CN108114287B - 蛋白-多酚复合微球及其制备方法和用途 - Google Patents

蛋白-多酚复合微球及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛋白‑多酚复合微球及其制备方法和用途，将蛋白提取物水溶液和多酚类化合物水溶液混合，由具有自由醛基的化合物引发交联反应，通过对蛋白提取物与多酚类化合物之间的反应进行调控，获得具有粒径范围分布较宽(10μm～10nm)、且粒径尺寸可调控的蛋白‑多酚复合微球。制备得到的蛋白‑多酚复合微球，不仅可以传送作为反应原料的多酚类化合物、蛋白提取物和醛基合物，还可以传送及与蛋白、多酚相互作用的药物，且其作为肿瘤药物载体时，能够有效增强药物的抗肿瘤效果。

Description

蛋白-多酚复合微球及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及蛋白-多酚复合微/纳米复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
多酚类化合物是一类广泛存在于多种植物中具有多元酚结构的物质,且储量丰富,如绿茶中的茶多酚含量可达茶叶干重的40％。茶多酚具有抗氧化性、抗癌、抑菌消炎和抗病毒等优异的生物学性能,在食品、日化、医药卫生等领域广泛应用。但是多酚在体内代谢速率过快，致使其生物利用度较低，影响了多酚资源的利用。
利用多酚和蛋白相互作用制备纳米材料应用于抗肿瘤研究，显示了很好的抗肿瘤效果。比如用明胶层层包裹EGCG，保持了多酚的活性可以有效的杀死乳腺癌细胞；通过反溶剂法可以制备BSA包裹的、粒径在200nm左右的蛋白多酚纳米粒。申请号为CN201210375599.8的专利申请文件公开了一种包封多酚类活性物质的纳米粒子及其制备方法，通过蛋白和多糖先发生Maillard反应得到蛋白-多糖复合物，再将蛋白-多糖复合物和多酚类物质通过非共价自组装形成负载多酚的纳米粒。但是目前制备蛋白-多酚类复合材料的方法仍然存在很大的局限性：(1)纳米材料的分散性和稳定性不好，粒径范围无法实现调控且调控范围狭窄，不能实现从几十纳米到微米大范围的粒径调控；(2)多酚负载量很低大多数不超过30％；(3)目前所有负载方式都是先制备好载体再用载体去包封多酚，要经过最少两步甚至多步的合成过程，且纳米材料分离过程比较复杂，从而使蛋白-多酚类复合材料制备过程比较复杂，导致产量不足。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术的不足，提供一种蛋白-多酚复合微球的制备方法，以获得具有较宽粒径调控范围、且粒径尺寸可控的蛋白-多酚复合微球并简化工艺。本发明另一目的旨在提供一种采用上述制备方法得到的蛋白-多酚复合微球。本发明的第三个目的旨在提供所得蛋白-多酚复合微球作为抗肿瘤药物载体的应用。
本发明基于共价结合技术，以蛋白提取物与多酚类化合物为主要原料，由醛基化合物提供具有共价键的官能团；通过共价结合的方式利用醛基化合物调控蛋白提取物与多酚类化合物之间的反应，从而达到调控复合微球粒径尺寸和引入不同的酚类、蛋白和醛类的目的。
基于上述发明思路，本发明提供的蛋白-多酚复合微球的制备方法，步骤如下：
(1)用去离子水将蛋白提取物配制成浓度为10mg/ml～0.2mg/ml的蛋白提取物水溶液；
(2)用去离子水将多酚类化合物配制成浓度为50mg/ml～0.2mg/ml的多酚类化合物水溶液；
(3)用去离子水将醛基化合物配制成体积百分比为10％～0.001％的醛基化合物水溶液；
(4)将步骤(1)得到的蛋白提取物水溶液和步骤(2)得到的多酚类化合物水溶液按照体积比1：(1～2)计量并混合得到第一混合液；将第一混合液和步骤(3)得到的醛基化合物水溶液按照体积比100：(1～4)计量并混合得到第二混合液；将第二混合液于室温搅拌反应，搅拌反应时间的控制以第二混合液转变为呈现乳光或乳白色的混悬液即可；
(5)将步骤(4)所得混悬液离固液分离，再将分离所得固体粒子洗涤、冷冻干燥即得到蛋白-多酚复合微球。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，将蛋白提取物水溶液和多酚类化合物水溶液混合，由具有自由醛基的化合物引发交联反应，通过对蛋白提取物与多酚类化合物之间的反应进行调控，获得具有粒径范围分布较宽(5μm～20nm)的蛋白-多酚复合微球；获得的复合微球粒径与蛋白提取物水溶液和多酚类化合物水溶液浓度有关，当浓度较大的两种溶液混合时，可以得到粒径较大的复合微球，当浓度较小的两种溶液混合时，最终得到的复合微球粒径较小；在优选的实施方式中，蛋白提取物水溶液浓度为2mg/ml～0.2mg/ml，多酚类化合物水溶液浓度为10mg/ml～0.2mg/ml，醛基化合物水溶液体积百分比为1％～0.01％，在上述优选范围内，通过本发明提供的制备方法可以制备出数百纳米级至数十纳米级粒径可控的蛋白-多酚复合纳米球。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，所述蛋白提取物为人发角蛋白、羊毛角蛋白、羽毛角蛋白、明胶、乳清蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白、酪蛋白中的一种；所述多酚类化合物为茶多酚、棉酚、花青素、单宁酸中的一种；所述醛基化合物为甲醛、乙醛或戊二醛。
上述通过含醛基化合物制备的蛋白-多酚复合微球，由于其添加的含有醛基的化合物可以用于调节蛋白提取物与多酚类化合物之间的反应，从而可以使制备的复合微球的粒径范围达到5μm～20nm。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，步骤(1)中进一步将所得浓度为10mg/ml～0.2mg/ml的蛋白提取物水溶液加入还原剂进行还原处理，还原剂的加入量以在蛋白提取物水溶液中的浓度为1mmol/L～20mmol/L计量；以还原处理后的蛋白提取物水溶液为原料，还原处理后的蛋白提取物可以提供更多的官能团参与共价反应，最终得到的复合微球粒径分布为500nm～10nm；所述还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐，处理方式为将还原剂加入到配制的蛋白提取物水溶液中，搅拌均匀即可。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，步骤(1)中进一步将所得蛋白提取物水溶液的pH值调节为2～5；以pH值为2～5的蛋白提取物水溶液为原料时，最终得到的复合微球粒径分布为约10μm～20nm，由此可见，当蛋白提取物水溶液显酸性时，可以制备粒径偏大的蛋白-多酚复合微球，且采用pH值为2～5的蛋白提取物水溶液可以加快蛋白与多酚合成反应速率。可以用水与盐酸或乙酸的混合液对蛋白提取物水溶液的pH值进行调节。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，所述步骤(5)中进行洗涤的目的是去除附着在固体粒子表面未参加反应的蛋白提取物和/或多酚类化合物和/或醛基化合物，具体实现方式为用去离子水对所得固体粒子洗涤3-5次即可。
上述蛋白-多酚复合微球的制备方法，所述步骤(5)中冷冻干燥的操作是：首先向洗涤后的固体粒子中加入该固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，然后在-50～-40℃条件下预冻10～20h，再以每4～8h升高1～5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-25～-20℃时，完成冷冻干燥。
通过上述制备方法得到的蛋白-多酚复合微球，粒径范围可达10μm～10nm，其中蛋白提取物的质量分数可达30％～70％，多酚类化合物的质量分数为70％～30％，余量为由醛基化合物提供的具有共价键的官能团。较宽的粒径范围可以实现控制通过不同的途径向细胞传送物质，比如吞噬、由小窝蛋白介导的胞饮和由网格蛋白介导的胞吞；此外，因为不同的器官对不同的粒径截留范围不同，可以靶向的向某一器官递送药物。同时，由于蛋白也具有一定的抗氧化效果，而且蛋白可以保护多酚避免多酚和氧气的接触，可以增强多酚类化合物的抗氧化性。
所制备的蛋白-多酚复合微球不仅可以保持多酚的活性，而且具有良好的长期分散稳定性，可以作为载体，传送作为反应原料的多酚类化合物、蛋白提取物和醛基化合物；还可以传送与蛋白、多酚相互作用的药物，包括通过物理负载方式装载至复合微球蛋白、多酚上的药物以及通过共价结合，与蛋白、多酚共价反应结合至复合微球上的药物等，实现多种药物的共同传送。特别的，通过上述蛋白-多酚复合微球作为肿瘤药物载体时，在特定环境(例如肿瘤细胞环境等)下被降解释放负载的客体分子，达到靶向的客体分子释放，并能够有效增强药物的抗肿瘤效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，通过醛基化合物对蛋白提取物与多酚类化合物之间的反应进行调控，通过对蛋白提取物水溶液进行还原处理及pH值调节，因而可获得粒径范围分布较宽(10μm～10nm)、且粒径尺寸可调控的蛋白-多酚复合微球。
2、本发明所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，通过一步合成反应完成蛋白-多酚复合微球的制备，不仅操作简单，避免使用其它耗能设备，而且产率最高可达到90％，适于大规模工业化生产。
3、本发明所述制备方法得到的蛋白-多酚复合微球，粒径均一，分散性好，可长时间稳定存在，且其可调控粒径范围在10μm～10nm之间，具有较宽的粒径分布范围，因而具有广阔的应用前景。
4、本发明所述制备方法得到的蛋白-多酚复合微球，不仅可以传送作为反应原料的多酚类化合物、蛋白提取物和醛基化合物，还可以传送与蛋白、多酚相互作用的药物，实现多种药物的共同传送。
5、本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球，作为肿瘤药物载体时，能够有效增强药物的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实施例1中当浓度为10mg/ml的人发角蛋白与浓度为50mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约5μm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图2为实施例1中当浓度为2mg/ml的人发角蛋白与浓度为20mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约1μm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图3为实施例1中当浓度为2mg/ml人发角蛋白与浓度为10mg/ml的茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约300nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图4为实施例2中当浓度为2mg/ml的羊毛角蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约150nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图5为实施例3中当浓度为2mg/ml的羽毛角蛋白与浓度为1mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图6为实施例6中当浓度为1mg/ml的大豆蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图7为实施例1中当浓度为1mg/ml的人发角蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约120nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图8为实施例9中当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图9为实施例10中当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约50nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图10为实施例8中当浓度为1mg/ml人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml的茶多酚按照体积比1:2参与反应所得平均粒径约80nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图11为实施例5中当浓度为1mg/ml的乳清蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约60nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图12为实施例4中当浓度为1mg/ml的明胶与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约30nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图13为实施例15中当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得平均粒径约20nm蛋白-多酚复合微球的扫描电镜图。
图14通过实施例3得到的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球(a)和EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)(b)的抗肿瘤效果图。
图15通过实施例3得到的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球在4℃水中长期稳定性测试图。
图16为实施例10得到的平均粒径约50nm蛋白-多酚复合微球在放入细胞内模拟环境前后的响应试验结果；其中(a)为蛋白-多酚复合微球放入细胞内模拟环境前的扫描电镜图，(b)为蛋白-多酚复合微球放入细胞内模拟环境后的扫描电镜图。
图17为实施例3得到的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合微球在不同模拟环境下的药物释放量变化曲线图，其中(a)模拟血液内环境，(b)模拟肿瘤细胞内环境A，(c)模拟肿瘤细胞内环境B。
图18为注射不同药物制剂后，小鼠体内移植瘤体积变化示意图，其中(a)为注射生理盐水100μL后移植瘤体积变化曲线，(b)为注射含盐酸阿霉素(浓度5mg/kg)的生理盐水100μL后移植瘤体积变化曲线，(c)为注射负载盐酸阿霉素的蛋白-多酚复合纳米球(盐酸阿霉素浓度5mg/kg、蛋白-多酚复合微球浓度25mg/kg)的葡萄糖溶液100μL后移植瘤体积变化曲线。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的人发角蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使人发角蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的人发角蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将50μl甲醛加入到50ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为0.1％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的人发角蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌48小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤3次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-50℃条件下预冻10h，再以每8h升高5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-20℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的人发角蛋白-茶多酚复合微球。
其中，当浓度为10mg/ml的人发角蛋白与浓度为50mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为5μm，见图1；当浓度为2mg/ml的人发角蛋白与浓度为20mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为1μm，见图2；当浓度为2mg/ml人发角蛋白与浓度为10mg/ml的茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为300nm，见图3；当浓度为1mg/ml人发角蛋白与浓度为2mg/ml的茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为120nm，见图7。得到的其它组的复合微球粒径尺寸分布也满足类似的规律，即当浓度较大的两种溶液混合时，可以得到粒径较大的复合微球；当浓度较小的两种溶液时，得到的复合微球粒径较小。经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
实施例2
本实施例中采用的蛋白提取物为羊毛角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的羊毛角蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使羊毛角蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的羊毛角蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将500μl甲醛加入到50ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为1％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的羊毛角蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌24小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤5次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-40℃条件下预冻20h，再以每4h升高1℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-25℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的羊毛角蛋白-茶多酚复合微球。
经分析，20组羊毛角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好；其中，当浓度为2mg/ml的羊毛角蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为150nm，见图4。
实施例3
本实施例中采用的蛋白提取物为羽毛角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的羽毛角蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使羽毛角蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的羽毛角蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将5μl甲醛加入到50ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为0.01％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的羽毛角蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌12小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤3次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-45℃条件下预冻15h，再以每6h升高3℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-20℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的的羽毛角蛋白-茶多酚复合微球。
经分析，20组羽毛角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好；其中，当浓度为2mg/ml的羽毛角蛋白与浓度为1mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为100nm，见图5。
实施例4
本实施例中采用的蛋白提取物为明胶，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的明胶分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使明胶使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的明胶提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将5μl甲醛加入到500ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为0.001％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的明胶水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌24小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤3次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-50℃条件下预冻15h，再以每6h升高5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-20℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的明胶-茶多酚复合微球。
经分析，20组明胶-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好；其中，当浓度为1mg/ml的明胶与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为30nm，见图12。
实施例5
本实施例中采用的蛋白提取物为乳清蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的乳清蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使乳清蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的乳清蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将500μl甲醛加入到5ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为10％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的乳清蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌48小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤5次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-50℃条件下预冻10h，再以每5h升高2℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-25℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的的乳清蛋白-茶多酚复合微球。
经分析，20组乳清蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好；其中，当浓度为1mg/ml的乳清蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为60nm，见图11。
实施例6
本实施例中采用的蛋白提取物为大豆蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的大豆蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使大豆蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的大豆蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将100μl甲醛加入到50ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为0.2％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的大豆蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌24小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤3次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-40℃条件下预冻15h，再以每7h升高5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-20℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的大豆蛋白-茶多酚复合微球。
经分析，20组大豆蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好；其中，当浓度为1mg/ml的大豆蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为100nm，见图6。
实施例7
本实施例中采用的蛋白提取物为胶原蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程如下：
(1)将500mg、100mg、50mg、10mg的胶原蛋白分别加入到4个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使胶原蛋白使完全溶解，配制成浓度为10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的胶原蛋白提取物水溶液；
(2)将2500mg、1000mg、500mg、100mg、10mg的茶多酚分别加入到5个盛有50ml水溶液的烧杯中，在磁力搅拌下于室温使茶多酚完全溶解，配制成浓度为50mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、2mg/ml、0.2mg/ml的茶多酚水溶液；
(3)将50μl甲醛加入到50ml去离子水中，配制成甲醛体积百分比为0.1％的甲醛水溶液；
(4)将步骤(1)得到的胶原蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液等体积组合得到20组不同的第一混合液；然后向20组不同的第一混合液中分别加入2ml步骤(3)得到的甲醛水溶液得到20组不同的第二混合液；将20组不同的第二混合液搅拌48小时得到呈现乳光或乳白色的混悬液，反应结束；
(5)将反应所得20组混悬液分别离心10min，然后去除上清液，收集所得固体粒子，再用去离子水对所得固体粒子洗涤3次(每次20ml)；向洗涤后的固体粒子中加入固体粒子质量3％～8％的甘油并混合均匀，在-40℃条件下预冻20h，再以每7h升高5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-20℃时，完成冷冻干燥，即得到20组不同粒径尺寸的胶原蛋白-茶多酚复合微球。
经分析，20组胶原蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
实施例8
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(4)中，将步骤(1)得到的胶原蛋白水溶液和步骤(2)得到的茶多酚水溶液按照体积比1:2组合得到20组不同的第一混合液。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。其中，当浓度为1mg/ml的人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为80nm，见图10。
实施例9
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为乙醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(3)中，将500μl乙醛加入到50ml去离子水中，配制成乙醛体积百分比为1％的乙醛水溶液；步骤(4)中，向20组不同的第一混合液中分别加入4ml步骤(3)得到的乙醛水溶液。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。其中，当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为100nm，见图8。
实施例10
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为戊二醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(3)中，将50μl戊二醛加入到50ml去离子水中，配制成戊二醛体积百分比为0.1％的戊二醛水溶液；步骤(4)中向20组不同的第一混合液中分别加入1ml步骤(3)得到的戊二醛水溶液。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。其中，当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为50nm，见图9。
实施例11
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚(江苏无锡太阳绿宝,Lot 209271)，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用二硫苏糖醇进行还原处理，还原处理的具体过程为：按照二硫苏糖醇在人发角蛋白提取物水溶液中浓度1mmol/l，将二硫苏糖醇添加到人发角蛋白提取物水溶液中，搅拌均匀即可。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为500nm-10nm，且粒径均一、分散性好。
实施例12
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用β-巯基乙醇进行还原处理，还原处理的具体过程为：按照β-巯基乙醇在人发角蛋白提取物水溶液中浓度10mmol/l，将β-巯基乙醇添加到人发角蛋白提取物水溶液中，搅拌均匀即可。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为500nm-10nm，且粒径均一、分散性好。
实施例13
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用三(2-羧乙基)膦盐酸盐进行还原处理，还原处理的具体过程为：按照三(2-羧乙基)膦盐酸盐在人发角蛋白提取物水溶液中浓度20mmol/l，将三(2-羧乙基)膦盐酸盐添加到人发角蛋白提取物水溶液中，搅拌均匀即可。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为300nm-10nm，且粒径均一、分散性好。
实施例14
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用乙酸水溶液调节人发角蛋白提取物水溶液pH值为5，步骤(4)中的搅拌时间为2h，其它步骤不变。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为10μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
实施例15
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用盐酸水溶液调节人发角蛋白提取物水溶液pH值为3，步骤(4)中的搅拌时间为1h，其它步骤不变。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为10μm～20nm，且粒径均一、分散性好。其中，当浓度为0.2mg/ml的人发角蛋白与浓度为0.2mg/ml茶多酚等体积参与反应所得复合微球的平均粒径约为20nm，见图13。
实施例16
本实施例中采用的蛋白提取物为人发角蛋白，多酚类化合物为茶多酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1基本相同，其不同在于步骤(1)中的人发角蛋白提取物水溶液用盐酸水溶液同时调节人发角蛋白提取物水溶液pH值为2，步骤(4)中的搅拌时间为0.5h，其它步骤不变。
经分析，20组人发角蛋白-茶多酚复合微球的粒径尺寸分布范围为10μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
实施例17
本实施例中采用的蛋白提取物为胶原蛋白，多酚类化合物为棉酚，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1相同。经分析，20组胶原蛋白-棉酚复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
实施例18
本实施例中采用的蛋白提取物为酪蛋白，多酚类化合物为花青素，醛基化合物为甲醛。
本实施例制备蛋白-多酚复合微球的制备过程与实施例1相同。经分析，20组酪蛋白-花青素复合微球的粒径尺寸分布范围为5μm～20nm，且粒径均一、分散性好。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球的多酚和蛋白的含量，采用Folin-Ciocalceu比色法和考马斯亮蓝法分别检测实施例3制备得到的多酚和蛋白的含量，由实施例3制备得到的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合纳米球多酚含量67.8％，蛋白含量32％。由实施例8制备得到的平均粒径约80nm蛋白-多酚复合纳米球多酚含量30.2％,蛋白含量69.5％。由实施例15制备得到的平均粒径约20nm蛋白-多酚复合纳米球多酚含量49.2％,蛋白含量49.5％。由此可见，通过本发明制备的蛋白-多酚复合微球中蛋白提取物的质量分数可达30％～70％，多酚类化合物的质量分数为70％～30％，余量为由醛基化合物提供的具有共价键的官能团。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球的多酚活性，由实施例3制备得到的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合纳米球和EGCG对照样品配制成不同浓度的水溶液，通过MTT实验检测各种浓度制剂对乳腺癌肿瘤细胞的抑制效果，检测结果如图14所示，从图中可以看出实施例3所制备的平均粒径约100nm蛋白-多酚纳米球在各个浓度下对乳腺癌细胞都起到很好的杀伤作用，表明通过本发明制备的蛋白-多酚复合微球很好的维持了多酚的抗肿瘤活性。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球的长期稳定性，将实施例3制备的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合纳米球存放于4℃水溶液中，定期通过激光动态光散射仪检测纳米球的粒径变化，检测结果如图15所示，从图中可以看出，蛋白-多酚复合纳米球存放90天后的粒径仍然未发生变化，表明通过本发明制备的蛋白-多酚复合微球具有长期稳定性。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球在模拟细胞内环境(采用谷胱甘肽模拟细胞内环境)的响应特性，采用10mM谷胱甘肽的PBS溶液处理实施10制备的平均粒径约50nm蛋白-多酚复合纳米球(浓度为200μg/ml)，24小时后通过透射电镜观察平均粒径约50nm蛋白-多酚复合纳米球的形貌变化，检测结果如图16所示，经谷胱甘肽处理处理后的蛋白-多酚符合纳米球结构被破坏，表明通过本发明制备的蛋白-多酚复合微球可以对细胞内环境响应，进一步被降解。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球在模拟细胞内环境的药物释放行为，将实施例3制备的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合纳米球负载盐酸阿霉素抗肿瘤药物，然后将负载药物的蛋白-多酚复合纳米球放入模拟血液内环境(以PBS为模拟血液内环境)、模拟肿瘤细胞内环境A(以10mM谷胱甘肽的PBS溶液为模拟肿瘤细胞内环境A)以及肿瘤细胞内环境B(以10mM谷胱甘肽和0.04mM胰酶的PBS溶液为模拟肿瘤细胞内环境B)，蛋白-多酚复合纳米球浓度为200μg/ml，检测三种不同条件下蛋白-多酚复合纳米球对抗肿瘤药物的释放行为，测试结果如图17所示，从图中可以看出，在模拟血液内环境药物有少量释放，在模拟肿瘤细胞内环境A中，药物释放量大大增加，在模拟肿瘤细胞内环境B中药物释放量最高，表明本发明制备的蛋白-多酚复合微球可以实现在特定环境下释放药物，达到靶向送药的目的，可作为抗肿瘤药物载体应用。
为了研究本发明制备方法得到的蛋白-多酚复合微球在体内抗肿瘤活性，用移植瘤模型小鼠检测负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素的蛋白-多酚复合纳米球(实施例3制备的平均粒径约100nm蛋白-多酚复合纳米球)在体内的抗肿瘤效果，检测结果如图18所示，从图中可以看出，采用负载抗肿瘤药物的蛋白-多酚复合纳米球治疗后的移植瘤体积最小，说明采用负载抗肿瘤药物的蛋白-多酚复合纳米球的的抗肿瘤效果要好于采用单纯抗肿瘤药物的抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.一种蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）用去离子水将蛋白提取物配制成浓度为10mg/ml~0.2mg/ml的蛋白提取物水溶液；
（2）用去离子水将多酚类化合物配制成浓度为50mg/ml~0.2mg/ml的多酚类化合物水溶液；
（3）用去离子水将醛基化合物配制成体积百分比为10%~0.001%的醛基化合物水溶液；
（4）将步骤（1）得到的蛋白提取物水溶液和步骤（2）得到的多酚类化合物水溶液按照体积比1：1~2计量并混合得到第一混合液；将第一混合液和步骤（3）得到的醛基化合物水溶液按照体积比100：1~4计量并混合得到第二混合液；将第二混合液于室温搅拌反应，搅拌反应时间的控制以第二混合液转变为呈现乳光或乳白色的混悬液即可；
（5）将步骤（4）所得混悬液离固液分离，再将分离所得固体粒子洗涤、冷冻干燥即得到蛋白-多酚复合微球。
2.根据权利要求1所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于所述蛋白提取物为人发角蛋白、羊毛角蛋白、羽毛角蛋白、明胶、乳清蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白、酪蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于所述多酚类化合物为茶多酚、棉酚、花青素、单宁酸中的一种。
4.根据权利要求1所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于所述醛基化合物为甲醛、乙醛或戊二醛。
5.根据权利要求1所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于所述蛋白提取物水溶液浓度为2mg/ml~0.2mg/ml，多酚类化合物水溶液浓度为10mg/ml~0.2mg/ml，醛基化合物水溶液体积百分比为1%~0.01%。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于进一步包括如下步骤：将所述步骤（1）中得到的浓度为10mg/ml~0.2mg/ml的蛋白提取物水溶液加入还原剂进行还原处理，还原剂的加入量以在蛋白提取物水溶液中的浓度为1mmol/L~20mmol/L计量，所述还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
7.根据权利要求1至5中任一权利要求所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于将所述步骤（1）中得到的浓度为10mg/ml~0.2mg/ml的蛋白提取物水溶液的pH值用盐酸或乙酸水溶液调节为2~5。
8.根据权利要求1至5任一权利要求所述蛋白-多酚复合微球的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中，冷冻干燥的操作是：首先向洗涤后的固体粒子中加入该固体粒子质量3%~8%的甘油并混合均匀，然后在-50~-40℃条件下预冻10~20h，再以每4~8 h升高1~5℃的条件进行梯度冷冻干燥，当温度升至-25~-20℃时，完成冷冻干燥。
9.权利要求1至8中任一权利要求所述方法制备的蛋白-多酚复合微球，其特征在于微球粒径为10μm~10nm。
10.权利要求9所述蛋白-多酚复合微球在作为抗肿瘤药物载体中的应用。
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茶多酚磁性白蛋白微球的制备;孟祥等;《食品科技》;20070120(第1期);第47-50页 *

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