KR20160028592A - 인간 중간엽 줄기 세포의 3차원적 공간 부착 및 골분화를 돕는 섬유상 입자가 도입된 알지네이트 하이드로젤 - Google Patents

인간 중간엽 줄기 세포의 3차원적 공간 부착 및 골분화를 돕는 섬유상 입자가 도입된 알지네이트 하이드로젤 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드로젤에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체에 관한 것으로, 본 발명의 하이드로젤 지지체는 알지네이트 하이드로젤 내에서 RGD 펩티드가 도입된 PLLA(poly L-lactide) 섬유상 입자는 세포 외 기질의 콜라젠과 유사한 구조적 기능적 특성을 보여주어 3차원 공간에서 세포의 섬유상 입자와의 결합을 유도하여 줄기세포의 생존률을 유의적으로 증가시키고 골 세포의 분화 및 석회화를 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 하이드로젤 지지체를 줄기세포의 배양 또는 골세포 분화용 조직공학적 지지체로 유용하게 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

Description

인간 중간엽 줄기 세포의 3차원적 공간 부착 및 골분화를 돕는 섬유상 입자가 도입된 알지네이트 하이드로젤{Fibrous particle-incorporated alginate hydrogels to guide spreading and osteogenic differentiation of 3D-encapsulated human mesenchymal stem cells}
본 발명은 세포의 3차원 배양을 위한 세포부착 리간드가 결합된 섬유형 입자를 포함하는 조직공학용 하이드로젤(hydrogel) 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
하이드로젤(hydrogel)은 상호간 연결된 네트워크 구조 및 생체 적합성 때문에 세포 전달체로서 재생의료(regenerative medicine)에서 널리 사용되고 있다(1). 갈조류(brown algae) 유래의 음이온성 다당류인 알지네이트(alginate)는 Ca2 +, Mg2 + 및 Ba2 + 등의 이온을 이용하여 손쉽게 가교 되며(cross-linked), 가교된 하이드로젤은 적절한 기계적 특성 및 세포 생존 환경을 제공하고 있어(2, 3, 4), 연골 조직(cartilage tissue) 재생용 지지체나 및 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells; hMSC)의 세포반응 조절에 사용되고 있다(5, 6). 이러한 알지네이트의 우수한 기계적 또는 물리적 특성에도 불구하고, 알지네이트 하이드로젤은 종종 내부 혹은 표면에서 세포의 성장을 충분히 유도하고 있지 못하고 있는데, 이는 세포와 상호작용할 수 있는 생체활성인자 또는 기능기의 부재에서 기인하는 것으로 알려져 있다. 소재의 제한된 생물학적 기능성은 세포 결합 펩티드의 도입을 통해 개선되고 있는데(7, 8), 피브로넥틴(fibronectin) 또는 콜라겐(collagen) 유래의 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드는 이러한 용도에 사용되는 활발하게 사용되고 있다. RGD 펩티드는 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC)의 화학물질을 통해 알지네이트 백본(backbone)에 손쉽게 고정이 가능하며, RGD펩티드가 도입된 알지네이트 하이드로젤은 세포의 생존률 및 단백질 발현을 성공적으로 조절하고 있다(9).
하이드로젤 소재의 부분적인 생체활성물질의 도입은 세포의 생존을 위한 적절한 환경을 제공함에도 불구하고, 인공적인 하이드로젤과 자연의 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM) 사이에는 큰 구조적 차이가 나타난다. 예를 들면, 콜라겐 및 엘라스틴(elastin)과 같은 세포 외 기질 단백질은 세포가 부착될 수 있는 기질(cell anchorage sites)을 제공하고 있으며, 이들은 구조적으로 나노 및 마이크로 스케일 범위에서 섬유 구조체로 나타나고, 기능적으로 복잡한 세포 성장 신호 전달을 관장하는 피브로넥틴 및 비트로넥틴(vitronectin) 등의 세포 결합 단백질과 조합된다(10). 그러나, 현재 하이드로젤 시스템은 생체활성물질의 결합을 통해 세포 기능 조절에 긍정적인 영향을 주는 세포 생존 환경을 제공하고 있지만, 상기 구조는 본래의 세포 외 기질(ECM)에서 제공되는 섬유 구조와는 다소 상이한 환경을 제공하여, 이는 세포반응 조절에서는 제한 사항으로 인식될 수 있다.
인공지지체(scaffold)에서 개발에 있어서 세포 외 기질(ECM)과 유사한 섬유형 환경의 재현은 세포 부착 및 생존에 중요한 영향을 줄 수 있으며, 이러한 환경의 인공적 모사는 전기 방사법(electrospining)을 통해 구현되고 있다. 이들 전기방사 지지체는 세포가 부착될 수 있는 나노 또는 마이크로 수준의 섬유형 플랫폼으로써 주목받고 있으나(11), 나노섬유 지지체에서 지지체 내부로의 제한적인 세포 침투는 전기 방사 나노섬유 지지체 사용의 단점으로 인식되고 있다.
이에 본 발명자들은 3차원 하이드로젤 환경에서 세포가 부착할 수 있는 구조적 지지체로써 단편화된 섬유인 섬유상 입자(fibrous particle, FP)를 포함하는 새로운 하이드로젤 시스템을 제작하였다. 상기 하이드로젤 시스템은 알지네이트 하이드로젤 내에서 RGD 펩티드가 부착된PLLA(poly L-lactide) 섬유상 입자가 세포와 함께 주입되었으며, 3차원 공간에서 주입된 섬유상 입자와 세포는 서로 결합하여 세포의 퍼짐에 영향을 줌과 동시에 하이드로젤 내의 줄기세포 생존률을 유의적으로 증가시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 상기 지지체를 줄기세포의 배양 또는 골세포 분화용 조직공학적 지지체로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
J. L. Drury and D. J. Mooney, Biomaterials, 2003, 24, 4337-4351. K. B. Fonseca, F. R. Maia, F. A. Cruz, D. Andrade, M. A. Juliano, P. L. Granja and C. C. Barrias, Soft Matter, 2013, 9, 3283-3292. H. Zimmermann, F. Wahlisch, C. Baier, M. Westhoff, R. Reuss, D. Zimmermann, M. Behringer, F. Ehrhart, A. Katsen-Globa, C. Giese, U. Marx, V. L. Sukhorukov, J. A. Vasquez, P. Jakob, S. G. Shirley and U. Zimmermann, Biomaterials, 2007, 28, 1327-1345. F. Topuz, A. Henke, W. Richtering and J. Groll, Soft Matter, 2012, 8, 4877-4881. J. Tritz, R. Rahouadj, N. de Isla, N. Charif, A. Pinzano, D. Mainard, D. Bensoussan, P. Netter, J.-F. Stoltz, N. Benkirane-Jessel and C. Huselstein, Soft Matter, 2010, 6, 5165-5174. S. Duggal, K. B. Frønsdal, K. Szoke, A. Shahdadfar, J. E. Melvik and J. E. Brinchmann, Tissue eng., 2009, 15, 1763-1773. S. l. J. Bidarra, C. C. Barrias, M. r. A. Barbosa, R. Soares and P. L. Granja, Biomacromolecules, 2010, 11, 1956-1964. S.-W. Kang, B.-H. Cha, H. Park, K.-S. Park, K. Y. Lee and S.-H. Lee, Macromol. Biosci., 2011, 11, 673-679. M. Shachar, O. Tsur-Gang, T. Dvir, J. Leor and S. Cohen, Acta Biomater., 2011, 7, 152-162. H. Fernandes, L. Moroni, C. van Blitterswijk and J. de Boer, J. Mater. Chem., 2009, 19, 5474-5484. T. J. Sill and H. A. von Recum, Biomaterials, 2008, 29, 1989-2006. T. G. Kim and T. G. Park, Macromol. Rapid Commun., 2008, 29, 1231-1236. T. G. Kim, S.-H. Park, H. J. Chung, D.-Y. Yang and T. G. Park, Adv. Funct. Mater., 2010, 20, 2303-2309. X. Ping, M. Wang and G. Xuewu, Rad. Phys. Chem., 2011, 80, 567-572. A. Schulze, M. F. Maitz, R. Zimmermann, B. Marquardt, M. Fischer, C. Werner, M. Went and I. Thomas, RSC Advances, 2013, 3, 22518-22526. I.-T. Hwang, M.-Y. Ahn, C.-H. Jung, J.-H. Choi and K. Shin, J. Biomed. Nanotech., 2013, 9, 819-824. Deelder, O. Guven, H. Ha, E.-S. Hegazy, A. S. Hoffman, I. Kaetsu, R. O. Mazzei, Z. Nurkeeva, M. T. Razzak, J. M. Rosiak, A. Safrany and M. Sen, Radiation Synthesis and Modification of Polymers for Biomedical Applications, IAEA TECDOC-1324, 2003. Y. M. Shin, K. S. Kim, Y. M. Lim, Y. C. Nho and H. Shin, Biomacromolecules, 2008, 9, 1772-1781. Y. M. Shin, H. Shin and Y. Lim, Macromol. Res., 2010, 18, 472-481. L. Grøndahl, A. Chandler-Temple and M. Trau, Biomacromolecules, 2005, 6, 2197-2203. H. J. Lee, J.-S. Lee, T. Chansakul, C. Yu, J. H. Elisseeff and S. M. Yu, Biomaterials, 2006, 27, 5268-5276. Y. B. Lee, Y. M. Shin, J.-h. Lee, I. Jun, J. K. Kang, J.-C. Park and H. Shin, Biomaterials, 2012, 33, 8343-8352. Y. M. Shin, I. Jun, Y.-M. Lim, T. Rhim and H. Shin, Macromol. Mater. Eng., 2013, 298, 555-564. N. Huebsch, P. R. Arany, A. S. Mao, D. Shvartsman, O. A. Ali, S. A. Bencherif, J. Rivera-Feliciano and D. J. Mooney, Nat. mater., 2010, 9, 518-526. K. M. Park, K. S. Ko, Y. K. Joung, H. Shin and K. D. Park, J. Mater. Chem., 2011, 21, 13180-13187. J. Lee and K. Y. Lee, Macromol. Biosci., 2009, 9, 671-676. H. Park, S.-W. Kang, B.-S. Kim, D. J. Mooney and K. Y. Lee, Macromol. Biosci., 2009, 9, 895-901. C. K. Kuo and P. X. Ma, Biomaterials, 2001, 22, 511-521. J.-Y. Sun, X. Zhao, W. R. K. Illeperuma, O. Chaudhuri, K. H. Oh, D. J. Mooney, J. J. Vlassak and Z. Suo, Nature, 2012, 489, 133-136. E. R. West, M. Xu, T. K. Woodruff and L. D. Shea, Biomaterials, 2007, 28, 4439-4448. A. Banerjee, M. Arha, S. Choudhary, R. S. Ashton, S. R. Bhatia, D. V. Schaffer and R. S. Kane, Biomaterials, 2009, 30, 4695-4699. J. Fan, Z. Shi, M. Lian, H. Li and J. Yin, J. Mater. Chem. A, 2013, 1, 7433-7443. W. H. Tan and S. Takeuchi, Adv. Mater., 2007, 19, 2696-2701. H.-j. Lee, S.-H. Ahn and G. H. Kim, Chem. Mater., 2011, 24, 881-891. E. Alsberg, K. W. Anderson, A. Albeiruti, R. T. Franceschi and D. J. Mooney, J. Dent. Res., 2001, 80, 2025-2029.
본 발명의 목적은 세포의 3차원 배양을 위한, 하이드로젤(hydrogel)에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이드로젤(hydrogel)에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하이드로젤에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 제조방법을 제공한다.
본 발명은 하이드로젤(hydrogel)에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체에 관한 것으로, 본 발명의 하이드로젤 지지체는 알지네이트 하이드로젤 내에서 RGD 펩티드가 결합된 PLLA(poly L-lactide) 섬유상 입자는 세포의 부착 환경을 제공함으로써 3차원 공간에 주입된 줄기세포의 생존률을 유의적으로 증가시키고 골 세포의 분화 및 석회화를 증가시키는 것을 확인하였다.
도 1은, 섬유상 입자(fibrous particle) 제조 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 섬유상 입자가 포함된 하이드로젤(hydrogel)의 개략도를 나타낸 도이다.
도 2는, 전기 방사 망(electrospun meshes)의 단편화 결과를 나타낸 도이다:
a: 일반적인 전기 방사 PLLA(poly L-lactide) 망;
b: 전기방사 PLLA 망의 주사전자현미경(scanning electron microscopy)으로 관찰한 결과;
c: 단편화된 섬유상 입자 분말;
d: 섬유상 입자를 주사전자현미경으로 관찰한 결과;
e: 섬유상 입자가 물 속에서 분산되는 정도를 관찰한 결과; 및
f: 물에 현탁된 섬유상 입자의 현미경 이미지.
도 3a는, 감마선 방사로 유도한 AAc(acrylic acid)의 농도(1, 5 및 10%) 및 방사선 조사량(1, 5 및 10 kGy)에 따른 카르복실기의 함유량을 나타낸 도이다.
도 3b는, 10 중량%의 AAc로 접합된 섬유상 입자의 ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3c는, RGD(Arg-Gly-Asp) 처리량(0.1, 1 및 5 mM)에 따른 접합된 RGD 펩티드의 정량 분석을 나타낸 도이다.
도 4는, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤의 형태학적 모습을 나타낸 도이다.
도 5는, 하이드로젤의 복소 탄성률(complex modulus)을 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 6a은, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells; hMSC)의 생존률 을 Live/Dead 분석으로 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 6b은, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 생존률 을 주사현미경으로 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 6c은, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 생존율을 MTT 분석으로 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 7a는, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 공초점 레이저 주사현미경으로 형광 이미지를 관찰한 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 7b는, 알지네이트 하이드로젤 및 8 mg/ml의 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤(A-FP8)에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포 3차원 퍼짐의 분포를 나타낸 도이다.
도 7c는, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 종횡비(aspect ratio)를 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 8a는, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤;
A-FP2: 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
도 8b는, 알지네이트 하이드로젤 및 섬유상 입자가 포함된 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 골 세포 유도(osteogenic induction) 14일 이후 Alizarin Red S 염색 결과를 나타낸 도이다:
Aliginate: 알지네이트 하이드로젤; 및
A-FP8: 알지네이트 하이드로젤에 8 mg/ml의 섬유상 입자를 도입한 하이브리드 하이드로젤.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하이드로젤(hydrogel)에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체를 제공한다.
상기 하이드로젤은 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴, 키토산 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포부착 리간드는 상기 단편화된 나노섬유의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 서열번호 1로 기재되는 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것이 바람직하며, 상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, RGD(Arg Gly Asp), RGDS(Arg Gly Asp Ser), RGDC(Arg Gly Asp Cys), RGDV(Arg Gly Asp Val), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro), GRGDS(Gly Arg Gly Asp, Ser), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정하지 않으며 RGD(Arg Gly Asp) 펩타이드인 것이 더욱 바람직하다.
상기 단편화된 나노섬유는,
1) 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 가용용매에 용해시킨 후 전기방사하여 나노섬유 망(nanofibrous meshes)을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 나노섬유 망을 화학적 분해 반응으로 단편화시키는 단계로 제조되는 것이 바람직하다.
상기 단계 1)의 폴리에스테르계 고분자는 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸린카보네이트, 이들의 유도체 및 공중합체로 구성된 군으로부터 최소 1 종 이상 선택되는 생체적 합성 또는 생분해성 고분자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 폴리(L-락트산)(PLLA)인 것이 더욱 바람직하다.
상기 고분자는 전기방사가 가능할 정도의 평균분자량을 갖는 것으로 1,000 내지 1,000,000인 것이 바람직하며 결정성이든 비정질성이든 상관없이 사용될 수 있다. 또한 전기방사를 위한 고분자 용액의 용매는 해당 고분자를 용해시킬 수 있고 전기방사가 가능한 것이면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 전기방사 공정은 적절한 전압을 인가하면서 적절한 방사 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 방사 공정시 인가되는 전압은 10 내지 20 kV의 범위 내로 설정하는 것이 안정적인 방사공정을 수행할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서는 상기에서 전기방사하여 얻은 나노섬유를 아세트산, 포름산 등과 같은 산성 유기용매 또는 폴리아민 용액 등과 같은 염기성이 강한 유기용매 등에 침지시켜 아미노 분해반응 등과 같은 화학적 분해반응을 하게 한다.
상기 화학적 분해반응은 아미노 분해반응인 것이 바람직하며 아미노 분해반응 단계에서 나노섬유의 결정화도에 따라 분해속도를 제어할 수 있으며, 결정화도는 전기방사시에 사용된 고분자의 종류, 용매, 고분자 용액의 농도, 방사 후 나노섬유의 열처리로 조절할 수 있다.
상기 화학적 분해반응 단계 중, 아미노 분해반응에 사용되는 폴리아민은 다이아민(diamine)과 트리아민(triamine)이 사용될 수 있으며, 그 구체적인 예로는 헥산다이아민(1,6-hexamethylenediamine), 에틸렌다이아민(ethylenediamine), 펜탄다이아민(1,3-pentanediamine), 메틸펜타메틸다이아민(2-methylpentamethylenediamine), 프로필렌다이아민(propylene-1,3-diamine), 테트라메틸렌다이아민(tetramethylenediamine), 펜타메틸렌다이아민(pentamethylenediamine), 디옥사도데칸다이아민(4,9-dioxadodecane-1,12-diamine), 페닐렌다이아민(1,3-phenylenediamine), 톨루엔다이아민(2,4- and 2,6-toluenediamine), 다이아미노페닐메탄(4,4'-diaminodiphenylmethane), 에틸렌트리아민(ethylenetriamine), 벤젠트리아민(1,3,5-benzenetriamine), 트리아미노톨루엔(2,4,6-triaminotoluene) 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있는데, 상기 폴리아민의 농도는 1-15 중량%가 바람직하다.
상기 단계 2)에서 제조된 단편화된 나노섬유는 입자 길이가 10 내지 80 μm인 것이 바람직하다.
상기 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유는 단편화된 나노섬유에 방사선을 조사하여 아크릴산을 접합한 후, 세포부착 리간드를 결합시키는 것이 바람직하다.
상기 방사선은 감마선(γ-ray), 전자빔(electron-beam) 또는 이온빔(ion-beam)인 것이 바람직하며, 감마선인 것이 더욱 바람직하며, 상기 방사선 조사량은 1 내지 10 kGy인 것이 바람직하다.
상기 하이드로젤은 줄기세포를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하며, 상기 줄기세포는 골수, 근육 또는 지방 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조직공학용 지지체는 세포의 배양 또는 조직 재생에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 전기방사 방식(electrospinning method)을 사용하여 PLLA 나노섬유의 망을 제조하였으며 전기방사 망을 작은 단편(5 × 5 mm)으로 절단하여, 이를 10 중량 %의 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine, HMDA)을 녹인 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, IPA)에 넣고 아미노 분해 반응시킨 후 형태를 관찰하였다. 그 결과, 제조된 섬유상 입자 길이는 약 10 내지 80 μm(평균 길이: 28.9 ± 6.6 μm)로 다양하였다(도 2 참조).
또한 본 발명자들은 제조한 섬유상 입자들에 AAc를 코발트 60(cobalt 60)과 함께 방사선 조사하여 접합시키기 위해 1 내지 10 kGy로 감마선 방사 조사하였으며 섬유상 입자의 카르복실기(carboxyl group) 함량을 측정하기 위해, 톨루딘 블루 O(toluidine blue O, TBO) 염색을 수행하였다. 그 결과, 섬유상 입자상의 카르복실기의 양은 접합 조건에 따라 0.3 내지 490 nmol/mg로 다양하게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, ATR-FTIR 스펙트럼으로 확인한 결과 카르복실기로부터의 C=O 가지(stretch) 신호가 AAc 양이 증가함에 따라 증가하는 것을 나타내는 1704 cm-1의 위치의 새로운 피크를 확인하였다(도 3a 및 b 참조).
또한, 본 발명자들은 AAc가 접합된 섬유상 입자들에 RGD 펩티드를 결합시키기 위해 10 중량 %의 AAc로 5 kGy의 방사 조사한 AAc가 접합된 섬유상 입자들에 EDC 반응 후 0.1 내지 5 mM의 RGD 펩티드(CGGGRGDS, Anygen, Jangseong, Korea) 용액(10 mM sodium bicarbonate buffer, pH 8.3)에서 12시간 동안 부드럽게 혼합하면서 침지시켰다. 그 결과, 섬유상 입자에 고정된 RGD의 양은 0.1, 1, 및 5 mM의 RGD 용액을 공급했을 때 각각 7.2±3.7, 49.5±7.4 및 177.2±18.9 nmol/mg인 것을 확인하였다(도 3c 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 섬유상 입자를 하이드로젤에 도입하여 하이브리드 하이드로젤을 제조하기 위해 2 또는 8 mg/ml의 섬유상 입자들과 혼합된 2 중량 %의 알지네이트 용액을 주사기에 채우고 21 중량 %의 황산 칼슘(CaSO4) 슬러리와 1:0.04의 비율로 신속하게 혼합하였다. 그 결과, 하이브리드 하이드로젤(오른쪽)은 불투명한 반면, 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤(왼쪽)은 투명하여 바닥의 글자를 읽을 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 하이브리드 하이드로젤 내의 섬유상 입자의 분포는 균질하다는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 섬유상 입자의 혼합 전과 후의 하이드로젤의 기계적 특성을 확인하기 위해, 상기 제조한 하이브리드 하이드로젤의 복소 탄성률(complex modulus)을 분석하였다. 그 결과, 알지네이트 하이드로젤은 10 kPa 근처의 탄성률을 나타내었고, 상기 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/mL의 섬유상 입자를 포함한 하이브리드 하이드로젤(A-FP2) 및 8 mg/mL의 섬유상 입자를 포함한 하이브리드 하이드로젤(A-FP8)에서 각각 18.4±2.2 및 43.4 ± 7.8 kPa의 탄성률을 나타냄으로써 탄성률이 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 하이브리드 하이드로젤에 혼합된 섬유상 입자의 생물학적 기능을 찾기 위해 봉입된 인간 중간엽 줄기세포의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 죽은 세포는 알지네이트 하이드로젤 내에서 자주 관찰되었으나, A-FP2에서는 죽은 세포의 수가 감소하였으며, A-FP8에서는 죽은 세포의 수가 더 감소하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 하이드로젤 내에서 hMSC의 부착을 확인하기 위해 면역 염색을 하였다. 그 결과, 알지네이트 하이드로젤에서의 세포들은 여전히 둥근 모양을 나타내었으며, 하이브리드 하이드로젤에서 3차원적으로 퍼져있는 세포 형상을 공초점레이저 주사현미경으로 확인하였으며(도 7a 참조), A-FP8 하이드로젤 내에서 섬유상 입자와 결합하여 퍼짐성을 갖는 세포의 분포를 확인하였다(도 7b 참조). 또한, 본 발명자들은 hMSC의 길고 짧은 축(axis)을 측정하면서 퍼져있는 세포의 종횡비(aspect ratio)를 계산하였으며 섬유상 입자가 포함되지 않은 하이드로젤 내에서 봉입된 세포들의 종횡비는 1.1±0.1로 나타났으며, 이것은 A-FP2 및 A-FP8에서 각각 1.9±0.2 및 2.2±0.4로 증가하는 것을 확인하였다(도 7c 참조).
또한, 본 발명자들은 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 hMSC의 골 세포 분화 및 석회화을 확인하기 위하여 ALP(alkaline phosphatase) 활성 분석 및 알리자린 레드 S 염색법(Alizarin Red S staining)을 사용하여 실시하였으며, 그 결과, ALP의 활성은 A-FP2 및 A-FP8 하이드로젤에서 10.1±0.2 및 15.7±1.2 nmol/min/mg(단백질)이었으며, 이것은 분화 유도 14일 후의 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤 내에서의 활성 결과인 6.2±0.7 nmol/min/mg(단백질)보다 약 1.7 및 2.5배 높은 것을 확인하였다(도 8a 참조).
또한, 골 세포 분화 유도 14일 이후에 A-FP8 하이드로젤에서 알리자린 레드 양성 세포가 관찰된 반면, 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤에서 A-FP8보다 적게 염색된 세포를 확인하였다(도 8b 참조).
이에, 본 발명의 하이드로젤에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체는 알지네이트 하이드로젤 내에서 RGD 펩티드가 결합된 PLLA(poly L-lactide) 섬유상 입자는 세포 고정 사이트를 제공함으로써 3차원 공간에서 줄기세포의 생존률을 유의적으로 증가시키고 골 세포의 분화 및 석회화를 증가시키는 것을 확인함으로써, 상기 지지체를 줄기세포의 배양 또는 골세포 분화용 조직공학적 지지체로 유용하게 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
조직공학(Tissue engineering) 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것을 말하며, 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 본 발명의 생체접착성 하이드로젤은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체(scaffold)를 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 부착될 수 있다. 또한, 상기 생리활성물질은 천연 세포외 기질과 유사하게 유사한 구조의 인공 세포외 기질을 구현하기 위하여 포함될 수 있는 각종 생체분자들을 총칭하기도 한다. 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함하며, 일 예로 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 세포를 들 수 있다. 상기 세포는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포(osteoblast), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한 본 발명은,
1) 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 가용용매에 용해시킨 후 전기방사하여 나노섬유 망(nanofibrous meshes)을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 나노섬유 망을 화학적 분해 반응으로 단편화시키는 단계;
3) 상기 단편화된 나노섬유에 방사선을 조사하여 아크릴산을 접합한 후 세포부착 리간드를 결합시키는 단계; 및
4) 상기 세포부착 리간드와 결합된 단편화된 나노섬유를 생체 적합성 고분자에 혼합하여 하이드로젤화 시키는 단계를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 4)의 생체 적합성 고분자는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴, 키토산 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 알지네이트인 것이 더욱 바람직하다.
상기 단계 4)의 생체 적합성 고분자에 중간엽 줄기세포를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
이에, 본 발명의 하이드로젤에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체는 알지네이트 하이드로젤 내에서 RGD 펩티드가 결합된 PLLA(poly L-lactide) 섬유상 입자는 세포 고정 사이트를 제공함으로써 3차원 공간에서 줄기세포의 생존률을 유의적으로 증가시키고 골 세포의 분화 및 석회화를 증가시키는 것을 확인함으로써, 상기 지지체를 줄기세포의 배양 또는 골세포 분화용 조직공학적 지지체로 유용하게 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 나노섬유 망( meshes )의 단편화( Fragmentation )를 통한 섬유상 입자( fibrous particles , FP ) 제조
이전 연구에서 전단 응력(shear-stress)하에서 층상 결정 도메인(lamellar crystalline domains) 사이의 비결정영역(amorphous region)의 쉬운 파괴로 인해 다양한 주기적 길이(평균 길이: 1.2 - 13.8 μm)를 가지는 PLLA 망의 아미노분해(aminolysis)가 공지되었다(12).
<1-1> 전기방사 나노섬유( electrospun nanofibrous ) 망의 제작
본 발명에서 섬유상 입자 제조를 위해 전기방사 방식(electrospinning method)을 사용하여 PLLA 나노섬유의 망을 제조하였다.
구체적으로, PLLA(poly L-lactide) 3 중량 %를 디클로로메탄(dichloromethane) 및 트리플루오로에탄올(trifluoroethanol) 혼합물(80:20, v/v)에 용해시킨 후, 10 ml의 용액을 23 게이지 블런트형(blunt)의 바늘을 가진 주사기에 채웠다. 상기 주사기를 주사기 펌프(KD Scientific single-syringe infusion pump, Holliston, MA, USA)에 넣고 고전압 전원(NanoNC, Seoul, Korea)에서 17 kV로 콜렉터(collector)에 주입하였다. 상기 용액의 유속 및 방사 시간은 각각 1 ml/h 및 10시간으로 설정하였다. 방사 공정이 끝나고, 상기 전기방사 망은 실온에서 6시간 동안 건조시킨 후, 40℃에서 밤새(overnight) 두었다.
<1-2> 나노섬유 망의 단편화( fragmentation )
상기 실시예 <1-1>에서 제조된 전기방사 망을 작은 단편(5 × 5 mm)으로 절단하였으며, 이를 10 중량 %의 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine, HMDA)을 녹인 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, IPA)에 넣고 37℃의 진탕배양기(SI-600R, Jeio Tech, Korea)에서 30분 동안 200 rpm으로 강하게 혼합하여 단편화시켰다. 이후에 4,000 rpm으로 원심분리(Combi-514R, Hanil Science, Korea)하여 회수하였고 이소프로필알콜 및 증류수로 강하게 3회 세척을 반복하였다. 이로부터 24시간 동안 동결 건조한 입자들을 얻었으며, 주사전자현미경(SEM, JSM-6300, JEOL, Japan)을 이용하여 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 PLLA 망의 현미경 사진 및 이미지를 나타내었으며(도 2a 및 2b), 전기방사 망은 아미노분해 동안 막대 형상 입자로 단편화되었으며, 분말 형태의 섬유상 입자(fibrous particles, FP)를 얻었다(도 2c 및 2d). 또한, 상기 섬유상 입자를 70% 에탄올에 습윤시킨 후, 증류수로 분산시켜 불투명한 용액으로 나타나는 것을 확인하였으며(도 2e), 용액 내에서 균질하게 위치하는 것을 확인하였다(도 2f). 제조된 섬유상 입자 길이는 약 10 내지 80 μm(평균 길이: 28.9 ± 6.6 μm)로 다양했으며, 상대적으로 짧은 아미노분해 시간으로 인해 섬유의 직경(diameter)은 거의 본래 섬유 직경을 유지하였다.
< 실시예 2> AAc ( acrylic acid ) 접합( grafting ) 및 RGD 펩티드 결합 된 섬유상 입자의 제조
도 1에 나타낸 바와 같이, 아미노분해(aminolysis)는 아민 및 수산기(hydroxyl groups)를 섬유상 입자에 부여하며, 추가적으로 감마선 조사를 이용하여 AAc를 접합함으로써 카르복실기(carboxyl groups)를 도입한다. 감마선(γ-ray), 전자빔(electron-beam), 및 이온빔(ion-beam)과 같은 방사선을 이용한 재료의 개질(modification)은 재료의 성질을 변형시키기 위해 널리 사용되었다(14, 15, 16). 이러한 방식은 자유 라디칼(free radical) 형성 및 높은 투과력 때문에 작용기(functional group)의 도입이 가능하며 재료의 분자량을 조절하는데 있어서 효과적이다(17). 또한, 감마선에 의한 AAc 접합의 정도는 재료에 따라 정확하게 제어되며, 생체 분자의 결합은 세포의 동작을 조절할 수 있다(18, 19).
수용체 또는 인테그린 매개(integrins-mediated) 신호에 의한 세포의 생물학적 반응을 유도하는 여러가지 생체 분자가 있으며, 특히 RGD 펩티드는 기질에서의 세포의 부착 및 퍼짐성을 조절하며, 증식 및 분화와 같은 장시간의 세포 반응도 제어한다(21, 22, 23).
<2-1> 감마선 조사에 의한 아크릴산( AAc ) 접합 확인
상기 <실시예 1>에서 제조한 섬유상 입자들에 AAc를 코발트 60(cobalt 60)과 함께 방사선 조사하여 접합시키기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 미리 적셔놓은 상기 섬유상 입자들을 0.01 M의 모어염(Mohr’s salts)과 함께 1, 3 및 5 중량 %의 농도의 아크릴산(AAc) 용액 10 ml에 분산시키고, 주위온도(ambient temperature)에서 1 내지 10 kGy로 방사 조사하였다. 미반응 단량체(unreacted monomers) 및 단독중합체(homopolymers)는 12시간 동안 많은 증류수로 교반하여 씻겨버리고, AAc로 접합된 섬유상 입자 분말을 동결 건조하였다. 섬유상 입자에 카르복실기(carboxyl group) 함량을 측정하기 위해, 톨루딘 블루 O(toluidine blue O, TBO) 염색(0.1 M HCl, 20 mg NaCl, 및 4 mg toluidine blue O chloride)을 4시간 동안 수행하였다. 상기 TBO 염색이 된 섬유상 입자들은 완전 탈색이 될 때까지 0.1 M NaOH 및 에탄올 용액(1 : 4, v/v)과 함께 현탁시켰으며, TBO의 흡수량은 플레이트 리더기(Powerwave XS, Biotek, VT, USA)를 이용하여 530 nm의 흡광도에서 정량하였다. 표준 검량선은 공지된 TBO 농도를 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 TBO는 강한 혼합을 통해 AAc가 접합된 섬유상 입자와 결합하였으며, 상기 섬유상 입자상의 카르복실기의 양은 접합 조건에 따라 0.3 내지 490 nmol/mg로 다양하게 나타나는 것을 확인하였다(도 3a). 또한, ATR-FTIR 스펙트럼으로 확인한 결과 카르복실기로부터의 C=O 가지(stretch) 신호가 AAc 양이 증가함에 따라 증가하는 것을 나타내는 1704 cm-1의 위치의 새로운 피크를 확인하였다(도 3b).
<2-2> RGD ( Arg - Gly - Asp ) 펩티드 결합 및 정량
상기 실시예 <2-1>에서 제조한 AAc가 접합된 섬유상 입자들에 RGD 펩티드를 결합시키기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 10 중량 %의 AAc로 5 kGy의 방사 조사한 AAc가 접합된 섬유상 입자들을 MES버퍼(pH 5.3)에서 30분 동안 EDC/NHS와 함께 넣어 카르복실기를 활성화시켰으며, 0.1 내지 5 mM의 RGD 펩티드(CGGGRGDS, Anygen, Jangseong, Korea) 용액(10 mM sodium bicarbonate buffer, pH 8.3)에서 12시간 동안 부드럽게 혼합하면서 침지시켰다. 그 후에, 상기 섬유상 입자들을 증류수로 3회 세척하고 섬유상 입자 분말에 부착된 RGD 펩티드를 수득하기 위해 12시간 동안 동결 건조하였다. 결합한 펩티드의 정량 분석은 플루오레스카민 분석법(fluorescamine assay)을 사용하였다. 플루오레스카민 용액(4 mg/mL, 아세톤)을 0.25 M 보레이트 버퍼(borate buffer, pH 9)에 1:9의 비율로 혼합하고, 상기 용액을 남은 세정 용액과 25:75의 비율로 혼합하였다. 상기 혼합물을 60초 동안 강하게 섞은 후, 샘플의 형광은 형광 마이크로 플레이트 리더(Spectra Max M2e, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 390 nm의 여기(excitation) 파장 및 475 nm의 방출 파장에서 측정하였다. 표준 검량선은 공지된 RGD 펩티드 용액의 농도를 이용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 섬유상 입자에 고정된 RGD의 양은 0.1, 1, 및 5 mM의 RGD 용액을 공급했을 때 각각 7.2±3.7, 49.5±7.4 및 177.2±18.9 nmol/mg인 것을 확인하였다(도 3c).
< 실시예 3> 섬유상 입자 및 줄기세포를 도입시킨 하이브리드 하이드로젤( hybrid hydrogels)의 제조
<3-1> 섬유상 입자의 하이드로젤 내 도입
상기 <실시예 2>에서 제조한 섬유상 입자를 하이드로젤에 도입하여 하이브리드 하이드로젤을 제조하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 2 또는 8 mg/ml의 섬유상 입자들과 혼합된 2 중량 %의 알지네이트 용액을 주사기에 채우고 21 중량 %의 황산 칼슘(CaSO4) 슬러리와 1:0.04의 비율(알지네이트:CaSO4)로 신속하게 혼합하였다. 상기 혼합액의 젤 화(gelation behavior)를 20분 동안 0.5 Hz에서 단일 주파수 모드로 모니터링 하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 제조한 하이브리드 하이드로젤(오른쪽)은 불투명한 반면, 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤(왼쪽)은 투명하여 바닥의 글자를 읽을 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 하이브리드 하이드로젤 내의 섬유상 입자의 분포는 균질하다는 것을 확인하였다(도 4).
<3-2> 줄기세포가 봉입된 하이브리드 알지네이트 하이드로젤 디스크( disk )의 제조
상기 <실시예 2>에서 제조한 섬유상 입자가 도입된 하이브리드 하이드로젤에 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells; hMSC)를 봉입하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 섬유상 입자와 세포가 현탁된 용액(2 × 106 세포/mL)을 얻기 위해 hMSC(CC-2519,Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland)를 균일하게 재혼합하였으며 상기 실시예 <3-1>과 같이 가교 결합시켰다. 혼합한 용액을 멸균된 유리 챔버(55 × 25 × 4 mm)에 넣고, 디스크 직경 8 mm로 펀칭하였다. 하이드로젤 디스크는 37℃에서 5% 이하의 CO2 환경에서 배양하였으며, 배지는 이틀마다 바꾸어 주었다.
< 실시예 4> 하이브리드 하이드로젤의 유동학적 분석( rheological analysis )
가교의 정도 또는 기계적 특성은 하이드로젤 내로 봉입된 줄기세포의 운명을 조절하는 결정적 요인 중 하나이다. 예를 들어, 다양한 탄성률(elastic modulus)과 함께 알지네이트 하이드로젤에서 기능하는 RGD 펩티드는 상이한 유전자 발현을 제공하며(24), 효소 매개로 가교 결합한 젤라틴-PEG-티라민(tyramine) 하이드로젤 또한 가교 결합 정도에 따라 변형된 세포 생존률을 보여준다(25). 이것은 봉입된 세포가 세포 표면 수용체 및 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질 간의 상호작용 및 주변 환경의 강도(rigidity)을 감지할 수 있음을 알 수 있으며, 합성된 하이드로젤 내에서 가교 결합의 정도를 조절함으로써 쉽게 제어될 수 있다는 것이 예상된다.
섬유상 입자의 혼합 전과 후의 하이드로젤의 기계적 특성을 확인하기 위해, 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 하이브리드 하이드로젤의 복소 탄성률(complex modulus)을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 하이브리드 하이드로젤 용액을 신속하게 플레이트에 옮기고 콘(cone) 및 플레이트 고정구(20 mm 직경 플레이트 및 48 콘 앵글)가 장착된 레오미터(rheometer; ARES, TA instrument, DE, USA)를 사용하여 복소 탄성률을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CaSO4와 가교 결합한 알지네이트 하이드로젤은 10 kPa 근처의 탄성률을 나타내었고, 상기 알지네이트 하이드로젤에 2 mg/mL의 섬유상 입자를 포함한 하이브리드 하이드로젤(A-FP2) 및 8 mg/mL의 섬유상 입자를 포함한 하이브리드 하이드로젤(A-FP8)에서 각각 18.4±2.2 및 43.4 ± 7.8 kPa의 탄성률을 나타냄으로써 탄성률이 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 5). 알지네이트 하이드로젤의 기계적 특성은 가교 결합제의 농도 또는 시간에 의해 조절되며 이는 다양한 범위의 기계적 특성을 나타낸다(24, 31). 또한, 하이드로젤 탄성률의 증가는 하이드로젤의 기계적 특성을 크게 향상시키는 일정한 가교 결합 상태를 유지시키는 첨가제에 의해 조절된다는 것이 기 보고되었다(27, 32). 따라서, 하이브리드 하이드로젤의 탄성률 개선은 섬유상 입자에 의한 영향이라고 판단할 수 있으며, PLLA 기반의 섬유상 입자의 본래 강도는 섬유상 입자의 농도에 따라 하이드로젤 본질적인 특성을 변화시키는 것처럼 보인다.
본 발명에서는 가교 결합 레벨을 제어하는 것 외에, 일반적인 가교 결합 환경하에서 하이드로젤 내의 세포와 섬유상 입자가 서로 상호작용하게 함으로써 3차원 공간에 주입된 hMSC의 반응을 개선할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 5> 하이브리드 하이드로젤 내에서 줄기세포의 생존률 확인
하이드로젤에 혼합된 섬유상 입자의 생물학적 기능을 찾기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-2>와 같이 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells; hMSC)를 하이드로젤에 봉입하였고 7일 동안 배양하였다. 배양 3일 후, 봉입된 세포의 생존률을 측정하기 위해 Live/Dead 분석을 실시하였으며 이를 형광 이미지로 나타내었고, SEM(scanning electron microscopy)으로 봉입된 세포를 관찰하였다. 또한, 세포의 생존 능력을 구체적으로 측정하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석을 하였다. 상기 MTT 용액(4 mg/ml)과 배지의 비율이 9:1이 되도록 섞은 후 37℃에서 120분 동안 배양하였으며 배양 후, 자주색 포르마잔을 DMSO에 녹이고 마이크로플리에트 리더기(Powerwave XS, Biotek, USA)를 사용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 붉은 색으로 염색된 죽은 세포는 알지네이트 하이드로젤 내에서 자주 관찰되었으나, A-FP2에서는 죽은 세포의 수가 감소하였으며, A-FP8에서는 죽은 세포의 수가 더 감소하였다(도 6a). 이는 세포 및 섬유상 입자의 상호관계가 물리적 세포 결합 지지체를 제공함으로써 하이드로젤 내에서 세포의 생존률을 개선시킬 수 있는 것을 나타낸다. 또한, SEM으로 봉입된 세포를 관찰한 결과 섬유상 입자는 표면 전체에 균일하게 분포되었으며, 섬유상 입자의 양이 증가할수록 그 밀도가 명확하게 증가되었다. 또한, 본 발명자들은 섬유상 입자 표면에 부착된 세포를 찾아내었으며, 섬유상 입자와의 결합에 의해 3차원 공간에서 부착된 세포 형태를 찾을 것으로 예상했음에도 불구하고 그러한 형태는 찾지 못하였고, 섬유상 입자에 결합하는 모든 세포들은 퍼짐성이 없는 원형 모양을 나타내었다(도 6b).
또한, 알지네이트 하이드로젤에서의 세포 생존률은 7일간 유지되었으며 과잉 증식은 관찰되지 않았으나, A-FP2 및 A-FP8 하이드로젤은 봉입된 세포의 생존률은 개선되었으며 알지네이트 하이드로젤에서 생존률의 두 배 이상인 것을 확인하였다(도 6c). 혼합되는 섬유상 입자의 양 또한 세포의 생존률을 조절하며, 섬유상 입자의 높은 함유량(A-FP8)은 적은 양을 함유하는 하이드로젤(A-FP2)에 비해서 4일 차에서 세포 생존을 크게 증가시키는 것을 확인하였다. 7일이 지난 후, A-FP8 하이드로젤에서의 세포 생존률은 A-FP2 하이드로젤에서의 세포 생존률이 A-FP8의 수준과 비슷하게 증가하여 최대치에 도달할 때까지에도 높은 세포 생존률을 유지하는 것을 확인하였다(도 6c). 하이브리드 하이드로젤의 높은 탄성률에도 불구하고, 하이브리드 하이드로젤 내에서 혼합된 섬유상 입자는 섬유상 입자와 세포가 결합함으로써 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤에서 보다 오랜 시간 동안 세포 생존률을 도울 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 하이드로젤 내에서 3차원 공간에 주입된 hMSC의 생존률을 상향 조절하는데 있어 혼합된 섬유상 입자들과 세포와의 특이적인 상호작용이 있음을 확인하였다.
< 실시예 6> 하이드로젤 내에서 인간 중간엽 줄기세포의 3차원적 퍼짐 확인
본 발명자들은 하이드로젤 내에서 hMSC의 퍼짐에 있어 섬유상 입자들의 효과를 분석하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 3차원 공간의 하이드로젤 내에서 hMSC의 퍼짐을 확인하기 위해 상기 <실시예 5>와 같이 MTT 분석을 하였으며, 면역 염색을 위해 상기 실시예 <3-2>와 같이 배양 3일 차 세포들을 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하여 20분 동안 고정시켰고 4℃에서 20분 동안 세포골격(cytoskeletal) 버퍼용액(10.3 g sucrose, 0.292 g NaCl, 0.06 g MgCl2, 0.476 g HEPES buffer, 0.5 mL Triton X-100, in 100 mL water, pH 7.2)으로 삼투시킨 후 5% BSA와 함께 PBS에서 90분 동안 37℃에서 블러킹하였다. 고정된 세포들은 37℃에서 90분 동안 항 팍실린(1 : 100, BD science, NJ, USA)과 함께 배양하였고 순차적으로 1 : 50 Alexa fluor 488 rabbit anti-mouse IgG, 1 : 100 rhodamine-phalloidin, 및 1 : 5000 Hoechst 33258를 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 이후 증류수로 세척한 후, 상기 샘플들을 유리 슬라이드에 Vectashield mounting medium(Vector Laboratory, UK)과 함께 장착하였다. 면역 형광 이미지는 형광현미경(TE2000, Nikon, Japan) 및 공초점레이저 주사 현미경(TCS SP-5, Leica, Germany)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 알지네이트 하이드로젤에서의 세포들은 여전히 둥근 모양을 나타내었으며, 하이브리드 하이드로젤에서 3차원 공간에서 퍼져있는 세포 형상을 공초점레이저 주사현미경으로 확인하였으며(도 7a), A-FP8 하이드로젤 내에서 3차원 공간에서 퍼져있는 세포의 분포를 확인하였다(도 7b). 이는 세포와 섬유상 입자들의 결합에 의해 영향을 받는 것으로 판단되었다.
또한, 본 발명자들은 hMSC의 길고 짧은 축(axis)을 측정하면서 퍼져있는 세포의 종횡비(aspect ratio)를 계산하였다. 섬유상 입자가 포함되지 않은 하이드로젤 내에서 봉입된 세포들의 종횡비는 1.1±0.1로 나타났으며, 이것은 A-FP2 및 A-FP8에서 각각 1.9±0.2 및 2.2±0.4로 증가하는 것을 확인하였다(도 7c). 본 발명의 하이브리드 하이드로젤 시스템은 세포 부착 및 퍼짐을 조절하기 위한 인공적인 구조체가 될 수 있는 섬유상 입자 및 RGD 모티프(motifs)를 가진 세포 고정 사이트(cell anchorage sites)를 제공하였다. 따라서, 세포와 섬유상 입자간의 결합은 3차원 하이드로젤 내에 주입된 hMSC의 생존률을 향상시킬 수 있다.
< 실시예 7> 골 세포의 분화( differentiation ) 및 석회화( mineralization ) 확인
본 발명자들은 RGD가 부착된 섬유형 입자가 하이드로젤 내에 주입된 hMSC의 3차원 공간에서의 부착 및 증식을 향상시키는 것을 확인하였기 때문에, 세포 분화에 있어서 RGD로 기능화된 섬유상 입자의 영향을 조사하는 실험을 진행하였다. 이전 연구에서, 나노섬유 망 또는 RGD로 기능화된 알지네이트 하이드로젤이 hMSC의 골 세포 분화 및 석회화을 촉진한다고 보고되었다(19, 35). 그러나 본 발명자들은 본 발명의 하이브리드 시스템은 생물학적(RGD 모티프) 및 구조적(나노섬유 구조) 신호를 동시에 제공할 수 있기 때문에 골 세포 분화가 더욱 개선될 수 있다고 예상하였다.
본 발명의 하이브리드 하이드로젤에 봉입된 hMSC의 골 세포 분화 및 석회화을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.
구체적으로, ALP(alkaline phosphatase) 활성 분석 및 석회화 실험을 위해 상기 실시예 <3-2>와 같이 제조한 샘플들을 2.84 × 10-4 M L-ascorbic acid 및 1 × 10-2 M β-glycerol-phosphate가 포함된 골 세포 분화 배지에서 14일 동안 배양하였다. 하이드로젤을 균질화(T10 basic, IKA, Germany)한 후에 방사선 면역침전 분석(radio immunoprecipitation assay, RIPA) 용해 버퍼(150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM Tris, pH 7.2, 및 protease inhibitors)로 용해된 hMSC의 세포 용해물(lysates)은 ALP 용액에서 37℃에서 30분 동안 ELISA(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 반응시켰다. 그 후, 405 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 광학밀도(optical density)를 측정하였다. 파라니트로포스페이드(paranitrophenyl phosphate, 0 내지 600 μg/mL)의 공지된 농도의 강도를 표준 곡선으로 측정하고, 각 샘플의 총 단백질 함량은 마이크로 BCA 분석(Thermo Scientific, IL, USA)을 사용하여 정량하였다. 또한, 석회화의 평가는 알리자린 레드 S 염색법(Alizarin Red S staining)을 사용하여 실시하였으며, 상기 세포 용해물을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 상온에서 5분 동안 2%의 알리자린 레드(Alizarin Red S) 용액으로 염색하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 세포 분화의 중간 단계(intermediate stage)에서 골 세포 분화 마커 중 하나인 알칼라인 포스파다아제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성은 A-FP2 및 A-FP8 하이드로젤에서 10.1±0.2 및 15.7±1.2 nmol/min/mg(단백질)이었으며, 이것은 분화 유도 14일 후의 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤 내에서의 활성 결과인 6.2±0.7 nmol/min/mg(단백질)보다 약 1.7 및 2.5배 높은 것을 확인하였다(도 8a). 본 발명의 섬유상 입자 도입이라는 구조적 변형 및 증가된 기계적 특성은 줄기세포에게 안정적인 세포 분화 환경을 제공하는 것으로 판단된다.
또한, 골 세포 분화 유도 14일 이후에 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤 및 A-FP8 하이드로젤 내에서 세포를 관찰하였다. ALP 활성 결과와 비슷하게 A-FP8 하이드로젤에서 알리자린 레드 양성 세포가 관찰된 반면, 섬유상 입자가 포함되지 않은 알지네이트 하이드로젤에서 A-FP8보다 적게 염색된 세포를 확인하였다(도 8b). 본 발명의 하이브리드 하이드로젤은 골 분화 유도 환경에서 알지네이트 하이드로젤보다 3차원 공간에 주입된 세포의 분화 및 석회화를 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
현재 사용되는 세포 전달을 위한 지지체로써의 하이드로젤은 본래의 세포 외 기질(ECM)의 특성을 모방하는데 있어서 세포 결합 모티프의 부재 및 구조적 차이의 근본적인 역할 제공이 부족했었다. 하이드로젤 지지체의 차세대 재료로써, 섬유상 입자를 가지는 하이브리드 하이드로젤 시스템은 재료(materials)의 일반적인 속성 유지뿐만 아니라 세포 반응성 향상을 위한 부가적인 기능의 제공을 가능하게 할 수 있다. 또한, 이것은 알지네이트 시스템에만 적용되지 않으며, 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴, 및 PEG 하이드로젤과 같은 다양한 하이드로젤에 적용 가능하기 때문에 조직 공학 응용(tissue engineering application)에 있어서 새로운 하이드로젤 시스템에 이용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 하이드로젤(hydrogel)에 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴, 키토산 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제조된 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 세포부착 리간드는 서열번호 1로 기재되는 RGD(Arg Gly Asp) 펩타이드인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 지지체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단편화된 나노섬유는
    1) 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 가용용매에 용해시킨 후 전기방사하여 나노섬유 망(nanofibrous meshes)을 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 나노섬유 망을 화학적 분해 반응으로 단편화시키는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 세포부착 리간드가 결합된 단편화된 나노섬유는 단편화된 나노섬유에 방사선을 조사하여 아크릴산을 접합한 후, 세포부착 리간드를 결합시키는 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 방사선 조사량은 1 내지 10 kGy인 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 줄기세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조직공학용 지지체는 세포의 배양 또는 조직 재생에 사용되는 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체.
  9. 1) 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 가용용매에 용해시킨 후 전기방사하여 나노섬유 망(nanofibrous meshes)을 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 나노섬유 망을 화학적 분해 반응으로 단편화시키는 단계;
    3) 상기 단편화된 나노섬유에 방사선을 조사하여 아크릴산을 접합한 후 세포부착 리간드를 결합시키는 단계; 및
    4) 상기 세포부착 리간드와 결합된 단편화된 나노섬유를 생체 적합성 고분자에 혼합하여 하이드로젤화 시키는 단계를 포함하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단계 4)의 생체 적합성 고분자는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 젤라틴, 키토산 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 제조 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 단계 4)의 생체 적합성 고분자에 중간엽 줄기세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직공학용 하이드로젤 지지체 제조 방법.
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105921746A (zh) * 2016-05-26 2016-09-07 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种基于弹性形变的钛金属增强块及其构建方法
WO2018185671A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Silk Biomaterials S.R.L. Nanofibers comprising fibroin as well as system comprising hydrogel and said nanofibers
RU2708396C1 (ru) * 2018-12-19 2019-12-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук Биосовместимый биоразлагаемый остеокондуктивный полимерный композиционный материал для регенерации костной ткани
KR20200056968A (ko) * 2020-05-15 2020-05-25 연세대학교 산학협력단 주사 가능한 3차원 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조방법
WO2020197323A1 (ko) * 2019-03-28 2020-10-01 연세대학교 산학협력단 마이크로채널 네트워크가 형성된 하이드로젤 구조체
KR20200117206A (ko) * 2019-04-03 2020-10-14 연세대학교 산학협력단 염증성 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 안내렌즈형 센서
KR20200131054A (ko) * 2019-05-13 2020-11-23 연세대학교 산학협력단 주사 가능한 나노섬유-하이드로젤 복합 입자 및 그 제조방법
CN113384753A (zh) * 2021-03-19 2021-09-14 杭州协合医疗用品有限公司 一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用
CN114404394A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 西安交通大学 一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法
CN115120776A (zh) * 2021-03-24 2022-09-30 苏州博创同康生物工程有限公司 一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11602581B2 (en) 2017-09-27 2023-03-14 Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Cell-encapsulated hydrogel block preparation for 3D bioprinting-based tissue engineering and macrostructure assembly technology thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080110274A (ko) * 2007-06-15 2008-12-18 서울산업대학교 산학협력단 불포화 생물분자를 이용한 키토산 하이드로젤과 이의제조방법
KR20090038693A (ko) * 2007-10-16 2009-04-21 한국과학기술원 생분해성 고분자 나노실린더 및 그의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080110274A (ko) * 2007-06-15 2008-12-18 서울산업대학교 산학협력단 불포화 생물분자를 이용한 키토산 하이드로젤과 이의제조방법
KR20090038693A (ko) * 2007-10-16 2009-04-21 한국과학기술원 생분해성 고분자 나노실린더 및 그의 제조방법

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Banerjee, M. Arha, S. Choudhary, R. S. Ashton, S. R. Bhatia, D. V. Schaffer and R. S. Kane, Biomaterials, 2009, 30, 4695-4699.
A. Schulze, M. F. Maitz, R. Zimmermann, B. Marquardt, M. Fischer, C. Werner, M. Went and I. Thomas, RSC Advances, 2013, 3, 22518-22526.
C. K. Kuo and P. X. Ma, Biomaterials, 2001, 22, 511-521.
Deelder, O. Guven, H. Ha, E.-S. Hegazy, A. S. Hoffman, I. Kaetsu, R. O. Mazzei, Z. Nurkeeva, M. T. Razzak, J. M. Rosiak, A. Safrany and M. Sen, Radiation Synthesis and Modification of Polymers for Biomedical Applications, IAEA TECDOC-1324, 2003.
E. Alsberg, K. W. Anderson, A. Albeiruti, R. T. Franceschi and D. J. Mooney, J. Dent. Res., 2001, 80, 2025-2029.
E. R. West, M. Xu, T. K. Woodruff and L. D. Shea, Biomaterials, 2007, 28, 4439-4448.
F. Topuz, A. Henke, W. Richtering and J. Groll, Soft Matter, 2012, 8, 4877-4881.
H. Fernandes, L. Moroni, C. van Blitterswijk and J. de Boer, J. Mater. Chem., 2009, 19, 5474-5484.
H. J. Lee, J.-S. Lee, T. Chansakul, C. Yu, J. H. Elisseeff and S. M. Yu, Biomaterials, 2006, 27, 5268-5276.
H. Park, S.-W. Kang, B.-S. Kim, D. J. Mooney and K. Y. Lee, Macromol. Biosci., 2009, 9, 895-901.
H. Zimmermann, F. Wahlisch, C. Baier, M. Westhoff, R. Reuss, D. Zimmermann, M. Behringer, F. Ehrhart, A. Katsen-Globa, C. Giese, U. Marx, V. L. Sukhorukov, J. A. Vasquez, P. Jakob, S. G. Shirley and U. Zimmermann, Biomaterials, 2007, 28, 1327-1345.
H.-j. Lee, S.-H. Ahn and G. H. Kim, Chem. Mater., 2011, 24, 881-891.
I.-T. Hwang, M.-Y. Ahn, C.-H. Jung, J.-H. Choi and K. Shin, J. Biomed. Nanotech., 2013, 9, 819-824.
J. Fan, Z. Shi, M. Lian, H. Li and J. Yin, J. Mater. Chem. A, 2013, 1, 7433-7443.
J. L. Drury and D. J. Mooney, Biomaterials, 2003, 24, 4337-4351.
J. Lee and K. Y. Lee, Macromol. Biosci., 2009, 9, 671-676.
J. Tritz, R. Rahouadj, N. de Isla, N. Charif, A. Pinzano, D. Mainard, D. Bensoussan, P. Netter, J.-F. Stoltz, N. Benkirane-Jessel and C. Huselstein, Soft Matter, 2010, 6, 5165-5174.
J.-Y. Sun, X. Zhao, W. R. K. Illeperuma, O. Chaudhuri, K. H. Oh, D. J. Mooney, J. J. Vlassak and Z. Suo, Nature, 2012, 489, 133-136.
JANG, J. et al., COMPOSITES:Part B (2013) Vol.45, pp.1216-1221* *
K. B. Fonseca, F. R. Maia, F. A. Cruz, D. Andrade, M. A. Juliano, P. L. Granja and C. C. Barrias, Soft Matter, 2013, 9, 3283-3292.
K. M. Park, K. S. Ko, Y. K. Joung, H. Shin and K. D. Park, J. Mater. Chem., 2011, 21, 13180-13187.
L. Grøndahl, A. Chandler-Temple and M. Trau, Biomacromolecules, 2005, 6, 2197-2203.
M. Shachar, O. Tsur-Gang, T. Dvir, J. Leor and S. Cohen, Acta Biomater., 2011, 7, 152-162.
N. Huebsch, P. R. Arany, A. S. Mao, D. Shvartsman, O. A. Ali, S. A. Bencherif, J. Rivera-Feliciano and D. J. Mooney, Nat. mater., 2010, 9, 518-526.
S. Duggal, K. B. Frønsdal, K. Szoke, A. Shahdadfar, J. E. Melvik and J. E. Brinchmann, Tissue eng., 2009, 15, 1763-1773.
S. l. J. Bidarra, C. C. Barrias, M. r. A. Barbosa, R. Soares and P. L. Granja, Biomacromolecules, 2010, 11, 1956-1964.
S.-W. Kang, B.-H. Cha, H. Park, K.-S. Park, K. Y. Lee and S.-H. Lee, Macromol. Biosci., 2011, 11, 673-679.
SHIN, Y. M. et al., BIOMACROMOLECULES (2008) Vol.9, pp.1772-1781* *
T. G. Kim and T. G. Park, Macromol. Rapid Commun., 2008, 29, 1231-1236.
T. G. Kim, S.-H. Park, H. J. Chung, D.-Y. Yang and T. G. Park, Adv. Funct. Mater., 2010, 20, 2303-2309.
T. J. Sill and H. A. von Recum, Biomaterials, 2008, 29, 1989-2006.
W. H. Tan and S. Takeuchi, Adv. Mater., 2007, 19, 2696-2701.
X. Ping, M. Wang and G. Xuewu, Rad. Phys. Chem., 2011, 80, 567-572.
Y. B. Lee, Y. M. Shin, J.-h. Lee, I. Jun, J. K. Kang, J.-C. Park and H. Shin, Biomaterials, 2012, 33, 8343-8352.
Y. M. Shin, H. Shin and Y. Lim, Macromol. Res., 2010, 18, 472-481.
Y. M. Shin, I. Jun, Y.-M. Lim, T. Rhim and H. Shin, Macromol. Mater. Eng., 2013, 298, 555-564.
Y. M. Shin, K. S. Kim, Y. M. Lim, Y. C. Nho and H. Shin, Biomacromolecules, 2008, 9, 1772-1781.

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105921746A (zh) * 2016-05-26 2016-09-07 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种基于弹性形变的钛金属增强块及其构建方法
CN105921746B (zh) * 2016-05-26 2017-12-15 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种基于弹性形变的钛金属增强块及其构建方法
WO2018185671A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Silk Biomaterials S.R.L. Nanofibers comprising fibroin as well as system comprising hydrogel and said nanofibers
CN110651074A (zh) * 2017-04-04 2020-01-03 西尔克生物材料有限公司 包含丝心蛋白的纳米纤维以及包含水凝胶和所述纳米纤维的系统
RU2708396C1 (ru) * 2018-12-19 2019-12-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук Биосовместимый биоразлагаемый остеокондуктивный полимерный композиционный материал для регенерации костной ткани
WO2020197323A1 (ko) * 2019-03-28 2020-10-01 연세대학교 산학협력단 마이크로채널 네트워크가 형성된 하이드로젤 구조체
KR20200117206A (ko) * 2019-04-03 2020-10-14 연세대학교 산학협력단 염증성 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 안내렌즈형 센서
KR20200131054A (ko) * 2019-05-13 2020-11-23 연세대학교 산학협력단 주사 가능한 나노섬유-하이드로젤 복합 입자 및 그 제조방법
KR20200056968A (ko) * 2020-05-15 2020-05-25 연세대학교 산학협력단 주사 가능한 3차원 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조방법
CN113384753A (zh) * 2021-03-19 2021-09-14 杭州协合医疗用品有限公司 一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用
CN115120776A (zh) * 2021-03-24 2022-09-30 苏州博创同康生物工程有限公司 一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用
CN115120776B (zh) * 2021-03-24 2023-07-14 苏州博创同康生物工程有限公司 一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用
CN114404394A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 西安交通大学 一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法
CN114404394B (zh) * 2022-01-20 2024-01-02 西安交通大学 一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法

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