JP2020520344A

JP2020520344A - フィブロインを含むナノファイバーならびにヒドロゲルおよび前記ナノファイバーを含むシステム

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Publication number: JP2020520344A
Application number: JP2019554777A
Authority: JP
Inventors: グアリーノ，ヴィータ; ポテンザ，アダ; リツェロ，バレリア
Original assignee: シルクバイオマテリアルズエス．アール．エル．
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2020-07-09
Also published as: AU2018248085A1; CA3058866A1; EP3607117A1; IT201700036930A1; WO2018185671A1; CN110651074A; US20200109491A1

Abstract

本発明は、外膜（２）およびコア（３）を含むナノファイバー（１）に関し、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）は生体適合性および生分解性ポリマーから作製される。本発明はさらに、前記ナノファイバーを得る方法、および生物活性分子および／または粒子および／または細胞を運ぶため、および／または疾患の治療におけるその使用に関する。本発明はまた、任意で水溶液中に懸濁された前記粉末状ナノファイバー、および前記粉末状ナノファイバーを含むヒドロゲルシステム、ならびに生物活性分子および／または粒子および／または細胞を運ぶため、および／または疾患の治療における前記粉末状ナノファイバーおよび前記システムの使用に関する。本発明はまた、任意で水溶液中に懸濁された前記粉末状ナノファイバー、および前記粉末状ナノファイバーを含むヒドロゲルシステム、ならびに生物活性分子および／または粒子および／または細胞を運ぶため、および／または疾患の治療における前記粉末状ナノファイバーおよび前記システムの使用に関する。

Description

本発明は、外膜（２）およびコア（３）を含むナノファイバー（１）に関し、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）は生体適合性および生分解性ポリマーから作製される。本発明はさらに、前記ナノファイバーを得る方法、並びに生物活性分子および／または粒子および／または細胞を運ぶため、および／または疾患の治療におけるその使用に関する。本発明はまた、オプションで水溶液中に懸濁された前記粉末状ナノファイバー、および前記粉末状ナノファイバーを含むヒドロゲルシステム、ならびに生物活性分子および／または粒子および／または細胞を運ぶため、および／または疾患の治療における前記粉末状ナノファイバーおよび前記システムの使用に関する。

絹フィブロインは、さまざまな昆虫（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目）、クモ（Ａｒａｎｅａｅ目）、ならびにさまざまなハチ目、ハエ目、コウチュウ目などの、典型的にはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ種のカイコから製造される天然のタンパク質繊維である。絹は、その生体適合性、絹の分解のプログラミングの可能性、および絹に担持された有効成分の機能性を維持する並外れた能力により、薬剤の担体として非常に興味深いものである。

エレクトロスピニングは、ポリマー溶液から始まってナノメートルの繊維を得ることができる汎用性の高い方法である。この方法は、最初に特許文献１に記載された。

Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｏらは、非特許文献１において、エレクトロスピニングによって、絹フィブロインから得られるナノファイバーを記載している。エレクトロスピニングは、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、およびギ酸などの溶媒、ヒトおよび環境に有毒な溶媒を使用して絹フィブロインにおいて実施された（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。

特許文献２は、ヒドロゲル中に分散したナノファイバーを記載しており、ここで、前記ナノファイバーの長さはナノメートルまたはミリメートル程度であり、それらはポリアクリル酸（ＰＡＡ）などの架橋カルボキシ官能性ポリマーおよびヒドロキシ官能性ポリマー、およびデキストランなどの多糖類からなる。

絹フィブロインから得られたナノファイバーは、例えば、非特許文献５においては、ヒドロゲル中で分散されていた。使用されるポリマーは、典型的にはヒアルロン酸である。

ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などの合成ポリマーは、ナノファイバーを得るためにキトサンと組み合わせて使用されている（非特許文献６）。

入手しやすく注射可能である、生体適合性があり、薬理学的に関心のある分子のための担体を有する必要性が強く感じられている。

ＵＳ１，９７５，５０４ＷＯ２００９０４２８２９

Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｏｅｔａｌ．，Ｅｎｇ．ＬｉｆｅＳｃｉ．２００８，８，Ｎｏ．３，２１９−２２５ＺａｒｋｏｏｂＳｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎｓｉｌｋｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ（Ｐｏｌｙｍｅｒ２００４；４５：３９７３−３９７７）ＫａｗａｈａｒａＹｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏ−ｓｐｕｎｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ（ＪＡｐｐｌＰｏｌｙｍＳｃｉ２００８；１０７：３６８１−３６８４）ＯｈｇｏＫｅｔａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｎｏｎ−ｗｏｖｅｎｎａｎｏｆｉｂｅｒｓｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｓｉｌｋ．Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉｓｉｌｋａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｙｂｒｉｄｓｉｌｋｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ（Ｐｏｌｙｍｅｒ２００３；４４：８４１−８４６）ＥｌｉａＲｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｍａｔｅｒＡｐｐｌ２０１３２７：７４９ＰａｋｒａｖａｎＭｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１２，１３，４１２−４２１

本発明は、第一に、外膜（２）およびコア（３）を含むナノファイバー（１）であって、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）は生分解性および生体適合性ポリマーから作製される、ナノファイバーに関する。好ましくは、前記ポリマーは水溶性である。

好ましい実施形態において、前記ナノファイバーはまた、前記コア中に、１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を含む。

本発明の第２の態様は、図８に概略的に示される、前記ナノファイバーを得る方法である。

さらなる態様において、前記粉末状ナノファイバー（１）が記載及び特許請求され、粉末状ナノファイバーは、１〜５０００マイクロメートル、好ましくは１０〜１０００マイクロメートルの粒径を有するナノファイバーを意味する。

さらなる態様において、前記ヒドロゲル中に粉末形態で存在するナノファイバー（１）を含むヒドロゲルシステムが記載され、特許請求される。好ましい実施形態において、前記システムはまた、１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を含む。前記生物活性分子および／または粒子および／または細胞は、前記ナノファイバーのコア中、または前記ナノファイバーのコア中およびヒドロゲル自体の中、またはヒドロゲルの中に存在する。

本発明はさらに、前記システムを得る方法に関する。

オプションで疾患の治療に使用するための１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を担持した、前記粉末状ナノファイバー、前記ナノファイバーまたは前記ヒドロゲルを含む、前記ナノファイバー、または前記粉末状ナノファイバー、または前記ヒドロゲルシステムも特許請求されている。前記ナノファイバー、または前記粉末状ナノファイバー、または前記システムは、治療される領域中に投与および配置され、オプションでそこに含まれ、再取り込みを受け、生体適合性および生分解性材料からなる生物活性分子および／または粒子および／または細胞の制御放出を可能にする。

実施例１によって得られた、本発明によるナノファイバーの写真。本発明によるナノファイバーのスキーム。本発明によるナノファイバーを得るプロセスの図。本発明によるヒドロゲル＋ナノファイバーシステムを得るプロセスの図。

第１の態様では、図７を参照すると、外膜（２）およびコア（３）を含むナノファイバー（１）であって、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）は生体適合性および生分解性ポリマーから作製され、およびそれらを得るための方法が以下に記載される。

前記フィブロインは、絹の天然または組換え繊維状タンパク質である。例えば、フィブロインは、家畜虫（Ｂｏｍｂｙｘ属、ｍｏｒｉ種）、野生虫（Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、ｐｅｒｎｙｉ、ｙａｍａｍａｉ、ｍｉｌｉｔｔａ、ａｓｓａｍａ種など、Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ属、ｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ種など）、クモ（Ａｒａｎｅａｅ目のさまざまな種）、ハチ目、ハエ目などから、または当業者に既知の組換えＤＮＡ技術によって得られる。

好ましい実施形態において、前記ポリマーは、天然または合成の生体適合性および生分解性ポリマーから、単独または組み合わせて選択される。好ましくは、前記ポリマーは水溶性である。例として、ポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡの組み合わせ、またはＰＬＧＡコポリマー、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸塩、アルブミンを含む群から選択される。さらにより好ましくは、前記ポリマーはＰＥＯである。

好ましくは、前記ナノファイバーは、５０〜２０００ｎｍの直径を有する。好ましい実施形態において、前記ナノファイバーは、２００〜６００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍの直径を有し、ここで、前記直径は、コアの厚さ（３）と外膜の厚さ（２）の合計に相当する。

好ましくは、前記外膜の厚さは、１０〜７５０ｎｍ、または２０〜２５０ｎｍである。例として、本発明によるナノファイバー（１）は、厚さ２００ｎｍおよび総直径７００ｎｍの外膜（２）を有する。それ以外の場合では、ナノファイバーは、厚さ１００ｎｍおよび総直径３００ｎｍの外膜（２）、または厚さ１００ｎｍおよび総直径４００ｎｍの外膜（２）、または厚さ６０ｎｍおよび総直径２５０ｎｍの外膜（２）を有する。

前記コア（３）は、ナノファイバー（１）自体の長手方向に、好ましくはナノファイバー（１）自体の全長にわたって長手方向に伸びている。

好ましい実施形態において、前記ナノファイバーは、１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を組み込む。前記生物活性分子は、例として、抗腫瘍剤、抗凝固剤（抗凝血剤）、抗血栓性化合物、抗体、ワクチン、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、成長因子、血管新生因子、核酸（例えばｍｉＲＮＡ）、塩、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン、多糖類、ビタミン、抗酸化剤、抗菌剤を含む群から選択される。例として、抗腫瘍薬は、アルキル化剤など（シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、エストラムスチン、ロムスチン、カルムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ブスルファン、トレスルファン、チオテパ、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド）代謝拮抗剤（メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、テガフール、フルダラビン、クラドリビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クロファラビン、ネララビン）、細胞傷害性抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン）、天然由来の誘導体（パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、トラベクテジン、エトポシド、トラベクテジン）、ホルモンおよび拮抗薬（ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、ノルエチステロン、ゴセレリン、ロイプロレリン、トリプトレリン、ランレオチド、オクトレオチド、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、シプロテロン、フルタミド、ビカルタミド、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン）、タンパク質キナーゼ阻害剤（ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ）、モノクローナル抗体（パニツムマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ）を含み得る。

好ましい実施形態では、前記１つ以上の生物活性分子は、水溶性小分子を含む群から選択され、さらにより好ましくは、前記水溶性小分子は細胞障害性作用を有する抗生物質の群に属する。例として、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ゲムシタビンは、本発明によるナノファイバーに担持されるのに特に好適な有効成分である。

前記粒子は、好ましくは、無機系のサブマイクロメートル粒子：量子ドット、磁性ナノ粒子、セラミックおよび金属（例えば、白金、パラジウム、ロジウム、金、銀、銅ベース）、有機系のサブマイクロメートル粒子：リポソーム、ミセル、デンドリマー、高分子ナノ粒子（ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ、ＰＣＬなど）およびナノゲル（ＰＡＡ、ＰＶＰ、ＰＶＡ、アルギン酸塩、キトサン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸）、有機−無機ハイブリッドである。好ましい実施形態において、前記粒子は、上に列挙された１つ以上の生物活性分子を担持し、本発明のナノファイバーのコアを形成するポリマーに含まれる。

前記細胞は、本来の状態または操作された状態の幹細胞、初代または系列細胞である。好ましくは、前記細胞は、幹細胞、間質細胞、胚性細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、白血球、リンパ球、または胚幹細胞（例えばｉＰＳＣ）である。例として、前記細胞は、成長因子をコードする遺伝子で操作される。

好ましい実施形態において、前記ナノファイバーはエレクトロスピニング法により得られる。前記ナノファイバーは、同軸エレクトロスピニングにより得られることを特徴とし、使用される溶液の濃度およびプロセスパラメータを変えることにより、異なる直径および外膜厚さ（２）に対して異なる比率のコア厚さ（３）を有するナノファイバーが得られる。

前記同軸エレクトロスピニング法は、以下の工程を含むが、必ずしも示された順序である必要はない：
ａ）ギ酸中２〜１４％（ｗ／ｗ）の濃度のフィブロイン溶液（ＳＦ）を提供すること、
ｂ）水溶液の水溶性ポリマー溶液を提供すること、
ｃ）オプションで、前記水溶液に前記生物活性分子および／または細胞を添加すること、
ｄ）少なくとも第１のシリンジに前記フィブロイン溶液を充填し、少なくとも第２のシリンジに前記水溶性ポリマー溶液を充填する、少なくとも２つのシリンジを充填すること、
ｅ）シリンジを同軸エレクトロスピニングシステムのポンプシステムに接続すること、
ｆ）エレクトロスピニングプロセスを開始すること。

好ましい実施形態において、前記方法は：
（ａ）ギ酸中、好ましくは純ギ酸中、２％〜１４％、または５％〜１２％、または６％〜１２％、または５％〜１０％、または７％〜１０％、または７〜９％（ｗ／ｗ）の濃度のフィブロイン溶液（ＳＦ）を提供すること。高濃度のフィブロインを含む前記溶液は、典型的には５％（ｗ／ｗ）である市販のフィブロイン水溶液から始まり、水溶液を適切な支持体上に注ぎ、フードの下で乾燥させて、フィブロインフィルムを固化させることで一般的には得られる。さらなる実施形態において、フィブロイン水溶液は、セリシンを含まない天然の絹繊維から始まって、フィブロインフィルムの製造をもたらす当業者に既知のプロセスを適用して調製される。次いで、フィルムをギ酸に溶解し、攪拌下で３０〜１２０分、好ましくは６０〜１２０分以内に溶解が完了する。
ｂ）水溶液の、すなわち、生理食塩水または培地または濃縮水溶液、または水、好ましくは再蒸留水の水溶性ポリマー溶液を提供すること、
ｃ）オプションで、前記水溶液に前記生物活性分子および／または粒子および／または細胞を添加すること、
ｄ）少なくとも第１のシリンジに前記フィブロイン溶液を充填し、少なくとも第２のシリンジに前記水溶性ポリマー溶液を充填する、少なくとも２つのシリンジを充填すること、
ｅ）シリンジを同軸エレクトロスピニングシステムのポンプシステムに接続し、前記接続は、前記充填の前後に関わらず行なわれること、
ｆ）パラメータを以下の範囲：
−流速：０．１〜１０ｍｌ／ｈ、好ましくは０．５〜１ｍｌ／ｈ、
−スピナレット（カソード）と金属コレクタ（アノード）との間の作動距離：５〜１００ｃｍ、好ましくは１０〜８０ｃｍ、
−カソードとアノードとの間の電位差：５〜１００ｋＶ、好ましくは１５〜６０ｋＶ
に設定して、エレクトロスピニングプロセスを開始すること、
を含む。

特に有利な動作条件が実証されており、カソードにおいて−１０ｋＶ、アノードにおいて＋１０ｋＶの電圧で、カソードとアノードとの間の電位差を２０ｋＶとし、またはカソードにおいて−５ｋＶ、アノードにおいて＋１５ｋＶ、またはカソードにおいて−１ｋＶおよびアノードにおいて＋１９ｋＶ、またはカソードにおいて０ｋＶおよびアノードにおいて＋２４ｋＶの電圧を提供する。

好ましい実施形態では、前記水溶性ポリマーはＰＥＯであり、前記ＰＥＯ溶液は、水中、好ましくは再蒸留水中で２〜６％、好ましくは２．５％〜５％（ｗ／ｗ）の濃度を有し、例えば、水にＰＥＯ粉末を添加し、室温で撹拌しながら、好ましくは一晩放置することにより得られる。

好ましくは、前記エレクトロスピニングプロセスは、例えば、アルミニウムシート、高分子膜または布などのエレクトロスピニングにより作製された繊維が付着しない除去可能な層でコーティングされた金属コレクタ、好ましくはアルミニウムシートでコーティングされた静電気金属コレクタによって、吸引を作動させてフードの下で作業することにより行われる。

さらに好ましい実施形態において、前記エレクトロスピニングプロセスは、以下のパラメータを用いて行われる。
−流速：１〜０．５ｍｌ／ｈ、
−スピナレット（カソード）と金属コレクタ（アノード）との間の作動距離：１７〜１９ｃｍ、好ましくは１８ｃｍ、
−印加電圧：アノードを０ｋＶに保ち、カソードを２２〜２６ｋＶにする。

好ましくは、前記ＳＦは１０％であり、前記ＰＥＯは５％であり、それらは２４ｋＶの電圧で１８ｃｍの距離で０．５ｍｌ／時の流速で動作する。

好ましい実施形態において、ＳＫＥＡｄｖａｎｃｅｄＴｈｅｒａｐｉｅｓによって提供される、コレクタがアルミニウムシートでコーティングされているＥ−Ｆｉｂｅｒ（登録商標）プロトタイプ同軸エレクトロスピニング装置が使用される。

好ましくは、安定化化学処理が、前記エレクトロスピニングプロセスに続く。前記安定化処理は、前記プロセスから得られる生成物をアルコール浴、好ましくは水およびアルコール浴に浸漬することを含む。例えば、前記アルコールは、メタノールおよびエタノールから選択され、好ましくはエタノールであり、前記浴中の前記エタノールは５０〜１００％（ｖ／ｖ）である。前記浸漬は、少なくとも１０分間、または２０〜９０分間、好ましくは２０〜４０分間、または３０分間延長される。続いて、このように安定化した生成物は、室温で堆積および乾燥されたアルミニウムシートから引き出され、取り除かれる。

化学安定化処理により、本発明によるナノファイバーは、結晶化プロセスに起因して、水に浸漬された場合であってもナノファイバー構造を保持することができる。

１つ以上の有効成分および／または粒子および／または細胞を担持させる前記のオプションの工程ｃ）において、同じものが前記水溶液に添加され、有効成分の種類、または細胞の有無によって、懸濁液または溶液が形成される。好ましくは、この実施形態において、水溶性ポリマーが前記懸濁液または溶液に添加される。

調製プロセス中に有効成分の局在化を監視することを唯一の目的とする、水中の０．１％ローダミンＢを使用して行った実験では、得られたナノファイバーコアにおいて、典型的なローダミン染色が示された。

さらなる態様において、本発明によるナノファイバーは、本明細書において粉末形態で記載される。前記ナノファイバーは粉砕され、１〜５０００マイクロメートル、好ましくは１０〜１０００マイクロメートルの粒径を有する粉末が得られる。１つの実施形態において、前記粉砕は、手作業で、液体窒素に浸した乳鉢で行うため、１００〜１０００マイクロメートルの粒径および広い分布の粒径を得るか、または乳鉢式のグラインダを動作させるために、分布が狭くより小さな粒径を得られるかである。あるいは、ボールミルなどのミル、または円形チャンバーエアジェット、楕円チャンバーエアジェット、対向エアジェットマイクロナイザーなどのマイクロナイザーなど、当業者に既知のものが適用される。

このようにして得られた粉末は回収され、好ましくは再結晶される。前記再結晶処理は、前記プロセスから得られる生成物をアルコール浴、好ましくは水およびアルコール浴に浸漬することを含む。例えば、前記アルコールは、メタノールおよびエタノールから選択され、好ましくはエタノールであり、前記浴中の前記エタノールは５０〜１００％（ｖ／ｖ）である。前記浸漬は、少なくとも１０分間、または２０〜９０分間、好ましくは２０〜４０分間、または３０分間延長される。再結晶は、例えば、メタノール中で前記粉末を回収し、好ましくは大きな表面を有する容器中、室温で前記懸濁液を乾燥させることにより行われる。続けて、乾燥生成物を水で繰り返し洗浄し、好ましくは再蒸留水中で２回または３回洗浄し、撹拌および遠心分離して、残留溶媒を全て除去する。次に、滅菌を行う。前記滅菌プロセスは、酸化エチル、ガンマ線曝露、ベータ線曝露、紫外線曝露、好ましくは紫外線曝露を使用して行われ得る。

前記ナノファイバーに親水性小分子である有効成分が担持されている場合、ローダミンＢ色素を含むナノファイバーを粉砕し、それが親水性小分子の特性を有することによって示されるように、有効成分が粉砕されたナノファイバーに残ることが本明細書で示された。

さらなる態様において、本発明によるナノファイバーを含むヒドロゲルシステム、および前記システムの調製方法が本明細書に記載されている。

前記ヒドロゲルは、背景技術における既知のヒドロゲルから選択される。前記システムが膀胱用途のために開発される１つの実施形態において、ヒドロゲルは、好ましくはヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸からなる。これは、尿路上皮がグリコサミノグリカンでコーティングされており、例えば、腫瘍の除去のために損傷した前記コーティングは、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸中のヒドロゲルで有利に置き換えられ、グリコサミノグリカンの屈性を示すことができるためである。さらに、ヒアルロン酸は腫瘍細胞によって発現されるＣＤ４４分子に対して接着性があり、膀胱内に存在することにより、腫瘍除去手術後の残存腫瘍細胞の封鎖剤として機能する。

本発明によるヒドロゲル＋ナノファイバーシステムを得るための方法は、記載される通り、オプションで再結晶化および滅菌された粉末状ナノファイバーを得て、最終的に選択されたヒドロゲルの溶液（好ましくは無菌）中に前記粉末状ナノファイバーを分散させることを含む。

１つの実施形態において、前記ナノファイバーは、０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）、または０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）、または０．１〜０．８％（ｗ／ｖ）、または０．２〜０．５％（ｗ／ｖ）の割合で前記ヒドロゲルに分散される。好ましい濃度よりも高濃度であると、システムが高密度になり過ぎて、ゲル形態で運搬するのが困難になる。

ヒドロゲル中に１つ以上の活性分子および／または粒子および／または細胞を含む実施形態において、粉末が分散されているヒドロゲル中に所望の量で同じものが溶解／分散される。

さらなる実施形態において、前記粉末状ナノファイバーは水溶液中に分散される。したがって、本発明はさらに、前記粉末状ナノファイバーを含む水溶液に関する。

本発明はさらに、前記ナノファイバー、および／または前記粉末状ナノファイバー、および／または水溶液中に分散された前記粉末状ナノファイバー、および／またはヒドロゲル中で粉末化されるナノファイバーに関し、ここで、前記ナノファイバーおよび／または前記ヒドロゲルは、有効成分を運ぶため、および／または組織再生の支持体として使用するために、オプションで１つ以上の活性分子および／または粒子および／または細胞を担持している。

例えば、本発明による非粉末状ナノファイバーは、ヘルニアおよび脱出症の封じ込め、再建プロテーゼ（例えば、人工乳房）のための治療において、および末梢神経系（神経）の組織および器官、血管系（血管アクセスのための静脈、動脈、動静脈瘻）、リンパ系（リンパ循環系、リンパ節）、心血管系（冠動脈および心筋）、中枢神経系（脊髄）、皮膚およびその層、内臓を収容および保護するための組織（硬膜、心膜、胸膜、腹膜など）および筋骨格系組織（腱、靭帯、筋肉、骨、軟骨、横隔膜）、呼吸器系（鼻粘膜、気管、喉頭、咽頭、気管支、肺）、消化器系（食道、胃、腸、肛門管の組織）、口腔組織および粘膜（歯茎、歯など）、舌、泌尿器系（腎臓、尿管、膀胱、尿道、副腎）、性および生殖器系（海綿体、前立腺、子宮、外陰部、膣、子宮内膜、卵管）の再生のためのスキャフォールドとして、有利に使用されることを裏付ける証拠がある。

同様に、粉末状および／または水溶液中に分散され、および／またはヒドロゲル中に組み込まれた前記ナノファイバーは、前述の段落で列挙された全ての組織の修復および再生のためのシステムおよび／またはスキャフォールドに含まれ得る。

本発明によるナノファイバーをベースとしたシステム（非粉末状、粉末状、水溶液中の分散、ヒドロゲル中の分散）は、例えば、腫瘍の除去後の完全切除または部分切除の場合、病理、外傷または外科的処置による損傷後の組織および／または器官の再生に使用できる。

前記ヒドロゲルがヒアルロン酸＋コンドロイチン硫酸であり、前記有効成分がマイトマイシンＣである好ましい実施形態において、前記システムは膀胱癌の治療、特に腫瘍除去後の治療に有利に適用される。

１つの実施形態において、本発明は、外膜（２）およびコア（３）を含むナノファイバー（１）であって、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）はポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）から作製される、ナノファイバーに関する。

好ましくは、前記ナノファイバーは、２００〜５００ｎｍの直径を有する。好ましくは、前記ナノファイバーのコアは、１つ以上の親水性分子を含む。

１つの実施形態において、本発明はさらに、ナノファイバーを得るための方法に関し、前記方法は：
純ギ酸中６〜１２％、好ましくは８％〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度のフィブロイン溶液（ＳＦ）を提供すること、
水中、好ましくは再蒸留水中で２〜６％、好ましくは２．５％〜５％（ｗ／ｗ）の濃度のＰＥＯ溶液を提供すること、
オプションで、前記水中で１つ以上の親水性小分子を溶解すること、
２つのシリンジに前記溶液を充填し、前記２つのシリンジを同軸エレクトロスピニングシステムのポンプシステムに接続すること、
以下の範囲にパラメータを設定して、エレクトロスピニングプロセスを開始すること、
流速：１〜０．５ｍｌ／時、スピナレット（カソード）と金属コレクタ（アノード）との間の作動距離：１７〜１９ｃｍ、好ましくは１８ｃｍ、印加電圧：アノードを０ｋＶに保ち、カソードを２２〜２６ｋＶにする、
を含む。

好ましくは、前記方法は、記載されたプロセスから得られた生成物がメタノールに約３０分間浸漬される安定化工程も含む。

さらなる実施形態において、本発明は、本発明によるナノファイバーを含むヒドロゲルシステムに関し、前記ナノファイバーは粉末化され、１０〜１０００マイクロメートルの粒径を有することを特徴とする。好ましくは、前記ヒドロゲルはヒアルロン酸＋コンドロイチン硫酸を含む。好ましくは、前記ナノファイバーおよび／または前記ヒドロゲルは、好ましくはマイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ゲムシタビンを含む群から選択される有効成分を含む。

さらなる実施形態において、本発明は：
本発明によるナノファイバーを提供すること、
前記ナノファイバーを粉砕して、粒径が１０〜１０００マイクロメートル、好ましくは１００〜１０００マイクロメートルの粉末を得ること、
オプションで、メタノールで再結晶すること、
ヒドロゲル中で分散し、オプションで１つ以上の親水性小分子を添加すること、
を含む、記載されたシステムを得る方法に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、有効成分の担体として、および／または組織再生の担体として使用するための前記システムに関する。好ましくは、前記システムは、有効成分として、膀胱癌の治療に使用するためのマイトマイシンＣを含む。

フィブロインは、生分解性であるにもかかわらず、水性環境に対する耐性が大きいため、キトサンなどの他の生体高分子と比較してフィブロインを使用する場合の利点は明らかである。

さらには、フィブロインは、驚くべき生体模倣能力を有している。これにより、本発明によるナノファイバーシステムは、有効成分の担体であるだけでなく、本発明によるナノファイバーが、それらが配置されるシステムに組み込まれることができるため、それ自体が組織再生の支持体として作用することが可能となる。

さらなる利点は、他のバイオポリマーと比較してフィブロインの粉砕に対しての機械的耐性が非常に大きいことである。例えば、粉末化プロセスが背景技術で既知のキトサン−ＰＥＯナノファイバーのナノファイバー構造を破壊するため、背景技術で既知のキトサン−ＰＥＯナノファイバーで本発明による粉末を得ることはできなかったであろう。したがって、本発明によるナノファイバーを用いてのみ、ナノファイバー構造を維持する粉末を得ることが可能である。

さらに、フィブロインは、プログラム可能な生分解性を有し、すなわち、ナノファイバーの外膜の厚さを変えることにより、フィブロインの生分解性を調節することが可能であるため、ナノファイバー自体のコアに溶解した有効成分の放出を制御することができる。これらの特徴により、in vivoでの放出動態の非常に優れた制御が可能になり、フィブロインの生分解が長期間にわたって細かく調節され、その結果、本発明によるシステムによって運ばれる有効成分の放出が可能となる。

ナノファイバーの手動粉砕で得られるより大きな寸法分布は、ナノファイバー自体に含まれる有効成分の経時的な連続システムによる放出をもたらすのに有利であることが観察されており、これは、より小さな寸法のフラグメントからの放出が早く、より大きな寸法のフラグメントからの放出は遅れることによる。したがって、フラグメントのサイズ分布を大きくすることにより、有効成分の放出を経時的により良く分布させることができる。

実施例１：エレクトロスピニングパラメータおよび開始溶液の濃度を変えることで得られたナノファイバーの特徴付け。

以下の表１は、適用したパラメータおよび得られた結果を示している。表の最後の列は、記載された手順によって得られたナノファイバーの代表的な図を示している。

本発明の目的においては、組み合わせ番号６が特に有利であることが判明した。実際、前記プロセスでは、エレクトロスピニングプロセスがより安定であり、再現性が高いことが分かっている。

実施例２：ヒドロゲル＋ナノファイバーシステムの非毒性試験。

肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を、ヒドロゲル単独で、またはヒドロゲルにヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸が含まれる実施例１の組み合わせ６によるヒドロゲル＋ナノファイバーシステムで処理した。

細胞を観察し、処理から２４時間後と４８時間後にＭＴＴアッセイで生存率を定量化した。

細胞をヒドロゲル＋ナノファイバーシステムに曝露し、２４時間と４８時間でそれぞれ１２４％と８２％の細胞生存率が観察され、ここで、％は対照細胞、すなわちシステムに曝露されていない細胞で測定した１００％に対して表される。ヒドロゲルのみの存在下では、２４時間および４８時間でそれぞれ１１９％および１２６％の細胞生存率が観察された。データは、本発明によるシステムが毒性ではないことを示している。

Claims

外膜（２）およびコア（３）を含み、前記外膜（２）はフィブロインから作製され、前記コア（３）は生体適合性および生分解性ポリマーであるナノファイバー（１）。
前記フィブロインは、絹の天然または組換えタンパク質であり、好ましくは、家畜虫（Ｂｏｍｂｙｘ属、ｍｏｒｉ種）、野生虫（Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、ｐｅｒｎｙｉ、ｙａｍａｍａｉ、ｍｉｌｉｔｔａ、ａｓｓａｍａ種など、Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ属、ｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ種）、クモ（Ａｒａｎｅａｅ目）、ハチ目、ハエ目から、または組換えＤＮＡ技術によって得られるフィブロインを含む群から選択される、請求項１に記載のナノファイバー（１）。
前記生体適合性および生分解性ポリマーは、天然または合成ポリマーであり、単独でまたは組み合わせて使用される、請求項１または２に記載のナノファイバー。
前記ポリマーは、水溶性ポリマーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記ポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸塩、アルブミンを含む群から選択される、１つ以上のポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記ポリマーは、ＰＥＯである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記ナノファイバーは、５０〜２０００ｎｍ、または２００〜６００ｎｍの直径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記ナノファイバーは、２００〜５００ｎｍの直径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記外膜（６）の厚さは、１０〜７５０ｎｍ、または２０〜２５０ｎｍである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記外膜（２）が２００ｎｍの厚さを有し、前記ナノファイバーが７００ｎｍの直径を有するか、または厚さ１００ｎｍおよび直径３００ｎｍの外膜（２）、または厚さ１００ｎｍおよび直径４００ｎｍの外膜（２）、または厚さ６０ｎｍおよび直径２５０ｎｍの外膜（２）を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記コア（３）は、長手方向、好ましくは前記ナノファイバー（１）の全長にわたって伸びている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記コア（３）は、１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記生物活性分子は、抗腫瘍剤、抗凝固剤、抗血栓性化合物、抗体、ワクチン、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、成長因子、血管新生因子、核酸（例えばｍｉＲＮＡ）、塩、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン、多糖類、ビタミン、抗酸化剤、抗菌剤を含む群から選択される、請求項１２に記載のナノファイバー。
前記生物活性分子は、好ましくはシクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、エストラムスチン、ロムスチン、カルムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ブスルファン、トレスルファン、チオテパ、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミドであるアルキル化剤など；好ましくはメトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、テガフール、フルダラビン、クラドリビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クロファラビン、ネララビンである代謝拮抗剤；好ましくはダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンである細胞傷害性抗生物質；好ましくはパクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、トラベクテジン、エトポシド、トラベクテジンである天然由来の誘導体；好ましくはジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、ノルエチステロン、ゴセレリン、ロイプロレリン、トリプトレリン、ランレオチド、オクトレオチド、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、シプロテロン、フルタミド、ビカルタミド、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタンであるホルモンおよび拮抗薬；好ましくはダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブであるタンパク質キナーゼ阻害剤；好ましくはパニツムマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブであるモノクローナル抗体、などの抗腫瘍化合物を含む群から選択される、請求項１２または１３に記載のナノファイバー。
前記生物活性分子は、親水性小分子を含む群から選択される、請求項１２または１３に記載のナノファイバー。
前記小分子は、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ゲムシタビンなどの細胞障害性作用を有する抗生物質の群に属する、請求項１５に記載のナノファイバー。
前記粒子は、好ましくは無機系、有機系、及び有機−無機ハイブリットである、請求項１２に記載のナノファイバー。
前記細胞は、本来の状態または操作された状態の、幹細胞、初代または系列細胞である、請求項１２に記載のナノファイバー。
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のナノファイバーを得る方法であって、前記方法は、必ずしも示された順序である必要はないが、以下の工程：
ａ）ギ酸中２〜１４％（ｗ／ｗ）の濃度のフィブロイン溶液（ＳＦ）を提供すること、
ｂ）水溶液の水溶性ポリマー溶液を提供すること、
ｃ）オプションで、前記水溶液に前記生物活性分子および／または粒子および／または細胞を添加すること、
ｄ）少なくとも第１のシリンジに前記フィブロイン溶液を充填し、少なくとも第２のシリンジに前記水溶性ポリマー溶液を充填して、少なくとも２つのシリンジを充填すること、
ｅ）前記シリンジを同軸エレクトロスピニングシステムのポンプシステムに接続すること、
ｅ）エレクトロスピニングプロセスを開始すること、
を含む方法。
前記フィブロイン溶液（ＳＦ）は、ギ酸中、好ましくは純ギ酸中で、２％〜１４％、または５％〜１２％、または６％〜１２％、または５％〜１０％、または７％〜１０％、または７％〜９％（ｗ／ｗ）の濃度である、請求項１９に記載の方法。
前記水溶液は、生理食塩水または培地または濃縮水溶液、または水、好ましくは再蒸留水である、請求項１９または２０に記載の方法。
請求項１９または２０に記載の方法であって、前記エレクトロスピニングプロセスは、
流速：０．１〜１０ｍｌ／ｈ、好ましくは０．５〜１ｍｌ／ｈ、
スピナレット（カソード）と金属コレクタ（アノード）との間の作動距離：５〜１００ｃｍ、好ましくは１０〜８０ｃｍ、
カソードとアノードとの間の電位差：５〜１００ｋＶ、好ましくは１５〜６０ｋＶ、
の範囲にパラメータを設定することで実施される、方法。
前記カソードが−１０ｋＶおよび前記アノードが＋１０ｋＶ、または前記カソードが−５ｋＶおよび前記アノードが＋１５ｋＶ、または前記カソードが−１ｋＶおよび前記アノードが＋１９ｋＶ、または前記カソードが０ｋＶおよび前記アノードが＋２４ｋＶの電圧を有する、請求項２２に記載の方法。
前記エレクトロスピニングプロセスは、アルミニウムシート、高分子膜または布などのエレクトロスピニングにより作製された繊維が付着しない除去可能な層でコーティングされた金属コレクタによって、吸引を作動させてフードの下で作業することにより行われる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
純ギ酸中６〜１２％、好ましくは８％〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度のフィブロイン溶液（ＳＦ）を提供すること、
水中、好ましくは再蒸留水中で２〜６％、好ましくは２．５％〜５％（ｗ／ｗ）の濃度のＰＥＯ溶液を提供すること、
オプションで、前記水中で１つ以上の親水性小分子を溶解すること、
２つのシリンジに前記溶液を充填し、前記２つのシリンジを同軸エレクトロスピニングシステムのポンプシステムに接続すること、
以下の範囲にパラメータを設定して、エレクトロスピニングプロセスを開始すること：流速：１〜０．５ｍｌ／ｈ、スピナレット（カソード）と金属コレクタ（アノード）との間の作動距離：１７〜１９ｃｍ、好ましくは１８ｃｍ、印加電圧：アノードを０ｋＶに保ち、カソードを２２〜２６ｋＶにする、
を含む、請求項１９に記載の方法。
生成物安定化工程を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
前記安定化工程は、エレクトロスピニングによって得られた生成物をアルコールおよび／または水浴に少なくとも１０分間浸漬することを含む化学処理である、請求項２６に記載の方法。
前記安定化工程中、前記アルコールは、メタノールおよびエタノールから選択され、好ましくはエタノールであり、前記浴中の前記エタノールは５０〜１００％（ｖ／ｖ）である、請求項２６または２７に記載の方法。
前記安定化工程中、前記浸漬は、２０〜９０分間、好ましくは２０〜４０分間、または３０分間延長される、請求項２７または２８に記載の方法。
前記生成物は、約３０分間メタノールに浸漬される、請求項２７に記載の方法。
粉末化され、１〜５０００マイクロメートル、好ましくは１０〜１０００マイクロメートル、または１００〜１０００マイクロメートルの粒径を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のナノファイバー。
請求項３１に記載の粉末状ナノファイバーを含む、水溶液。
請求項３１に記載の粉末状ナノファイバーを含むヒドロゲルであるシステム。
前記粉末状ナノファイバーは、０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）、または０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）、または０．１〜０．８％（ｗ／ｖ）、または０．２〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項３３に記載のシステム。
前記ヒドロゲルは、ヒアルロン酸＋コンドロイチン硫酸を含む、請求項３３または３４に記載のシステム。
前記ヒドロゲルは、１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のシステム。
前記１つ以上の生物活性分子は、抗腫瘍剤、抗凝固剤、抗血栓性化合物、抗体、ワクチン、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、成長因子、血管新生因子、核酸（例えばｍｉＲＮＡ）、塩、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン、多糖類、ビタミン、抗酸化剤、抗菌剤を含む群から選択される、請求項３６に記載のシステム。
前記ナノファイバーおよび／または前記ヒドロゲルは、好ましくはマイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ゲムシタビンを含む群から選択される有効成分を含む、請求項３６に記載のシステム。
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のナノファイバーを提供すること、
前記ナノファイバーを粉砕して、粒径が１〜５０００マイクロメートル、好ましくは１０〜１０００マイクロメートル、または１００〜１０００マイクロメートルの粉末を得ること、
オプションで、再結晶すること、
ヒドロゲル中で分散し、オプションで１つ以上の生物活性分子および／または粒子および／または細胞を添加すること、
を含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載のシステムを得る方法。
ヒトまたは動物の疾患の治療に使用するための、請求項１〜１８、３１、３３〜３８のいずれか一項に記載のナノファイバー。
前記ナノファイバーおよび／または前記ヒドロゲルは、生物活性分子および／または粒子および／または細胞のための担体である、請求項４０に記載のナノファイバーの使用。
前記使用は、組織再生のためである、請求項４０または４１に記載のナノファイバーの使用。
前記使用は、ヘルニアおよび脱出症の封じ込め、再建プロテーゼ（例えば、人工乳房）のための治療において、末梢神経系の組織および器官、血管系（例えば、血管アクセスのための静脈、動脈、動静脈瘻）、リンパ系（例えば、リンパ循環系、リンパ節）、心血管系（例えば、冠動脈および心筋）、中枢神経系（例えば、脊髄）、皮膚およびその層、内臓を収容および保護するための組織（例えば、硬膜、心膜、胸膜、腹膜など）、および筋骨格系の組織（例えば、腱、靭帯、筋肉、骨、軟骨、横隔膜）、呼吸器系（例えば、鼻粘膜、気管、喉頭、咽頭、気管支、肺）、消化器系（例えば、食道、胃、腸）、肛門管の組織、口腔の組織および粘膜（例えば、歯茎、歯、舌）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道、副腎）、性および生殖器系（例えば、海綿体、前立腺、子宮、外陰部、膣、子宮内膜、卵管）の再生のためのスキャフォールドとしてである、請求項４０または４１に記載のナノファイバーの使用。
前記使用は、膀胱癌の治療のためである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のナノファイバーの使用。
前記ナノファイバーは、ヒドロゲル中に存在し、前記システムは、有効成分としてマイトマイシンＣを含む、請求項４０に記載のナノファイバーの使用。