CN110651074A - 包含丝心蛋白的纳米纤维以及包含水凝胶和所述纳米纤维的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括外膜(2)和芯(3)的纳米纤维(1),其中,所述外膜(2)由丝心蛋白制成,且所述芯(3)由生物相容性且可生物降解的聚合物制成。本发明还涉及获得所述纳米纤维的方法及其在输送生物活性分子和/或颗粒和/或细胞和/或治疗疾病中的用途。本发明还涉及所述粉状纳米纤维,可选择地分散在水溶液中,且涉及一种包含所述粉状纳米纤维的水凝胶和所述粉状纳米纤维和所述系统用于输送生物活性分子和/或颗粒和/或细胞和/或治疗疾病中的用途。
Description
本发明涉及包括外膜(2)和芯(3)的纳米纤维(1),其中所述外膜(2)由丝心蛋白(fibroin)制成,且所述芯(3)由生物相容性且生物可降解的聚合物制成。本发明还涉及获得所述纳米纤维的方法和其在输送生物活性分子和/或颗粒和/或细胞和/或治疗疾病中的用途。本发明还涉及所述粉状纳米纤维,可选择分散于水溶液中,并且涉及一种包含所述粉状纳米纤维的水凝胶系统,以及所述粉状纳米纤维和所述系统在输送生物活性分子和/或颗粒和/或细胞和/或治疗疾病中的用途。
背景技术
丝心蛋白是一种天然蛋白纤维,由各种昆虫(鳞翅目)、蜘蛛(蜘蛛目)、以及各种膜翅目、双翅目、鞘翅目等产生,通常由家蚕产生。蚕丝因其生物相容性、降解过程的可调控性以及其优异的保持其负载的活性成分的功能性的能力,作为药物载体引起了人们的广泛关注。
静电纺丝是一种可从聚合物溶液获得纳米纤维的通用方法。这种方法最初在US1,975,504中公开。
Alessandrino et al.in Eng.Life Sci.2008,8,No.3,219-225公开了通过静电纺丝由丝心蛋白制备成纳米纤维。使用六氟异丙醇(HFIP)、六氟丙酮(HFA)和甲酸等溶剂在丝心蛋白上进行静电纺丝,溶剂对人类和环境有毒(Zarkoob S et al.Structure andmorphology of electrospun silk nanofibers.Polymer 2004;45:3973–3977.KawaharaY et al.Structure for electro-spun silk fibroin nanofibers.J Appl Polym Sci2008;107:3681–3684.Ohgo K et al.Preparation of non-woven nanofibers ofBombyxmori silk.Samia cynthia ricini silk and recombinant hybrid silk withelectrospinning method.Polymer 2003;44:841–846).
WO2009042829公开了分散于水凝胶中的纳米纤维,所述纳米纤维的长度为纳米或毫米量级,它们由交联的羧基官能化聚合物和羟基官能化聚合物组成,例如聚丙烯酸(PAA)和多糖(例如,葡聚糖)。
由丝心蛋白获得的纳米纤维分散于水凝胶中,例如,Elia R et al.J BiomaterAppl 201327:749。所用聚合物通常为透明质酸。
合成聚合物,如聚环氧乙烷(PEO)已经被用于与壳聚糖结合获得纳米纤维(Pakravan M et al.,Biomacromolecules 2012,13,412-421)。
亟需开发一种具有生物相容性药理学意义,且易于获取和注射的分子载体。
发明内容
本发明首先提供了一种包括外膜(2)和芯(3)的纳米纤维(1),其中所述外膜(2)由丝心蛋白制成,且所述芯(3)由生物相容性且生物可降解的聚合物制成,优选地,所述聚合物为水溶性的。
在一优选实施例中,所述纳米纤维的所述芯中还包括一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。
本发明的第二方面是一种获得所述纳米纤维的方法,如图8所示。
在另一方面,公开和要求保护所述粉状纳米纤维(1),粉状纳米纤维是指纳米纤维的粒径为1~5000μm,更优选为10~1000μm。
在另一方面,公开和要求保护一种包括所述纳米纤维(1)的水凝胶系统,其中所述纳米纤维以粉状形式存在于所述水凝胶中。在一优选实施例中,所述系统还包括一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。所述生物活性分子和/或颗粒和/或细胞在所述纳米纤维的芯中,或在所述纳米纤维的芯中和水凝胶本身中,或在水凝胶中。
本发明还涉及一种获得所述系统的方法。
还要求保护所述纳米纤维、或所述粉状纳米纤维、或包括所述粉状纳米纤维的所述水凝胶系统、可选地载有一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞的所述纳米纤维和/或所述水凝胶在疾病治疗中的应用。所述纳米纤维、或所述粉状纳米纤维或所述系统被施用并定位在待治疗的区域中,允许由生物相容性且可生物降解的材料组成的、可选地包含在其内并经再摄取的生物活性分子和/或颗粒和/或细胞的受控释放。
附图说明
图1~6:实施例1得到的本发明提供的纳米纤维的图;
图7:本发明提供的纳米纤维的示意图;
图8:本发明提供的获得纳米纤维的流程图;
图9:本发明提供的获得水凝胶+纳米纤维系统的流程图。
具体实施方式
在第一方面,参照图7,下文描述了包括外膜(2)和芯(3)的纳米纤维(1)以及获得该纳米纤维的方法,其中,所述外膜(2)由丝心蛋白制成,所述芯(3)由生物相容性且可生物降解的聚合物制成。
所述丝心蛋白是天然或重组丝蛋白。例如,它是从家养蠕虫(家蚕)、野生虫子(柞蚕属(Antheraea),种:柞蚕(pernyi)、天蚕(yamamai)、印度柞蚕(militta)、琥珀蚕(assama)等;樗蚕属(Philosamia),种:蓖麻蚕(cynthia ricini)等、蜘蛛(蜘蛛目(Araneae)的不同种)、膜翅目昆虫(Hymenoptera)、双翅目昆虫(dipterans)获得,或通过本领域技术人员已知的DNA重组技术获得。
在一优选实施例中,所述聚合物选自单独的或组合的天然或合成的生物相容性且生物可降解的聚合物。优选地,所述聚合物是水溶性的。例如,它选自包括聚环氧乙烷(PEO)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA-PGA组合或PLGA共聚物、聚己内酯(PCL)、透明质酸、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐、白蛋白的群组。更优选的,所述聚合物为PEO。
优选地,所述纳米纤维的直径为50~2000nm。在一优选实施例中,所述纳米纤维的直径为200~600nm,优选为200~500nm,其中,所述直径对应于芯(3)厚度和外膜(2)厚度之和。
优选地,所述外膜的厚度是10~750nm,或20~250nm。例如,本发明提供的纳米纤维(1)的外膜(2)的厚度为200nm,总直径为700nm。除此之外,所述纳米纤维的外膜(2)的厚度为100nm,总直径为300nm,或外膜(2)的厚度为100nm,总直径为400nm,或者外膜(2)的厚度为60nm,总直径为250nm。
所述芯(3)沿纵向延伸,优选在纳米纤维(1)本身的整个长度上延伸。
在一优选实施例中,所述纳米纤维包括一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。所述生物活性分子例如选自包括抗肿瘤化合物、抗凝化合物、抗血栓化合物、抗体、疫苗、抗生素、抗病毒药物、抗炎药、氨基酸、肽、蛋白质、酶、生长因子、血管生成因子、核酸(如miRNA)、盐、纤连蛋白、糖胺聚糖、多糖、维生素、抗氧化剂、抗微生物剂的群组。例如,所述抗肿瘤药可包含烷化剂及其类似物(环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、雌莫司汀、洛莫斯汀、卡莫司汀、卡铂、顺铂、奥沙利铂、白消安、曲奥舒凡、塞替派(tiotepa)、达卡巴嗪、丙卡巴肼、替莫唑胺)、抗代谢药(甲氨蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、替加氟、氟达拉滨、克拉屈滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨、奈拉滨)、细胞毒性抗生素(柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、安吖啶、博来霉素、放线菌素、丝裂霉素)、天然来源的衍生物(紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伊立替康、拓扑替康、曲贝替定(trabectedin)、依托泊苷、曲贝替定)、激素和拮抗剂(己烯雌酚、炔雌醇、甲羟孕酮、甲地孕酮、炔诺酮、戈舍瑞林、亮丙瑞林(leuproreline)、曲普瑞林、兰瑞肽、奥曲肽、他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、环丙孕酮、氟他胺、比卡鲁胺、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)、蛋白激酶抑制剂(达沙替尼、厄洛替尼、伊马替尼、尼洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、单克隆抗体(帕尼单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗)。
在一优选实施例中,所述一种或多种生物活性分子选自包括水溶性小分子的群组,更优选地,所述水溶性小分子属于具有细胞毒作用的抗生素。例如,丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、吉西他滨是特别适合于装载到根据本发明的纳米纤维中的活性成分。
所述颗粒优选为:无机类型的亚微米级颗粒:量子点、磁性纳米粒子、陶瓷和金属(例如,铂、钯、铑、金、银、铜基);有机类型的亚微米级颗粒:脂质体、胶束、树枝状大分子、聚合物纳米颗粒(PLA、PLGA、PVP、PEG、PCL等)和纳米凝胶(PAA、PVP、PVA、藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸);无机-有机杂化亚微米级颗粒。在一优选实施例中,所述颗粒装载有一种或多种前述生物活性分子,并包含在形成本发明纳米纤维的芯的聚合物中。
所述细胞是处于其天然或工程化状态的干细胞、原代细胞或系细胞。优选地,所述细胞为干细胞、基质细胞、胚胎细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、白细胞、淋巴细胞或胚胎干细胞,例如iPSC。例如,所述细胞是用编码生长因子的基因改造的。
在一优选实施例中,所述纳米纤维通过静电纺丝法制备得到。所述纳米纤维的特征在于通过同轴静电纺丝获得,并且通过改变所用溶液的浓度和工艺参数,获得具有不同直径和具有不同芯(3)厚度与外膜(2)厚度的比率的纳米纤维。
所述同轴静电纺丝方法包括以下步骤(不一定按指出的顺序进行):
a)提供在甲酸中浓度为2%~14%w/w的丝心蛋白溶液(SF);
b)提供水溶性聚合物水溶液;
c)可选择地,在所述水溶液中加入所述生物活性分子和/或细胞;
d)填充至少两个注射器,至少一个第一注射器用所述丝心蛋白溶液填充,且至少一个第二注射器用所述水溶性聚合物溶液填充;
e)将所述注射器连接到同轴静电纺丝系统的泵送系统上;
f)开始静电纺丝过程。
在一优选实施例中,所述方法包括:
(a)提供在甲酸中浓度为2%~14%或5%~12%或6%~12%或5%~10%或7%~10%或7%~9%w/w的丝心蛋白溶液(SF),所述甲酸优选为纯甲酸。具有高浓度的所述丝心蛋白溶液通常从市场上可获得的丝心蛋白水溶液获得,其浓度通常为5%w/w,通过该水溶液固化得到丝心蛋白膜,将水溶液倒在合适的载体上,在通风厨中晾干。在进一步的实施例中,应用本领域技术人员已知的生产丝心蛋白膜的方法,由不含丝胶的天然丝纤维开始制备所述丝心蛋白水溶液。然后将所得丝心蛋白膜溶解在甲酸中,于搅拌下在30~120min,优选60~120min内完成溶解;
b)提供水溶性聚合物水溶液,即盐溶液或培养基或浓缩水溶液,或水,优选重蒸水;
c)可选择地,在所述水溶液中加入所述生物活性分子和/或颗粒和/或细胞;
d)填充至少两个注射器,至少一个第一注射器填充所述丝心蛋白溶液,且至少一个第二注射器填充所述水溶性聚合物溶液;
e)将所述注射器连接到同轴静电纺丝系统的泵送系统上,对在填充前或填充后进行所述连接不做要求;
f)通过在以下范围内设置参数来启动静电纺丝过程:
-流速:0.1~10mL/h,优选0.5~1mL/h;
-喷丝头(阴极)和金属收集器(阳极)之间的工作距离:5~100cm,优选10~80cm;
-阴极和阳极之间的电势差:5~100kV,优选15~60kV。
已经证明了特别有利的操作条件:在阴极提供-10kV的电压,在阳极提供+10kV的电压,在阴极和阳极之间形成20kV的电势差;或在阴极提供-5kV的电压,且在阳极提供+15kV的电压;或在阴极提供-1kV的电压,且在阳极提供+19kV的电压;或在阴极提供0kV的电压,且在阳极提供+24kV的电压。
在一优选实施例中,所述水溶性聚合物是PEO,且所述PEO溶液的浓度为2%~6%,优选为2.5%~5%w/w,溶剂为水,优选为重蒸水,例如通过将PEO粉末加入水中并在室温下搅拌而获得,优选搅拌过夜。
优选地,所述静电纺丝过程是利用金属收集器通过在启动了抽吸功能的罩下作业进行的,该金属收集器上涂有一层可去除的层,在上面静电纺纤维不会粘附,例如铝层、聚合物膜或织物,最好为涂覆有铝层的静态金属收集器。
在一个更优选的实施例中,所述电纺丝过程是用以下参数进行的:
-流速:1~0.5mL/h;
-喷丝头(阴极)和金属收集器(阳极)之间的工作距离:17~19cm,优选18cm;
-施加电压:阳极保持0kV,阴极保持22~26kV。
优选地,所述SF的浓度为10%,所述PEO的浓度为5%;以0.5mL/h的流速、18cm的工作距离和24kV的电压运行。
优选地,所述静电纺丝工艺后进行稳定化化学处理。所述稳定化处理包括将由所述方法获得的产品浸泡在醇浴中,优选在水和醇浴中。例如,所述醇选自甲醇和乙醇,优选为乙醇,其中,所述浴中所述乙醇的浓度为50~100%v/v。所述浸泡至少要持续10min,或为20~90min,优选为20~40min,或30min。随后,将所得稳定化产品从其所沉积在的铝片上拉动并移除,并在室温下干燥。
化学稳定化处理使得本发明提供的纳米纤维因结晶过程即使浸入水中也能保持纳米纤维结构。
在装载一种或多种活性成分和/或颗粒和/或细胞的所述可选步骤c)中,将所述一种或多种活性成分和/或颗粒和/或细胞加入所述水溶液中,形成悬浮液或溶液(这取决于活性成分的类型或是否有细胞存在)。
使用0.1%罗丹明B(Rhodamine B)水溶液进行的实验,其唯一目的是监测制备过程中活性成分的定位,结果表明,所得纳米纤维芯中有典型的罗丹明染色。
在另一方面,在此描述的本发明所提供的纳米纤维是粉状形态。所述纳米纤维经研磨获得粒度为1~5000μm的粉末,优选为10~1000μm。在一实施例中,所述研磨是手动获得的,在浸入液氮中的研钵中作业,从而获得100~1000μm的粒径,粒径之间差异较大,或者使用研钵研磨机(mortar grinder)操作,从而获得较小的粒度,且粒径差异较小。可替代地,使用本领域技术人员已知的方法,例如,研磨机(mills)(例如,球磨机)、或微粉磨机(micronizer)(例如,圆形室空气射流、椭圆形室空气射流、对置式空气射流微粉磨机)。
收集由此获得的粉末,并优选进行重结晶。所述重结晶处理包括将从所述过程得到的产品浸泡在醇浴中,优选为水和醇浴。所述醇选自例如甲醇和乙醇,更优选为乙醇,其中,在所述浴中所述乙醇的浓度为50~100%v/v。所述浸泡至少要持续10min,或20~90min,优选20~40min,或30mim。例如,通过将所述粉末收集在甲醇中,并将所述悬浮液干燥,来进行重结晶,优选在室温下,在具有较大表面的容器中干燥。随后,干燥的产品反复用水洗涤,优选使用重蒸水洗涤2或3次,搅拌和离心,以消除任何残留的溶剂。然后进行灭菌。所述灭菌过程可以使用环氧乙烷、γ射线曝露、β射线曝露、紫外线曝露;优选紫外线曝露。
当所述纳米纤维已经负载有亲水性小分子的活性成分时,本文已经证明亲水性小分子的活性成分保留在了研磨后的纳米纤维中,因通过研磨包括罗丹明B染料的纳米纤维证实了其具有亲水性小分子特征。
在另一方面,本发明公开了包含本发明所提供的纳米纤维的水凝胶系统及制备所述系统的方法。
所述水凝胶选自背景技术中已知的水凝胶。在所述系统被开发用于膀胱的实施例中,所述水凝胶优选由透明质酸和硫酸软骨素组成。这是因为尿道上皮有糖胺聚糖包被,并且所述包被(例如由于去除肿瘤而受损)可以用水凝胶中的透明质酸和硫酸软骨素有利的代替,表明后者对所述糖胺聚糖具有向性。此外,透明质酸是肿瘤细胞表达的CD44分子的黏附剂,并且它在膀胱中可作为肿瘤切除手术后残留肿瘤细胞的螯合剂。
本发明提供的获得水凝胶+纳米纤维系统的方法包括获取粉状纳米纤维,可选地如前所述的重结晶和灭菌,最后将所述粉状纳米纤维分散在所选水凝胶的溶液中,所选水凝胶溶液最好无菌。
在一实施例中,所述纳米纤维分散在所述水凝胶中的浓度为0.01%~5%w/v,或0.01%~1%w/v,或0.1%~0.8%W/v,或0.2%~0.5%w/v。浓度高于优选的浓度会使体系太坚实,难以以凝胶的形式输送。
在水凝胶中包含一种或多种活性分子和/或颗粒和/或细胞的实施例中,将它们以所需的量溶解/分散在分散有粉末的水凝胶中。
在另一实施例中,将所述粉状纳米纤维分散在水溶液中。因此,本发明还涉及包含所述粉状纳米纤维的水溶液。
本发明还涉及所述纳米纤维、和/或所述粉状纳米纤维、和/或分散在水溶液中的所述粉状纳米纤维、和/或分散在水凝胶中的所述粉状纳米纤维用于输送活性成分和/或用作组织再生的载体,其中,所述纳米纤维和/或所述水凝胶可选择地装载有一种或多种活性分子和/或颗粒和/或细胞。
例如,有证据支持本发明所提供的非粉状纳米纤维可有利地用于治疗疝气和脱垂、重建假体(如乳房假体)和作为周围神经系统(神经)、血管系统(静脉、动脉、用于血管通路的动静脉瘘管)、淋巴系统(淋巴循环系统、淋巴结)、心血管系统(冠状动脉和心肌)、中枢神经系统(脊髓)、皮肤及其各层、用于容纳和保护内部器官(硬脑膜、心包膜、胸膜、腹膜等)的组织以及肌肉骨骼系统组织(肌腱、韧带、肌肉、骨骼、软骨、膈膜)、呼吸系统(鼻粘膜、气管、喉、咽、支气管、肺)、消化系统(食道、胃、肠、肛管组织)、口腔组织和粘膜(牙龈、牙齿等)、舌头、泌尿系统(肾脏、输尿管、膀胱、尿道、肾上腺)、生殖器和生殖系统(海绵体、前列腺、子宫、外阴、阴道、子宫内膜、输卵管)的组织和器官再生的支架。
同样,所述粉状和/或分散在水溶液中和/或掺入水凝胶中的纳米纤维可以包含在用于修复和再生前段所列所有组织的系统和/或支架中。
本发明所提供的基于纳米纤维的系统(非粉末化、粉末化、分散在水溶液中、分散在水凝胶中)可用于在由于病理、外伤或外科手术而造成的组织和/或器官损伤后进行再生,例如,在随着切除肿瘤进行的全部或部分切除的情况。
在一优选实施例中,所述水凝胶是透明质酸+硫酸软骨素,并且所述活性成分是丝裂霉素C,所述系统应用于膀胱癌的治疗,特别是在肿瘤切除后治疗中是有利的。
在一实施例中,本发明涉及包括外膜(2)和芯(3)的纳米纤维(1),其中,所述外膜(2)由丝心蛋白制备而成,所述芯(3)由聚环氧乙烷(PEO)制备而成。
优选地,所述纳米纤维的直径为200~500nm。优选地,所述纳米纤维的芯包含一种或多种亲水分子。
在一实施例中,本发明进一步涉及一种获得纳米纤维的方法,其中,所述方法包括如下步骤:
-提供在纯甲酸中浓度为6%~12%,优选为8%~10%w/w的丝心蛋白溶液(SF);
-提供在水(优选重蒸馏水)中浓度为2%~6%,优选为2.5%~5%w/w的PEO溶液;
-可选择地,溶解一种或多种水溶性小分子于所述水中;
-用所述溶液填充两个注射器,将它们连接在同轴静电纺丝系统的泵送系统上;
-设置参数在以下范围内,开始静电纺丝过程:流速:1~0.5mL/h,喷丝头(阴极)和金属收集器(阳极)之间的工作距离:17~19cm,优选为18cm,电压:保持阳极为0kV,阴极为22~26kV。
优选地,所述方法还包括稳定化处理步骤,具体为将从前述方法得到的产品浸入甲醇中约30’。
在另一实施例中,本发明涉及一种包含本发明提供的纳米纤维的水凝胶系统,特征在于所述纳米纤维是粉状的,且粒径为10~1000μm。优选地,所述水凝胶包含透明质酸+硫酸软骨素。优选地,所述纳米纤维和/或所述水凝胶包含活性成分,所述活性成分选自包括如下组分的组:丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、吉西他滨。
在另一实施例中,本发明涉及一种获得前述系统的方法,包括如下步骤:
-提供本发明所提供的纳米纤维;
-研磨所述纳米纤维,获得粒径为10~1000μm,优选为100~1000μm的粉末;
-可选择地,在甲醇中重结晶;
-分散在水凝胶中,视需要添加一种或多种亲水性小分子。
在另一实施例中,本发明涉及所述系统作为活性成分的载体和/或组织再生的支架的用途。优选的,所述系统包含用于治疗膀胱癌的丝裂霉素C,作为活性成分。
与其他生物聚合物(例如壳聚糖)相比,使用丝心蛋白的优势显而易见,因为丝心蛋白虽然可生物降解,但对水性环境具有更大的抵抗力。
此外,丝心蛋白具有惊人的仿生能力。这使得本发明提供的纳米纤维系统不仅可以作为活性成分的载体,而且其本身还可以作为组织再生的支架,因为本发明提供的纳米纤维能够被整合到其所在的系统中。
另一个优点是,与其他生物聚合物相比,对丝心蛋白研磨的机械阻力出人意料地更大。例如,不能根据本发明对背景技术中的壳聚糖-PEO纳米纤维进行粉末化,因为粉末化过程会破坏背景技术中已知的壳聚糖-PEO纳米纤维的纳米纤维结构。只有使用本发明所提供的纳米纤维,才能得到保持纳米纤维结构的粉末。
此外,丝心蛋白具有可程控的生物降解性,即,通过改变纳米纤维的外膜的厚度,可以调节丝心蛋白的生物降解性,从而控制溶解在纳米纤维自身的芯中的活性成分的释放。这些特征能够惊人地控制体内释放动力学,使得可以长时间精细地调节丝心蛋白的生物降解,并因此可以长时间精细地调节由本发明所提供的系统输送的活性成分的释放。
已经观察到,通过手动研磨纳米纤维获得的更大的尺寸变化性有利于通过连续系统随着时间的推移,使包含在纳米纤维内部的活性成分释放,因为较小的碎片释放更快,较大的碎片释放延迟。因此,碎片的尺寸分布范围较大可使活性成分的释放更好地随时间分布。
实施例
实施例1:通过改变静电纺丝参数和起始溶液的浓度获得的纳米纤维的表征。
表1下面显示了应用的参数和获得的结果。表中的最后一栏指根据描述的方法获得的纳米纤维的代表性图
表1
为了本发明的目的,已经证明第6组是特别有利的。实际上,已经发现,通过所述方法,静电纺丝过程更稳定并且可重复性更高。
实施例2:水凝胶+纳米纤维系统的无毒测试。
单独用水凝胶或用实施例1中第6组的水凝胶+纳米纤维系统处理肝癌细胞系(HepG2),其中水凝胶包括透明质酸和硫酸软骨素。
在处理24h和48h后,观察细胞,并用MTT法定量其存活力。
将细胞暴露于水凝胶+纳米纤维系统中,观察到在24h和48h时细胞存活力分别为124%和82%,其中,%表示相对于在对照细胞(即未暴露于水凝胶+纳米纤维系统的细胞)中测得的100%。在单独存在水凝胶的情况下,在24h和48h分别测得细胞活力为119%和126%。这些数据表明本发明所提供的系统是无毒的。
Claims (45)
1.一种纳米纤维(1),包括外膜(2)和芯(3),其特征在于,所述外膜(2)由丝心蛋白制成,所述芯(3)由生物相容性且可生物降解的聚合物制成。
2.根据权利要求1所述的纳米纤维(1),其特征在于,所述丝心蛋白是天然或重组丝蛋白,优选选自包括从家养蠕虫(家蚕(Bombyx mori))、野生虫子(柞蚕属(Antheraea),种:柞蚕(pernyi)、天蚕(yamamai)、印度柞蚕(militta)、琥珀蚕(assama)等;樗蚕属(Philosamia),种:蓖麻蚕(cynthia ricini))、蜘蛛(蜘蛛目(Araneae))、膜翅目昆虫、双翅目昆虫获得的丝心蛋白的群组,或通过DNA重组技术得到。
3.根据权利要求1或2所述的纳米纤维,其特征在于,所述生物相容性且可生物降解的聚合物为天然或合成聚合物,单独或组合使用。
4.根据权利要求1~3任一项所述的纳米纤维,其中所述聚合物为水溶性聚合物。
5.根据权利要求1~4任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述聚合物选自包括聚环氧乙烷(PEO)、聚己内酯(PCL)、透明质酸、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐和白蛋白的群组中的一个或多个。
6.根据权利要求1~5任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述聚合物为PEO。
7.根据权利要求1~6任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述纳米纤维的直径为50~2000nm,或200~600nm。
8.根据权利要求1~7任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述纳米纤维的直径为200~500nm。
9.根据权利要求1~8任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述外膜(6)的厚度为10~750nm,或20~250nm。
10.根据权利要求1~9任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述外膜(2)的厚度为200nm,且所述纳米纤维的直径为700nm,或所述外膜(2)的厚度为100nm,且所述纳米纤维的直径为300nm,或所述外膜(2)的厚度为100nm,且直径为400nm,或外膜(2)的厚度为60nm,且直径为250nm。
11.根据权利要求1~10任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述芯(3)纵向延伸,优选在所述纳米纤维(1)的整个长度上延伸。
12.根据权利要求1~11任一项所述的纳米纤维,其特征在于,所述芯(3)包含一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。
13.根据权利要求12所述的纳米纤维,其特征在于,所述生物活性分子选自包括抗肿瘤化合物、抗凝化合物、抗血栓化合物、抗体、疫苗、抗生素、抗病毒药物、抗炎药、氨基酸、肽、蛋白质、酶、生长因子、血管生成因子、核酸(例如miRNA)、盐、纤连蛋白、糖胺聚糖、多糖、维生素、抗氧化剂、抗微生物剂的群组。
14.根据权利要求12或13所述的纳米纤维,其特征在于,所述生物活性分子选自包括抗肿瘤化合物(如烷化剂及其类似物,优选为环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、雌莫司汀、洛莫斯汀、卡莫司汀、卡铂、顺铂、奥沙利铂、白消安、曲奥舒凡、塞替派、达卡巴嗪、丙卡巴肼、替莫唑胺)、抗代谢药(优选甲氨蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、替加氟、氟达拉滨、克拉屈滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨、奈拉滨)、细胞毒性抗生素(优选柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、安吖啶、博来霉素、放线菌素、丝裂霉素)、天然来源的衍生物(优选紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伊立替康、拓扑替康、曲贝替定、依托泊苷、曲贝替定)、激素和拮抗剂(优选己烯雌酚、炔雌醇、甲羟孕酮、甲地孕酮、炔诺酮、戈舍瑞林、亮丙瑞林、曲普瑞林、兰瑞肽、奥曲肽、他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、环丙孕酮、氟他胺、比卡鲁胺、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)、蛋白激酶抑制剂(优选达沙替尼、厄洛替尼、伊马替尼、尼洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、单克隆抗体(优选帕尼单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗)的群组。
15.根据权利要求12或13所述的纳米纤维,其特征在于,所述生物活性分子选自包括亲水性小分子的群组。
16.根据权利要求15所述的纳米纤维,其特征在于,所述小分子属于具有细胞毒作用的抗生素的群组,例如丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、吉西他滨。
17.根据权利要求12所述的纳米纤维,其中,所述颗粒优选为无机型、有机型或有机-无机杂化型。
18.根据权利要求12所述的纳米纤维,其特征在于,所述细胞是天然或工程化状态的干细胞、原代细胞或系细胞。
19.一种获得权利要求1~18任一项所述纳米纤维的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤,不一定按指出的顺序进行:
a)提供在甲酸中浓度为2%~14%w/w的丝心蛋白溶液(SF);
b)提供水溶性聚合物水溶液;
c)可选择地,在所述水溶液中加入所述生物活性分子和/或颗粒和/或细胞;
d)填充至少两个注射器,至少一个第一注射器用所述丝心蛋白溶液填充,且至少一个第二注射器用所述水溶性聚合物溶液填充;
e)将所述注射器连接到同轴静电纺丝系统的泵送系统上;
e)开始静电纺丝过程。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述丝心蛋白溶液(SF)在甲酸中的浓度为2%~14%,或5%~12%,或6%~12%,或5%~10%,或7%~10%,或7%~9%w/w,所述甲酸优选为纯甲酸。
21.根据权利要求19或20所述的方法,其特征在于,所述水溶液为盐水或培养基或浓缩水溶液,或水,优选重蒸水。
22.根据权利要求19或20所述的方法,其特征在于,所述静电纺丝过程是通过将参数设置在以下范围内来进行的:
-流速0.1~10mL/h,优选0.5~1mL/h;
-喷丝头(阴极)和金属收集器(阳极)之间的工作距离:5~100cm,优选10~80cm;
-阴极和阳极之间的电势差:5~100kV,优选15~60kV。
23.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,所述阴极电压为-10kV,且所述阳极电压为+10kV;或所述阴极电压为-5kV,且所述阳极电压为+15kVA;或阴极电压为-1kV,且所述阳极电压为+19kV;或阴极电压为0kV,且所述阳极电压为+24kV。
24.根据权利要求19~23任一项所述的方法,其特征在于,所述静电纺丝过程利用金属收集器通过在启动了抽吸功能的罩下作业来进行,该金属收集器涂有一层可去除的层,在上面电纺纤维不会粘附,比如铝层、聚合物膜层或织物。
25.根据权利要求19所述的方法,包括:
-提供在纯甲酸中浓度为6%~12%,优选为8%~10%w/w的丝心蛋白溶液;
-提供在水中,优选在重蒸水中浓度为2%~6%,优选为2.5%~5%w/w的PEO溶液;
-可选择地,在所述水中溶解一种或多种水溶性小分子;
-用所述溶液填充两个注射器,并将其连接在同轴静电纺丝系统的泵送系统上;
-设置参数在如下范围内,开始静电纺丝过程:流速:1~0.5mL/h;喷丝头(阴极)和金属收集器(阳极)之间的工作距离:17~19cm,优选18cm;工作电压:保持阳极0kV,阴极达到22~26kV。
26.根据权利要求19~25任一项所述的方法,还包括产品稳定化处理步骤。
27.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,所述稳定化处理步骤是一种化学处理方法,包括将由静电纺丝得到的产品浸泡在醇和/或水浴中至少10min。
28.根据权利要求26或27所述的方法,其特征在于,所述稳定化处理步骤中,所述醇选自甲醇和乙醇,优选为乙醇,其中所述浴中所述乙醇的浓度为50~100%v/v。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其特征在于,所述稳定化处理步骤中,所述浸泡持续20~90min,优选20~40min,或30min。
30.根据权利要求27所述的方法,其特征在于,所述产品浸泡在甲醇中约30min。
31.根据权利要求1~18任一项所述的纳米纤维,所述纳米纤维为粉末状,且粒径为1~5000μm,优选为10~1000μm,或100~1000μm。
32.一种水溶液,包含权利要求31所述的粉状纳米纤维。
33.一种系统,其为包含权利要求31所述的粉状纳米纤维的水凝胶。
34.根据权利要求33所述的系统,其特征在于,所述粉状纳米纤维的浓度为0.01%~5%w/v,或0.01%~1%w/v,或0.1%~0.8%w/v,或0.2%~0.5%w/v。
35.根据权利要求33或34所述的系统,其特征在于,所述水凝胶包含透明质酸+硫酸软骨素。
36.根据权利要求33~35任一项所述的系统,其特征在于,所述水凝胶包含一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。
37.根据权利要求36所述的系统,其特征在于,所述一种或多种生物活性分子选自包括抗肿瘤化合物、抗凝化合物、抗血栓化合物、抗体、疫苗、抗生素、抗病毒药、抗炎药、氨基酸、肽、蛋白质、酶、生长因子、血管生成因子、核酸(例如miRNA)、盐、纤连蛋白、糖胺聚糖、多糖、维生素、抗氧化剂、抗微生物剂的群组。
38.根据权利要求36所述的系统,其特征在于,所述纳米纤维和/或所述水凝胶包含活性成分,所述活性成分优选选自包括丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、吉西他滨的群组。
39.一种获得权利要求33~38任一项所述系统的方法,包括:
-提供权利要求1~18任一项所述的纳米纤维;
-研磨所述纳米纤维,获得粉末,粉末的颗粒粒径为1~5000μm,优选为10~1000μm,或100~1000μm;
-可选择地,重结晶;
-分散在水凝胶中,可选择地,加入一种或多种生物活性分子和/或颗粒和/或细胞。
40.权利要求1~18、31和33~38任一项所述的纳米纤维在治疗人类或动物疾病中的用途。
41.根据权利要求40所述的纳米纤维的用途,其特征在于,所述纳米纤维和/或所述水凝胶作为生物活性分子和/或颗粒和/或细胞的载体。
42.根据权利要求40或41所述的纳米纤维的用途,其特征在于,所述用途是组织再生。
43.根据权利要求40或41所述的纳米纤维的用途,其特征在于,所述用途是治疗疝气和脱垂、重建假体(例如,乳房假体)、作为周围神经系统、血管系统(例如,静脉、动脉、用于血管通路的动静脉瘘)、淋巴系统(例如,淋巴循环系统、淋巴结)、心血管系统(例如,冠状动脉和心肌)、中枢神经系统(例如,脊髓、皮肤及其各层)、用于容纳和保护内部器官的组织(例如,硬脑膜、心包膜、胸膜、腹膜)、肌肉骨骼系统的组织(例如,腱、韧带、肌肉、骨骼、软骨、膈膜)、呼吸系统(例如,鼻粘膜、气管、喉、咽、支气管、肺)、消化系统(例如,食道、胃、肠、肛管组织)、口腔的组织和粘膜(例如,牙龈、牙齿、舌头)、泌尿系统(例如,肾脏、输尿管、膀胱、尿道、肾上腺)、生殖器和生殖系统(例如,海绵体、前列腺、子宫、外阴、阴道、子宫内膜、输卵管)的组织和器官再生的支架。
44.根据权利要求40~43任一项所述的纳米纤维的用途,其特征在于,所述用途为在治疗膀胱癌中的用途。
45.根据权利要求40所述的纳米纤维的用途,其特征在于,所述纳米纤维在水凝胶中,且所述系统包含有效成分丝裂霉素C。
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