CN102552546A - 茶多酚海藻酸钠微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茶多酚海藻酸钠微球及其制备方法和应用，更具体地说，涉及一种新的茶多酚海藻酸钠微球，该微球由下述重量份的组分制成：海藻酸钠4～6份、壳聚糖1～2份、多孔二氧化硅1～2份、茶多酚3～6份。本发明茶多酚微球中加入多孔二氧化硅可以显著增加茶多酚在微球中的含量。本发明茶多酚微球的制备方法为液滴一步法和液滴两步法。本发明微球可以广泛应用于保健品和生物医学的各个领域，可用于降血脂用于肥胖症的治疗、抗氧化清除自由基、预防和治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一种微球，尤其涉及一种茶多酚微球及其制备方法和应用。
背景技术
海藻酸钠是海藻酸的钠盐，海藻酸是从海洋植物褐藻中提取出的一种天然多糖，它是由α-L-古罗糖醛酸(M基团)与其立体异构体β-D-甘露糖醛酸(G基团)两种结构单元，通过α(1-4)糖苷键链接而成的一种无支链的线性嵌段共聚物。海藻酸钠为无臭无味的白色粉末，有吸湿性。在水存在时能溶胀而形成粘稠的胶体溶液，不溶于乙醇和其它有机溶剂。其黏度随聚合度、浓度及pH值而异。该材料稳定、无毒、生物相容性好、生物可降解[1-2]。海藻酸钠的一个非常重要的性质就是可以与二价阳离子或多价阳离子形成凝胶。单价阳离子和Mg2+不会引起胶凝。大多数应用是藻酸盐与Ca2+交联瞬时形成凝胶。形成凝胶的原理是G基团连接的Na+离子与二价阳离子进行交换，G基团的羧基和二价阳离子形成“蛋箱”结构(图1)。这些凝胶具有类似固体的一定的形状和强度，基本上99％的成分都是水。许多研究表明，海藻酸钠的化学结构，分子量，胶凝动力学以及阳离子的种类和浓度对形成凝胶的性质包括多孔性，溶胀行为，稳定性，机械强度，生物相容性及降解都有很大的影响[2-3]。近年来，由于海藻酸及其盐类具有广泛的用途而日益受到人们的重视。在食品工业，用于制作人造水果、人造蛋、果冻等人造食品，还被用作食品增稠剂、乳化剂、稳定剂、饮料的防冻剂、防沉剂、矫味剂以及冰淇淋等，被人们称之为奇妙的食品添加剂。此外，海藻酸及其盐还被广泛应用于医药领域，在防病治病方面，海藻酸具有降低人体内的胆固醇含量、疏通血管、降低血液粘度、软化血管等作用，被人们誉为保健长寿食品；在药学方面，是DNA，蛋白质，细胞或组织的优良载体，因为海藻酸钠和二价阳离子交联是在相对比较温和的条件下进行的，不用有机溶剂，其独一无二的热稳定性，在室温即可形成稳定的凝胶，凝胶具有多孔性以及可以生物降解。用作助悬剂、崩解剂、乳化剂、黏合剂、包衣材料、膜剂、净水剂等，在微球、微囊、纳米粒、缓控释制剂等新型药物给药系统的研制中因其良好的成型性而深受欢迎。与其它的水凝胶不同，藻酸盐的凝胶在许多有机溶剂中稳定在生物工程方面，用于细胞、酶的固定化载体；在医学领域，用于包载体细胞移植及包载疫苗。另外，研究表明，具有一定电荷密度的高分子可以作为一种优良的粘膜粘附剂。电荷密度越高，粘附效果越好。作为生物粘附剂，阴离子聚合物要比阳离子聚合物或非离子聚合物效果更好。作为具有羧基末端的一种阴离子聚合物，藻酸盐是一种很好的粘膜粘附剂。与其它高分子例如聚苯乙烯，壳聚糖，羧甲基纤维素，聚乳酸相比，藻酸盐具有最高的粘膜粘附强度[4-5]。
海藻酸盐形成凝胶的常用胶凝技术基本上包括两步：第一步是内向的形成，包含生物材料的藻酸盐溶液分散成小液滴；第二步是液滴胶凝固化或在液滴表面形成膜。海藻酸钠微球从制备方法上可分为喷雾滴制与乳化胶凝两大类。
1.喷雾滴制法
喷雾滴制法制备的微球较大，粒径除与海藻酸钠溶液粘度及喷头直径有关外，对气体剪切法、静电造粒法与毛细管破碎法，可分别改变轴向气体流速、静电破碎电压与机械震动破碎波长来控制粒径，其中毛细管破碎法的粒径分布最小。以上制备过程，微球是一个接一个制备的，从而生产规模有限。通过增加喷头个数可提高产量，对于20个喷头的静电造粒与10个喷头的毛细管破碎制备过程，其产量可分别达到0.7L/h与50L/h[6]。
2.乳化胶凝法
乳化胶凝法生产规模较大，可制备粒径较小的微胶囊，但粒径分布较宽，对于机械搅拌乳化还存在高剪切力的问题，只适于包埋稳定的蛋白、多肽与小分子药物。现已开发出内源乳化法与外源乳化法[7]。
海藻酸钠的凝胶过程有内外源法，常规过程为外源法，它是将海藻酸钠溶液分散在Ca2+溶液中，二价阳离子由外向内凝胶，但由于微胶囊表面快速形成一层 致密海藻酸钙，限制了钙离子在微胶囊内的扩散速度，所得到的一般为非均相微球。在凝胶液中加入一定量的Na+、Mg2+等非凝胶离子，交联速度降低，则会形成较为均一性的微囊，对这一动力学过程加以控制，将得到不同程度的各向异性凝胶。为减少剪切力，开发出了气体搅拌乳化(内源凝胶)与膜乳化法，对前者当气体流率增大时，粒径减少但分布变宽，对后者微胶囊大小主要决定于所用微孔膜的材料与孔径分布，同时受到膜乳化压力与膜乳化时间的影响。与传统的乳化技术相比，膜乳化技术具有液滴单分散性及稳定性好、条件温和、能耗低、易于规模化生产等特点。
同为多糖类的壳聚糖是一种阳离子聚合物，海藻酸钠与其通过静电力的结合可谓天作之和，大大强于表面胶凝镀膜。实验中一般是海藻酸钠溶液滴入CaCl2/壳聚糖混合液中。海藻酸钠-壳聚糖微球以两种方法制成：方法一是在含有壳聚糖的溶液中滴加海藻酸钠溶液；方法二是将海藻酸钙小球在壳聚糖溶液中浸渍培养。结果方法一在微囊表面结合的壳聚糖为0.015μg/mm2；方法二超过了2μg/mm2，24h后获得的壳聚糖与海藻酸钠的最大重量比为0.40。通过降低壳聚糖的分子量至20000Da以下，或增加海藻酸钠的多孔性，壳聚糖的结合率会明显提高。增强凝胶的多孔性可以通过在凝胶制备过程中增大其均匀性，或在复合膜的形成过程中往壳聚糖溶液中填加CaCl2来实现。研究中还发现，通过降低壳聚糖的乙酰化分数FA(从0.3降至0)，或将pH从4升到6，可以增加壳聚糖的结合度。反应24h后，直径为500μm的微球比1500μm的微球具有更高的结合度。
海藻酸钠-壳聚糖微球的稳定性和通透性的研究结果证明，在一步法制备的微球中，所有的壳聚糖都集中在微球表面形成的海藻酸钠-壳聚糖薄膜内，微球强度较两步法差很多。在两步法中，可以通过降低壳聚糖的分子量至15000以下，或增强微球的均一性，或将微球的直径降至300μm左右来制得高强度的微球。其中具有不同均一性的微球可以通过调整胶凝液中盐的浓度来获得。当微球被钙分离剂(如柠檬酸盐)处理后，海藻酸钙凝胶通常溶解，但仍含有一个凝胶芯，表明了壳聚糖在整个胶囊母体中存在。用3H标记的壳聚糖制成的微球被置于不同的缓冲溶液中振摇，以检测壳聚糖的损失。一个月后，在0.01MHCl溶液中的损失最高，几乎达2％，而在3MNaCl和其它具有较低盐浓度的溶液中，壳聚糖 的损失率小于1％，因而壳聚糖与海藻酸钠的结合也越强。当壳聚糖的分子量升高，或乙酰度升高，或均一性下降时，微球的通透性降低。多层的海藻酸钠-壳聚糖微球几乎对IgG无通透性，表明微球的平均孔径小于 
海藻酸钠微囊化后具有如下的特点和优势：
1)掩盖药物的不良气味和口味：例如鱼油的腥和生物碱的苦等，制成微球或微囊后这些不愉快的味道和气味都消失了；
2)提高药物的稳定性，对于易氧化的、易挥发的、易受环境影响的药物通过微囊化可以使得药物稳定；
3)防止药物在胃酸的作用下失活或减少对胃的刺激性，例如红霉素、胰岛素等易在胃内失活，吲哚美辛等刺激胃、易引起胃溃疡的药物，可用微囊化克服这些缺点；
4)使液态药物固态化以便于应用和储存，例如可将脂溶性维生素等药物微囊化；
5)有利于复方药物的配伍，例如可以将难以配伍的阿司匹林与扑尔敏分别包裹，再按剂量组成复方制剂，就可避免药物之间的相互影响；
6)使药物具有缓释或控释性能，例如可以采用惰性模块、薄膜、可生物降解材料、亲水性凝胶等作为微囊化材料，从而使药物具有缓释或控释性；
7)使药物具有靶向性，例如可将治疗指数低的药物或细胞毒素药制成靶向制剂，使得药物浓集于肺或肝等靶区，提高药物的疗效，降低毒副作用；
8)可将活细胞或生物活性物质包裹，以提高在体内的生物活性，从而具有很好的生物相容性和稳定性；
9)定位释放：利用一些高分子材料溶解的pH依赖性，使药物制成微囊或微球后在胃肠道定位释放，提高生物利用度减小副作用。
茶起源于中国，传播与世界。茶的历史悠久并且被广泛接受，不仅是因为茶具有解渴的功效，更重要的是茶叶具有多种医疗保健功能。茶叶的有效成分大致可以分为酚类、多糖类、维生素类、氨基酸类等，其中以茶多酚、茶多糖、氨基酸在茶叶中的含量较多，所起的作用相对较大，一般被认为是茶叶中的主要活性成分，截至目前对它们的研究也最广泛和深入。这些活性成分有很多功能例如是一种很有效的天然的抗氧化剂，可以降血脂，可以消炎抗辐射，预防和治疗肿瘤 的功能等等。但是这些成分在潮湿、阳光、高温等条件下极易发生氧化、聚合、缩合等反应，稳定性很差，口服生物利用度特别低，另外自身又存在苦涩的味道等问题，因此限制了茶多酚的应用。文献也有报道利用海藻酸钠-壳聚糖微球来包裹茶多酚，但是研究结果表明，茶多酚在微球中的含量比较低，另外，由于茶多酚的稳定性没有得到根本性的提高。
本发明利用海藻酸钠微球做为载体，以茶多酚作为茶叶有效成分之一对其进行了微囊化研究，在微球中加入多孔二氧化硅显著增强茶多酚的含量，并且显著缩短茶多酚在水溶液中的时间，采用冷冻干燥的方法来干燥微球，显著增强了茶多酚的稳定性。此方法制备得到茶多酚微球，为解决茶多酚应用的局限性提供参考。
发明内容
本发明目的在于提供了一种茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于主要由以下重量份的组分制成：海藻酸钠1～8份、壳聚糖1～5份、多孔二氧化硅1～5份、茶多酚4～8份。
其中各组分的重量份配比优选为：海藻酸钠2～6份、壳聚糖1～3份、多孔二氧化硅1～3份、茶多酚3～7份。
各组分的重量份配比进一步优选为：海藻酸钠4～6份、壳聚糖1～2份、多孔二氧化硅1～2份、茶多酚3～6份。
其中所述海藻酸钠的分子量为10,000～600,000；所述壳聚糖的分子量为10,000～600,000；所述多孔二氧化硅的粒径在20nm，并且具有多孔性。
本发明目的还在于提供了一种茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球的制备方法、茶多酚的含量测定方法以及茶多酚载药量和包封率的测定方法。
其制备方法如下：
采用液滴法制备茶多酚微球。第一种方法为一步法制备茶多酚微球，具体方法如下：将多孔二氧化硅、茶多酚、0.5wt％-2wt％海藻酸钠水溶液混合脱气后，然后将此溶液以一定的速度滴到接受液中，此接收液中含有氯化钙和壳聚糖，持续搅拌1h，过滤，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。第二种方法为两步法即第一步制备空白海藻酸钠-壳聚糖微球，第二步利用空白微球吸附茶多酚 来制备茶多酚微球。具体方法如下，将0.5wt％-2wt％海藻酸钠和二氧化硅的水溶液脱气，然后将此溶液以一定的速度滴加到接受液中，此接收液中含有氯化钙和壳聚糖，持续搅拌1h，过滤，收集微球，将制得的空白微球置于适当浓度的茶多酚溶液中，缓慢搅拌下吸附2h，收集微球，水洗后冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。
茶多酚的含量测定方法如下：
茶多酚水溶液在波长280nm处有最大吸收，其线性范围是5-40μg/ml。微球中茶多酚的含量测定如下：精密称取茶多酚微球约10-50mg，置于小烧杯中，加入柠檬酸三钠溶液(pH4.0)，避光，电磁搅拌约1-2h，取上清液体。提取2次，合并2次提取液，置于容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密量取以上溶液在波长280nm处测定吸收度，从而得到茶多酚的含量。
茶多酚载药量和包封率的测定方法包括下列步骤：
依照如上茶多酚含量测定的方法，测定微球中茶多酚的浓度，载药量和包封率通过公式计算得到。
载药量％＝(茶多酚浓度*体积/微球的质量)*100％
包封率％＝(包载茶多酚的质量/制备时加入的茶多酚质量)*100％
本发明目的还在于提供了一种茶多酚微球在制备降血脂、降血压、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤药物中的用途。
附图说明
图一海藻酸钙凝胶形成的蛋箱结构
具体实施方式
以下结合实施例和试验例具体说明本发明，本发明的实施例和试验例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
[实施例1]茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球的一步法制备
利用液滴法中的一步法制备茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球。
制剂1：将100mg茶多酚溶解在1wt％海藻酸钠(分子量约10万，60目，黏度120mPa·s)水溶液中，脱气后，然后将此溶液以一定的速度滴到含有0.1M氯化钙和0.4wt％壳聚糖(分子量20万)的接受液中，续搅拌1h，过滤，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。按照茶多酚含量测定的方法，测定微球中茶多酚的含量并计算载药量和包封率。
制剂2：将100mg茶多酚和20mg多孔二氧化硅溶解分散在1wt％海藻酸钠(分子量约10万，60目，黏度120mPa·s)水溶液中，脱气后，然后将此溶液以一定的速度滴到含有0.1M氯化钙和0.4wt％壳聚糖(分子量20万)的接受液中，续搅拌1h，过滤，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。按照茶多酚含量测定的方法，测定微球中茶多酚的含量并计算载药量和包封率。
| 包封率 | 载药量 | |
| 制剂1 | 40％ | 7％ |
| 制剂2 | ＞90％ | ＞30％ |
一步法中，加入多孔二氧化硅后可以显著提高茶多酚的包封率和载药量。
[实施例2]茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球的两步法制备
利用液滴法中的两步法制备茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球。
制剂3：1wt％海藻酸钠(分子量约10万，60目，黏度120mPa·s)水溶液脱气后，然后将此溶液以一定的速度滴到含有0.1M氯化钙和0.4wt％壳聚糖(分子量20万)的接受液中，续搅拌1h，过滤，得到空白微球。将制得的空白微球置于10mg/ml茶多酚溶液中，缓慢搅拌下吸附2h，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。按照茶多酚含量测定的方法，测定微球中茶多酚的含量并计算载药量和包封率。
制剂4：将20mg多孔二氧化硅分散在1wt％海藻酸钠(分子量约10万，60目，黏度120mPa·s)水溶液中，脱气后，然后将此溶液以一定的速度滴到含有0.1M氯化钙和0.4wt％壳聚糖(分子量20万)的接受液中，续搅拌1h，过滤，得到空白微球。将制得的空白微球置于10mg/ml茶多酚溶液中，缓慢搅拌下吸附2h，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。按照茶多酚含量测定的方法，测定微球中茶多酚的含量并计算载药量和包封率。
| 包封率 | 载药量 | |
| 制剂3 | 30％ | 5％ |
| 制剂4 | ＞80％ | ＞30％ |
两步法中，加入多孔二氧化硅后同样可以显著提高茶多酚的包封率和载药量。
[实施例3]茶多酚海藻酸钠-壳聚糖微球的稳定性考
将茶多酚原料、制剂1、制剂2、制剂3、制剂4在室温放置2个月后发现，茶多酚放置几天后吸潮，颜色变成红色，经紫外波长扫描显示，茶多酚被氧化成醌类物质，形成二聚体，最大吸收峰红移。而制剂1-4中，茶多酚被包裹在微球中，颜色没有显著变化，紫外最大吸收波长没有发生改变。
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Claims (9)
1.一种茶多酚微球，其特征在于主要由以下重量份的组分制成：
海藻酸钠1～8份、壳聚糖1～5份、多孔二氧化硅1～5份、茶多酚4～8份。
2.按照权利要求1所述的茶多酚微球，其特征是各组分的重量份配比是：海藻酸钠2～6份、壳聚糖1～3份、多孔二氧化硅1～3份、茶多酚3～7份。
3.按照权利要求2所述的茶多酚微球，其特征是各组分的重量份配比是：海藻酸钠4～6份、壳聚糖1～2份、多孔二氧化硅1～2份、茶多酚3～6份。
4.权利要求1、2或3所述的茶多酚微球，其特征是所述海藻酸钠的分子量为10,000～600,000。
5.权利要求1、2或3所述的茶多酚微球，其特征是所述壳聚糖的分子量为10,000～600,000。
6.权利要求1、2或3所述的茶多酚微球，其特征是所述多孔二氧化硅的粒径在20nm，并且具有多孔性。
7.一种权利要求1-6之一所述的茶多酚微球的制备方法，包括以下步骤：
将多孔二氧化硅、茶多酚、0.5wt％-2wt％海藻酸钠水溶液混合脱气后，将此溶液以一定的速度滴到接受液中，此接收液中含有氯化钙和壳聚糖，持续搅拌1h，过滤，收集微球，冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。
8.一种权利要求1-6之一所述的茶多酚微球的制备方法，包括以下步骤：将0.5wt％-2wt％海藻酸钠和二氧化硅的水溶液脱气，然后将此溶液以一定的速度滴加到接受液中，此接收液中含有氯化钙和壳聚糖，持续搅拌1h，过滤，收集微球，将制得的空白微球置于适当浓度的茶多酚溶液中，缓慢搅拌下吸附2h，收集微球，水洗后冷冻干燥24h，即得茶多酚微球。
9.权利要求1～6任一项所述的茶多酚微球在制备降血脂、降血压、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤药物中的用途。
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