沉淀。
(2)静电挤出：将配制好的藻酸钠纳米复合水凝胶转移入10ml注射器中，若用于应用，则在这一步加入细胞和待缓释的生物活性成分。在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用23G～28G的平头针，以4ml/h～12ml/h的挤出速度，在5kV～20kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以300rpm搅拌的0.2mol/l CaCl2溶液中。
对挤出的液滴不施加静电场作用力，则凝胶本身的张力和粘稠度(流变性能)只能获得粒径在毫米级的微球，这种大小的微球中的细胞，尤其球体中心部分的细胞营养差，存活率低。
微载体若应用于细胞微囊化包括如下步骤：在本例中前面配置好的纳米复合水凝胶中加入离心沉淀的细胞，用该复合水凝胶重悬细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。将细胞/水凝胶混悬液装入微载体制备装置的注射器中，后面的操作步骤和工艺参数如本例中所述不变，可得到包裹细胞的藻酸盐/纳米黏土微载体；将其置于二氧化碳孵箱中培养7天以上，形成微组织，后续可用于干细胞治疗。
微载体若应用于具有缓释药物功能的细胞微囊化中的应用包括如下步骤：在本例中前面配置好的纳米复合水凝胶中加入事先配置好的生物活性因子或药物分子，均匀混合，然后在复合药物的水凝胶中再加入细胞，后面的操作步骤和工艺参数如本例中所述不变，可得到包裹细胞且复合药物的藻酸盐/纳米黏土微载体。
实施例5
一种制备藻酸盐/纳米黏土复合微载体的装置，设有微量注射泵、高压电源器、滴液接收器和过滤器，高压电源器分别与微量滴加泵和滴液接收器连接，使微量滴加泵和滴液接收器形成一个静电场；滴液接收器和过滤器连接，微量注射泵包括设有控制器，执行机构和注射器组成，执行机构位于控制器侧面，相对于控制器上下移动；注射器固定在控制器上，并垂直位于液体接收器上方，注射器距离滴液接收器一段距离；所述注射器包括设有溶液外管、内管、活塞、手柄和滴液针，溶液外管内为中空，内管和活塞位于溶液管内，相对于溶液外管内壁上下移动；活塞设在内管底端，与溶液外管内壁完全贴合；手柄与内管连接，延伸于餐管外；注射器手柄随控制器移动而移动。活塞与外管底端之间的管中装有纳米复合水凝胶(或包裹细胞和生物活性成分)，当手柄往上拉时，吸入凝胶；当手柄往下压时，则排出凝胶。微量泵是一个临床上用的注射泵，然后注射器是一次性的通过夹子夹住。
滴液接收器为敞口玻璃容器，如烧杯等，内装有含钙离子溶液。复合水凝胶装入在活塞和溶液外管之间的空间中。敞口的容器为了方便接收上方滴落的微小液滴，用玻璃是因为塑料容器在静电场中使液滴飞行不稳定，不利于收集。若使用窄口容器，或塑料容器，装置挤出的液滴无法形成稳定的流向，造成材料和细胞的损失。
高压电源器使微量滴加泵和滴液接收器之间形成的高压静电场，使从滴液针滴出的向下流动的液体处于5kV～20kV的高压静电场中，优选12kV。若电压太高，则挤出速率慢，微载体形态也不稳定；若电压太低，制作出的微载体粒径可能大于600μm，不利于细胞与外界的营养交换。
滴液针内孔孔径应小于或等于250μm，否则会造成液滴直径过大；针尖用平头型，以形成良好的静电分布，使液滴成球形。注射器针尖与CaCl2液面的距离为2-10cm。距离过近，无法形成稳定的球形微载体；距离过远，无法通过接收装置稳定的收集挤出的液滴，造成材料和细胞的损失。
实施例6
其它内容如实施例3中：
(1)材料预备：使用生理盐水配制2％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶，保存于4℃冰箱待用；
(2)静电挤出：将配制好的藻酸钠纳米复合水凝胶转移入10ml注射器中，在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用25G的平头针，以4ml/h的挤出速度，在8kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以250rpm搅拌的0.1mol/L CaCl2溶液中；
(3)收集：经过50目或小于50目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；
通过镜下观察成像测定微球平均粒径530μm，能耐受最高达2750rcf/5min的离心力。
实施例7
其它内容如实施例3中：
(1)材料预备：使用生理盐水配制2％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶，保存于4℃冰箱待用；
(2)静电挤出：将配制好的藻酸钠纳米复合水凝胶转移入10ml注射器中，在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用25G的平头针，以10ml/h的挤出速度，在12kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以250rpm搅拌的0.1mol/L CaCl2溶液中；
(3)收集：经过50目或小于50目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；
通过镜下观察成像测定微球平均粒径约450μm。能耐受最高达3000rcf/5min的离心力。
实施例8
其它内容如实施例3中：
(1)材料预备：使用生理盐水配制2％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶，保存于4℃冰箱待用；
(2)静电挤出：将配制好的藻酸钠纳米复合水凝胶转移入10ml注射器中，在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用25G的平头针，以6ml/h的挤出速度，在8kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以300rpm搅拌的0.2mol/L CaCl2溶液中；
(3)收集：经过50目或小于50目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；
通过镜下观察成像测定微球平均粒径约385μm。能耐受最高达3000rcf/5min的离心力
实施例9
其它内容如实施例3中：
(1)材料预备：使用生理盐水配制2％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶；纳米复合水凝胶中加入需要缓释的BSA标准蛋白，保存于4℃冰箱待用。
(2)静电挤出：选取P3代牙髓干细胞，经消化离心后，用步骤(1)中制得的复合水凝胶重悬，反复吹打形成均匀的细胞-水凝胶混悬液，将配制好的细胞-水凝胶混悬液转移入10ml注射器中，在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用25G的平头针，以6ml/h 的挤出速度，在8kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以300rpm搅拌的0.2mol/L CaCl2溶液中；
(3)收集：经过50目或小于50目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；
通过镜下观察成像测定微球平均粒径约400μm，能耐受最高达2750rcf/5min的离心力，该微载体的BSA蛋白在第七天仍能够缓慢释放。
实施例10
其它内容如实施例3中：
(1)材料预备：使用生理盐水配制2％浓度藻酸钠溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶液；使用超纯水配制1％浓度纳米黏土溶液，静置12h以上得到无色澄清流动性良好的均质溶胶，与前述藻酸钠溶液以1:1的比例混合，高速震荡5min后静置6h可得到白色半透明均质水凝胶；纳米复合水凝胶中加入需要缓释的BSA标准蛋白，保存于4℃冰箱待用。
(2)静电挤出：选取P3代牙髓干细胞，经消化离心后，用步骤(1)中制得的复合水凝胶重悬，反复吹打形成均匀的细胞-水凝胶混悬液，将配制好的细胞-水凝胶混悬液转移入10ml注射器中，在事先搭建的静电液滴法微载体制备装置中使用25G的平头针，以6ml/h 的挤出速度，在12kV高压静电场中，将复合水凝胶快速挤出至以250rpm搅拌的0.1mol/LCaCl2溶液中；
(3)收集：经过50目或小于50目细胞筛滤过可收集成胶后形成的微载体，经过生理盐水冲洗三次即可应用；
通过镜下观察成像测定微球平均粒径约352μm。能耐受最高达2750rcf/5min的离心力，该微载体的BSA蛋白在第五天仍能够缓慢释放。
本发明中先分别配制藻酸钠溶液与纳米黏土溶胶，两者均匀混合得到藻酸钠/纳米黏土纳米复合水凝胶。进一步在此水凝胶中混入干细胞悬液，另外还可加入生物活性因子或药物成分。然后，采用主要由高压电源和微量注射泵组成的静电液滴法微载体制备装置，使用盛有稀氯化钙溶液的敞口玻璃容器作为微载体的接收装置，设置适宜的注射速度和电压，启动装置后，水凝胶液滴将滴入搅拌中的稀氯化钙溶液中，在溶液中发生交联形成球形的包裹细胞的微载体，最后从溶液中收集形成的微载体即可。本发明制得的藻酸盐/纳米黏土复合微载体和单纯藻酸盐微载体相比机械性能更强，且具有藻酸盐微载体所不具备的药物缓释能力，在干细胞治疗和组织工程领域具有极佳的应用前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (11)

1.一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述微载体通过包括藻酸盐溶液和纳米黏土溶胶制备所得，藻酸盐溶液与纳米黏土溶胶用量体积比例为1：1，得到的微载体中藻酸盐主要以藻酸钙形式存在，其中Ca2+的质量分数为10%-13%；微载体中负载活细胞，且可负载和缓释药物，采用静电液滴法制备微载体；
所述藻酸盐溶液为藻酸钠或钾溶液，藻酸钠或钾溶液质量百分比浓度为1～3％，溶剂为生理盐水或超纯水；纳米黏土溶胶质量百分比浓度为0.1～3％，助溶剂为超纯水；
所述静电液滴法制备中施加的电压条件为5kV～20kV的高压静电，以CaCl2溶液为接收液，溶液摩尔浓度为0.05～0.3 mol/L，滴出速度为4～12ml/h，搅拌速度为150～500rpm；其中所用滴液针内孔孔径小于或等于250μm，注射器针尖与CaCl2液面的距离为2-10cm。
2.根据要求1中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述纳米黏土材料为具有纳米片层结构的天然提取或人工合成的各种层状硅酸盐材料的一种或几种的混合物。
3.根据要求2中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述纳米黏土材料为纳米蒙脱土，纳米皂石或纳米硅酸锂镁一种或几种。
4.根据要求1中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述藻酸钠或钾溶液质量百分比浓度为2%，所述纳米黏土溶胶质量百分比浓度为1%；两种材料分别配置好后，两者混合，振荡或搅拌均匀后静置，得到藻酸盐/纳米黏土复合水凝胶。
5.根据要求4中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述复合水凝胶中加入离心沉淀的细胞，用复合水凝胶重悬细胞，细胞浓度为5×105/ml～2×106/ml；所述细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。
6.根据要求5中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述细胞浓度为1×106/ml。
7.根据要求1中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述微载体采用静电液滴法制备，施加的电压条件为12kV的高压静电；以CaCl2溶液为接收液，搅拌速度为300rpm。
8.根据要求1中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述微载体呈球形，粒径100μm～600μm。
9.根据要求8中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述粒径200μm～400μm。
10.根据要求1中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述待缓释药物为生物活性因子或药物分子，包括各种多肽、蛋白质生长因子或小分子药物或其组合。
11.根据要求10中所述一种藻酸盐/纳米黏土复合细胞微载体，其特征在于：所述生物活性因子为分子量小于80kD的因子。
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