CN115120776B - 一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用，所述用于医学美容的组织填充剂包括流动相和悬浮于流动相中的纳米纤维支架颗粒；所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料和/或生物大分子。本发明还提供了所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法，包括制备纳米纤维支架颗粒，配制流动相，再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。本发明所述用于医学美容的组织填充剂机械性能更好，并且可以调节降解的时间，生物相容性好，还具有诱导组织再生修复的功能，安全性高，使用方便；制备方法简单高效，为产品的推广创造了条件。

Description

一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学美容材料技术领域，尤其涉及一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着生物材料科学及临床医学技术的发展，整形美容行业从手术美容转向了微创非手术美容，推动了微创注射美容类产品的快速发展，提供了一些创伤小、恢复快的美容手段。
目前，常规的组织填充产品包括透明质酸、胶原蛋白、羟基磷灰石、聚乳酸以及自体脂肪颗粒等，这些产品都具有较好的填充效果和一定的生物相容性。常规的透明质酸及胶原蛋白的降解周期较短，这一问题可以通过交联或添加降解时间较长的高分子材料加以解决，但交联的程度较难确定，若交联程度较小，则达不到延长交联时间的效果；若交联程度较大，则会增加使用时的阻力，亲水性也较差，可能还会引起炎症反应，导致硬结或肉芽肿等，此外还存在交联剂残留的安全性风险。高分子材料的亲水性较差，细胞亲和力较弱，同样存在引起炎症的风险。
随着仿生再生材料的发展以及人们对生活品质的更高追求，对医美填充材料不单单满足于单纯的物理填充，还提出了诱导组织再生修复方面的需求。CN108383904A公开了一种胶原纤维的提取方法、胶原纤维在制造组织填充剂上的应用，通过脱细胞的方式制备胶原纤维后，对纤维进行粉碎，然后用生理盐水或磷酸缓冲溶液配置软组织填充剂，这种方法可以保留原有组织的孔隙结构，具有一定的诱导修复和再生功能，但是局限于原有组织的结构，且组织来源受到限制，同时脱细胞方法处理后，纤维结构的成分复杂，可能带来免疫原性等安全性问题，也存在降解周期较短的不足。
因此，如何提供一种可以用于医学美容的填充材料，具有降解时间较长、与组织相容性较好的特点，并且可以诱导组织的修复与再生，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于医学美容的组织填充剂及其制备方法和应用，所述组织填充剂由流动相和悬浮于流动相中的纳米纤维支架颗粒组成，所述纳米纤维支架颗粒由高分子材料和生物大分子复合组成，生物相容性好，降解时间可以调节，并且可以促进组织的再生以及胶原蛋白的生成。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂包括流动相和悬浮于流动相中的纳米纤维支架颗粒；
所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料和/或生物大分子。
本发明中，所述纳米纤维支架颗粒由高分子材料和/或生物大分子复合形成，生物相容性好，并且可以通过调节二者的比例或选择不同的材料来对降解时间进行控制；所述纳米纤维支架颗粒具有组织工程支架的作用，有助于细胞的黏附生长，实现了周围自体组织向填充物内部的嵌入式生长，保证了填充物在预设位置的长期稳定固定，并且可以避免传统的膨体填充物封闭孔导致的容易感染的问题；此外，纳米纤维支架颗粒具有贯穿孔隙，比表面积更大，可以更加均匀地分散在溶液中，不易聚集形成结节及包囊，安全性更高；相比于仅具有单一流动相的填充剂，添加纳米纤维支架颗粒可以提升机械性能，起到更好的填充及支撑效果。
优选地，所述高分子材料的单体包括乳酸、羟基乙酸、己内酯、乙烯醇、乙醇酸、乙二醇或甲基丙烯酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是乳酸或羟基乙酸与乙二醇的组合。
本发明中，所述高分子材料可以是单一物质的聚合物，也可以是多种物质的共聚物和/或嵌段共聚物。例如，所述高分子材料可以是聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述高分子材料的分子量为104～107，例如可以是1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107或5×107。
优选地，所述生物大分子的制备原料包括透明质酸、胶原蛋白、白蛋白、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、纤维蛋白原、变性淀粉、纤维素衍生物或葡聚糖中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是透明质酸或胶原蛋白和明胶的组合。
本发明中，所述生物大分子可以是上述制备原料的活性功能片段、水解产物以及它们的交联产物。
优选地，所述生物大分子的分子量为5～400kDa，例如可以是5kDa、10kDa、50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa或400kDa。
优选地，所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料和生物大分子。
优选地，所述高分子材料在所述纳米纤维支架颗粒中的质量分数为51％～99％，例如可以是51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
优选地，所述生物大分子在所述纳米纤维支架颗粒中的质量分数为1％～49％，例如可以是1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或49％。
优选地，以质量分数计，所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料51％～99％和生物大分子1％～49％。
优选地，所述流动相包括缓冲液。
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。
优选地，所述流动相还包括生物大分子和/或生物大分子凝胶。
优选地，所述生物大分子与纳米纤维支架颗粒中的生物大分子相同或不同。
优选地，所述生物大分子凝胶包括生物大分子与交联剂交联形成的凝胶和/或生物大分子相互交联形成的凝胶。
优选地，所述生物大分子和/或生物大分子交联凝胶在所述流动相中的质量分数为0.1％～30％，例如可以是0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％，优选为0.5％～10％。
优选地，所述流动相中还包括麻醉剂。
优选地，所述麻醉剂包括利多卡因。
优选地，所述麻醉剂在所述流动相中的质量分数为0.1％～5％，例如可以是0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，优选为0.1％～1.5％。
优选地，以质量分数计，所述流动相中包括生物大分子和/或生物大分子交联凝胶0.1％～30％和麻醉剂0.1％～5％，余量为缓冲液。
优选地，所述纳米纤维支架颗粒在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为0.1％～80％，例如可以是0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，优选为1％～40％。
优选地，所述流动相在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为20％～99.9％，例如可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％，优选为60％～99％。
优选地，以质量分数计，所述用于医学美容的组织填充剂包括纳米纤维支架颗粒0.1％～80％和流动相20％～99.9％。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，所述制备方法包括：
制备纳米纤维支架颗粒，配制流动相，再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
本发明中，所述制备方法简单合理，科学高效，技术成熟，容易成功，可以实现批量化生产，为产品的推广与使用创造了条件。
优选地，所述制备纳米纤维支架颗粒的方法包括静电纺丝和/或3D打印。
优选地，所述静电纺丝包括将高分子材料和/或生物大分子溶解于溶剂中，进行静电纺丝，制成微观结构为纳米纤维的产品，再粉碎成微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒。
优选地，所述溶剂包括六氟异丙醇、丙酮、氯仿或二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是丙酮或氯仿和二甲基甲酰胺的组合。
优选地，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5～1.5mL/h，例如可以是0.5mL/h、0.6mL/h、0.7mL/h、0.8mL/h、0.9mL/h、1mL/h、1.1mL/h、1.2mL/h、1.3mL/h、1.4mL/h或1.5mL/h。
优选地，所述静电纺丝的喷丝电压为5～30kV，例如可以是5kV、10kV、15kV、20kV、25kV或30kV。
优选地，所述静电纺丝的纺丝距离为10～30cm，例如可以是10cm、11cm、12cm、13cm、14cm、15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm或30cm。
优选地，所述静电纺丝在温度为10～30℃、湿度为不高于45％的条件下进行，温度例如可以是10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，湿度例如可以是20％、25％、30％、35％、40％或45％。
优选地，所述微粒的粒径大小为0.5～800μm，例如可以是0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm或800μm，优选为5～150μm。
优选地，所述3D打印包括将高分子材料和/或生物大分子溶解于溶剂中，进行3D打印，制成微观结构为纳米纤维的产品，再粉碎成微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒。
优选地，所述产品为膜状。
优选地，所述溶剂包括水、六氟异丙醇、丙酮、氯仿或二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是六氟异丙醇或丙酮和氯仿的组合。
优选地，所述3D打印的平台成型温度为-20℃～300℃，例如可以是-20℃、-10℃、0℃、10℃、50℃、100℃、150℃、200℃、250℃或300℃。
优选地，所述3D打印的收集装置与打印针头距离的调控范围为2～10mm，例如可以是2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。
优选地，所述3D打印的平台移动速度为5～200mm/s，例如可以是5mm/s、10mm/s、20mm/s、30mm/s、40mm/s、50mm/s、60mm/s、70mm/s、80mm/s、90mm/s、100mm/s、110mm/s、120mm/s、130mm/s、140mm/s、150mm/s、160mm/s、170mm/s、180mm/s、190mm/s或200mm/s。
优选地，所述3D打印的重复次数为10～50次，例如可以是10次、15次、20次、25次、30次、35次、40次、45次或50次。
优选地，所述微粒的粒径大小为0.5～800μm，例如可以是0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm或800μm，优选为5～150μm。
优选地，所述制成纳米纤维膜后还包括对所得纳米纤维膜进行表面修饰、交联固定或等离子体处理中的任意一种的步骤。
优选地，所述表面修饰所用的材料包括生物大分子。
优选地，所述表面修饰的方法包括层层自组装。
优选地，所述交联固定所用的材料包括交联剂。
作为优选技术方案，本发明所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝和/或3D打印制备纳米纤维支架颗粒；
所述静电纺丝的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于溶剂中，在温度为10～30℃、湿度为不高于45％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5～1.5mL/h，喷丝电压为5～30kV，纺丝距离为10～30cm，制成纳米纤维膜；使用生物大分子对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，或使用交联剂对所得纳米纤维膜进行交联固定，或等离子体进行处理，再粉碎成粒径大小为0.5～800μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
所述3D打印的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于溶剂中，进行3D打印，所述3D打印的平台成型温度为-20℃～300℃，收集装置与打印针头距离的调控范围为2～10mm，平台移动速度为5～200mm/s，重复次数为10～50次，制成纳米纤维膜；使用生物大分子对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，或使用交联剂对所得纳米纤维膜进行交联固定，或等离子体进行处理，再粉碎成粒径大小为0.5～800μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将生物大分子和/或生物大分子交联凝胶溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
本发明中，所述用于医学美容的组织填充剂可以直接使用，也可以将纳米纤维支架颗粒和生物大分子和/或生物大分子凝胶共同冻干储存，使用时溶解于流动相中，或将纳米纤维支架颗粒冻干储存，使用时溶解于流动相中。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的用于医学美容的组织填充剂在制备医学美容材料和/或医学美容药物缓释控释载体材料方面的应用。
本发明中，所述用于医学美容的组织填充剂具有机械性能好、安全性高、降解时间可控、组织相容性高以及促进细胞的黏附与生长等诸多优点，满足了医学美容填充材料对于降解时间、组织相容性及促进组织修复再生的要求，并且可以通过将医学美容药物包裹在纳米纤维支架颗粒内部，通过调节降解时间达到缓释、控释的效果，应用价值极高。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过将纳米纤维支架颗粒分散在流动相中，制备得到的组织填充剂的机械性能更好，填充效果更优，并且可以通过注射的方式进行使用，降低了手术填充可能造成的风险以及使用者的痛苦；所述纳米纤维支架颗粒的比表面积更大，分散更为均匀，降低了包囊和结节出现的风险，安全性更好；所述纳米纤维支架颗粒通过高分子材料和生物大分子复合形成，生物相容性较好，对细胞没有明显的毒性，并且随生物大分子的比例的增加，还可以产生促进细胞增殖的效果；促进填充部位细胞的再生和生长因子的分泌，细胞增殖率均在88％以上，甚至高达145％；并且可以通过选用不同的材料或调节材料之间的比例，达到调节降解时间的效果，在1个月内样品的质量比均不低于53.2％，3个月内样品的质量比均不低于25.4％，6个月内样品的质量比均不低于11.3％；
(2)所述组织填充剂的制备方法简单高效，节能环保，不需要严格的生产环境，在相应的生产车间中可以实现大批量生产，促进了产品的推广与使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例4制备的纳米纤维支架颗粒的1000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝200μm)；
图2为本发明实施例6制备的纳米纤维支架颗粒的1000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝50μm)；
图3为本发明实施例5制备的纳米纤维支架颗粒的5000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝10μm)；
图4为本发明实施例8制备的纳米纤维支架颗粒的5000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝10μm)；
图5为本发明实施例4制备的纳米纤维支架颗粒的10000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝5μm)；
图6为本发明实施例6制备的纳米纤维支架颗粒的10000倍放大的扫描电子显微镜图片(比例尺＝2μm)；
图7A为本发明细胞相容性评价实验中对照组细胞的结果图片(放大倍数为200倍)；图7B为本发明细胞相容性评价实验中实施例4组细胞的结果图片(放大倍数为200倍)；图7C为本发明细胞相容性评价实验中实施例5组细胞的结果图片(放大倍数为200倍)；图7D为本发明细胞相容性评价实验中实施例6组细胞的结果图片(放大倍数为200倍)。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商获得。
材料：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)购自济南聚福凯生物技术有效公司，分子量为12.2w，摩尔比为75:25；
PLA购自济南聚福凯生物技术有效公司，分子量为12.2w；
透明质酸购自华熙福瑞达生物医药有限公司，特性粘数为1.7m3/kg；
透明质酸交联凝胶为公司自制，分子量为1600kDa～9000kDa，取透明质酸，按照比例加入BDDE和NaOH，搅拌10min，50℃水浴5小时。pH值调至中性，磷酸盐缓冲液冲洗，过100目筛；然后加入蒸馏水，搅拌至所需浓度和状态即得透明质酸交联凝胶。
PCL购自sigma公司，分子量为5w；
胶原蛋白为自制，从猪皮中酶解提取；经过SDS电泳鉴别为分子量为30w的I型胶原蛋白；
六氟异丙醇和海藻酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
利多卡因购自北京紫竹药业有限公司；
细胞购自北纳创联生物科技有限公司；
培养基购自Hyclone公司；
MTT试剂购自碧云天生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表1所示。
表1
Figure BDA0002991388440000121
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过3D打印制备纳米纤维支架颗粒，所述3D打印的步骤包括：
将高分子材料溶解于六氟异丙醇中，进行3D打印，所述3D打印的平台成型温度为300℃，收集装置与打印针头距离的调控范围为10mm，平台移动速度为200mm/s，重复次数为10次，制成纳米纤维膜，粉碎成粒径大小为100μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
配置磷酸盐缓冲液，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例2
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表2所示。
表2
Figure BDA0002991388440000122
Figure BDA0002991388440000131
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过3D打印制备纳米纤维支架颗粒，所述3D打印的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于六氟异丙醇中，进行3D打印，所述3D打印的平台成型温度为-20℃，收集装置与打印针头距离的调控范围为2mm，平台移动速度为5mm/s，重复次数为50次，制成纳米纤维膜；使用1,4-丁二醇缩水甘油醚对所得纳米纤维膜进行交联固定，再粉碎成粒径大小为0.5μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸交联凝胶溶解于缓冲液中，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例3
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表3所示。
表3
Figure BDA0002991388440000132
Figure BDA0002991388440000141
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过3D打印制备纳米纤维支架颗粒，所述3D打印的步骤包括：
将PLA和胶原蛋白溶解于六氟异丙醇中，进行3D打印，所述3D打印的平台成型温度为10℃，收集装置与打印针头距离的调控范围为5mm，平台移动速度为50mm/s，重复次数为30次，制成纳米纤维膜；使用海藻酸钠对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，再粉碎成粒径大小为800μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例4
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表4所示。
表4
Figure BDA0002991388440000142
Figure BDA0002991388440000151
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝制备纳米纤维支架颗粒，所述静电纺丝的步骤包括：
将高分子材料溶解于氯仿中，在温度为10℃、湿度为35％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5mL/h，喷丝电压为5kV，纺丝距离为10cm，制成纳米纤维膜，粉碎成粒径大小为0.5μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸溶解于缓冲液中，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例5
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表5所示。
表5
Figure BDA0002991388440000152
Figure BDA0002991388440000161
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝制备纳米纤维支架颗粒，所述静电纺丝的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于六氟异丙醇中，在温度为10℃、湿度为25％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5mL/h，喷丝电压为15kV，纺丝距离为20cm，制成纳米纤维膜，再粉碎成粒径大小为800μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例6
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表6所示。
表6
Figure BDA0002991388440000162
Figure BDA0002991388440000171
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝制备纳米纤维支架颗粒，所述静电纺丝的步骤包括：
将PLGA和透明质酸溶解于六氟异丙醇中，在温度为25℃、湿度为35％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为1mL/h，喷丝电压为25kV，纺丝距离为25cm，制成纳米纤维膜；使用胶原蛋白和透明质酸对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，具体为将所述纳米纤维膜在胶原蛋白酸溶液中浸泡30min，纯水漂洗3次后再在透明质酸水溶液中浸泡30min，交替重复操作15次，组装最外层为胶原蛋白，得到自组装后的纤维膜，冷冻干燥后再粉碎成粒径大小为100μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸交联凝胶溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例7
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表7所示。
表7
Figure BDA0002991388440000172
/>
Figure BDA0002991388440000181
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法与实施例6相同。
实施例8
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表8所示。
表8
Figure BDA0002991388440000182
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝制备纳米纤维支架颗粒，所述静电纺丝的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于六氟异丙醇中，在温度为30℃、湿度为45％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为1.5mL/h，喷丝电压为30kV，纺丝距离为30cm，制成纳米纤维膜；使用1,4-丁二醇缩水甘油醚对所得纳米纤维膜进行交联固定，再粉碎成粒径大小为10μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将透明质酸溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
实施例9
本实施例提供一种用于医学美容的组织填充剂，所述用于医学美容的组织填充剂的原料如表9所示。
表9
Figure BDA0002991388440000191
所述用于医学美容的组织填充剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝制备纳米纤维支架颗粒，所述静电纺丝的步骤包括：
将PLGA和胶原蛋白溶解于六氟异丙醇中，在温度为20℃、湿度为40％的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为1mL/h，喷丝电压为20kV，纺丝距离为20cm，制成纳米纤维膜；使用胶原蛋白以及透明质酸采用层层自组装的方式进行表面修饰，具体为将所述纳米纤维膜于胶原蛋白酸溶液中浸泡30min，纯水漂洗3次后再于透明质酸水溶液中浸泡30min，交替重复操作30次，组装最外层为透明质酸，再粉碎成粒径大小为100μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
(2)配制流动相：
将胶原蛋白溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
(3)再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
对比例1
与实施例5的区别仅在于，本对比例中纳米纤维支架颗粒在制备过程中不进行静电纺丝，将PLGA和胶原蛋白进行物理混合，其余原料及制备方法与实施例5相同。
扫描电子显微镜观察
取样品于样品台上，置于真空喷镀仪内镀导电层，采用场发射扫描电子显微镜观察。对本发明实施例4～6和实施例8制备的纳米纤维支架颗粒进行观察，结果如图1～6所示。图1为实施例4制备的纳米纤维支架颗粒放大1000倍的图片，图2为实施例6制备的纳米纤维支架颗粒放大1000倍的图片，可以看出粉碎后的纳米纤维支架颗粒的大小为30～100μm，表面布满孔隙，可以为细胞攀爬、增殖以及代谢提供支架；图3为实施例5制备的纳米纤维支架颗粒放大5000倍的图片，图4为实施例8制备的纳米纤维支架颗粒放大5000倍的图片，可以明显看到其中的纤维状结构，具有良好的机械支撑性能，内部的贯穿孔径可以提高所述组织填充剂的生物相容性；图5为实施例4制备的纳米纤维支架颗粒放大10000倍的图片，图6为实施例6制备的纳米纤维支架颗粒放大10000倍的图片，可以看出粉碎后的纳米纤维支架颗粒呈现经过静电纺丝后形成的网格状的纳米结构，粉碎后依然保持着纤维结构，具有贯穿孔隙，是一种优良的组织工程支架材料。
体外降解时间评价实验
将实施例1～9和对比例1制备的组织填充剂置于无菌模拟体液中，在37℃下放置，观察降解情况，分别于1个月、3个月以及6个月测定样品的质量比。测量时，5000g离心15min弃去上清液，沉淀用纯化水清洗3次，得到最终沉淀后进行冻干，计算其质量比。
质量比＝降解后样品质量/降解前样品质量×100％。
对结果进行统计，如表10所示。
表10
Figure BDA0002991388440000211
Figure BDA0002991388440000221
由表10可知，组织填充剂的降解时间受原料的种类、纳米纤维支架颗粒与流动相的比例、纳米纤维支架颗粒中高分子材料的比例、流动相中是否含有生物大分子凝胶及是否制成纳米纤维支架颗粒的综合影响，在1个月内样品的质量比均不低于53.2％，3个月内样品的质量比均不低于25.4％，6个月内样品的质量比均不低于11.3％；
实施例4和实施例5中纳米纤维支架与流动相的比例相同，其中实施例4中纳米纤维支架颗粒中的高分子含量较高，流动相中透明质酸的含量也偏高，降解后的质量比较高，这说明纳米支架材料中高分子材料占比越多，降解时间越长；纳米纤维支架颗粒在组织填充剂中占比越高，降解时间越长；同时，组织填充剂中的流动相中添加生物大分子会延长降解时间，此外，添加的生物大分子为交联后的生物大分子，降解周期在原有基础上增加；
实施例8和实施例9中纳米纤维支架颗粒与流动相的比例相同，其中实施例8中纳米纤维支架颗粒中的高分子含量较低，流动相中透明质酸的含量较高，但使用了交联剂进行交联固化，而实施例9中进行了层层自组装，实施例8的降解时间较长，这说明制备的纳米纤维膜用交联剂交联固化也会在一定程度上延长降解时间；
对比实施例5和对比例1，二者的原料及配比完全相同，实施例5采用静电纺丝制成了纳米纤维支架颗粒，而对比例1则将原料进行了物理混合，实施例5的组织填充剂的降解后质量比高于对比例1，这说明将原料制成纳米纤维支架颗粒会延长降解时间；
综合上述结果，表明可以通过选择不同种类的原料、调节纳米纤维支架颗粒与流动相的比例、纳米纤维支架颗粒中高分子材料的比例、向流动相中添加生物大分子或生物大分子凝胶以及制成纳米纤维支架颗粒来控制所述用于医学美容的填充剂的降解时间，应用价值更高。
细胞体外增殖评价实验
将配置好的密度为1×105cells/mL的L929细胞悬液接种于96孔板中，每个孔接种100μL细胞悬液，每组至少接种6孔。将培养板置于37℃、5％CO2细胞培养箱内，培养24h后，弃培养基。将实施例1～9和对比例1制备的纳米纤维支架颗粒与培养基混合，制成混悬液，其中纳米纤维支架颗粒的浓度为1mg/mL。每孔中分别加入混悬液100μL，作为实验组，同时设置加入等量培养基的对照组。各组别细胞在细胞培养箱内培养72h后，每孔加入20μL质量浓度为5g/L的MTT溶液，培养4h后弃去孔内液体，加入150μL DMSO，震荡溶解，酶标仪测定各组别细胞的吸光度并计算细胞的增殖率。
增殖率＝实验组细胞的吸光度值/对照组细胞的吸光度值×100％。
对结果进行统计，如表11所示。
表11
Figure BDA0002991388440000231
/>
Figure BDA0002991388440000241
由表11可知，与对比例1进行比较，实施例1～9制备的组织填充剂的细胞增殖率较高，均在88％以上，甚至高达145％；对比例1中仅将PLGA和胶原蛋白进行了物理混合，因此对细胞增殖的促进作用较差；实施例1～9中制成了纳米纤维支架颗粒，无论是3D打印还是静电纺织制备的的纳米纤维支架颗粒都具有促进细胞增殖的作用，可以作为细胞攀爬的组织工程支架，利于细胞的生长和代谢，同时可以促进成纤维细胞胶原蛋白生成；
此外，实施例1和实施例4中的纳米纤维支架颗粒中仅含高分子材料，对细胞的促进增殖的效果较差，而实施例2～3、实施例5～9中的纳米纤维支架颗粒中同时含有高分子材料和生物大分子，对细胞增殖的促进能力更强，均在92％以上，这说明当高分子材料和生物大分子材料复合以后，可以改善高分子材料的生物相容性，同时生物大分子材料含量越多，生物相容性越高。此外，胶原以及透明质酸类的生物大分子材料同时也具有促进成纤维细胞增殖的作用。
细胞相容性评价实验
将实施例4～6制备的纳米纤维支架颗粒按照0.2g/mL的比例分别分散于培养基中，在37℃下浸提24h。将配置好的密度为1×105cells/mL的L929细胞悬液接种于直径为35mm的培养皿内，每皿接种2mL，置于CO2细胞培养箱内培养，直至汇合形成单层细胞。弃去原培养液，分别加入浸提液2mL，对照组细胞加入2mL培养基，在细胞培养箱内培养72h后，显微镜下观察细胞形态，结果如图7A～图7D所示(其中图7A为对照组，图7B为实施例4，图7C为实施例5，图7D为实施例6)。
从纳米纤维支架颗粒的溶出物对于成纤维细胞生长状况可知，本发明所述用于医学美容的组织填充剂的生物相容性较好，对细胞没有明显的毒性，并且当高分子材料和胶原蛋白/透明质酸等生物大分子材料复合后，可以进一步改善生物相容性，并且随着胶原蛋白/透明质酸含量的增加，浸提液还具有促进细胞增殖作用，帮助细胞的黏附生长以及向填充物内部的嵌入式生长，可以加快受损部位组织的愈合速度。
综上所述，本发明提供了一种用于医学美容的组织填充剂，所述组织填充剂可以通过选用不同的材料或调节材料之间的比例进而对填充剂的降解时间进行调控；所述组织填充剂可以提高细胞的分裂速度，促进细胞的黏附，具有诱导组织再生与修复的功能；与细胞的相容性较好，共同孵育培养后细胞形态正常，无溶解现象，不易形成结节和包囊，安全性更高；制备方法简便，节能高效，应用价值极高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (44)

1.一种用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述用于医学美容的组织填充剂包括流动相和悬浮于流动相中的纳米纤维支架颗粒；
所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料和/或生物大分子；
制备纳米纤维支架颗粒的方法包括静电纺丝和/或3D打印；
所述静电纺丝包括将高分子材料和/或生物大分子溶解于溶剂中，进行静电纺丝，制成微观结构为纳米纤维的膜，再粉碎成微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
所述3D打印包括将高分子材料和/或生物大分子溶解于溶剂中，进行3D打印，制成微观结构为纳米纤维的膜，再粉碎成微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
所述微粒的粒径大小为0.5~800 μm。
2.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述高分子材料的单体包括乳酸、羟基乙酸、己内酯、乙烯醇、乙醇酸、乙二醇或甲基丙烯酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述高分子材料的分子量为104~107。
4.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子的制备原料包括透明质酸、胶原蛋白、白蛋白、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、纤维蛋白原、变性淀粉、纤维素衍生物或葡聚糖中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子的分子量为5~400 kDa。
6.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料和生物大分子。
7.根据权利要求6所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述高分子材料在所述纳米纤维支架颗粒中的质量分数为51%~99%。
8.根据权利要求6所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子在所述纳米纤维支架颗粒中的质量分数为1%~49%。
9.根据权利要求6所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，以质量分数计，所述纳米纤维支架颗粒包括高分子材料51%~99%和生物大分子1%~49%。
10.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述流动相包括缓冲液。
11.根据权利要求10所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。
12.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述流动相还包括生物大分子和/或生物大分子凝胶。
13.根据权利要求12所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子与纳米纤维支架颗粒中的生物大分子相同或不同。
14.根据权利要求12所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子凝胶包括生物大分子与交联剂交联形成的凝胶和/或生物大分子相互交联形成的凝胶。
15.根据权利要求14所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子和/或生物大分子交联凝胶在所述流动相中的质量分数为0.1%~30%。
16.根据权利要求15所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述生物大分子和/或生物大分子交联凝胶在所述流动相中的质量分数为0.5%~10%。
17.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述流动相中还包括麻醉剂。
18.根据权利要求17所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述麻醉剂包括利多卡因。
19.根据权利要求17所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述麻醉剂在所述流动相中的质量分数为0.1%~5%。
20.根据权利要求19所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述麻醉剂在所述流动相中的质量分数为0.1%~1.5%。
21.根据权利要求12或17所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，以质量分数计，所述流动相中包括生物大分子和/或生物大分子交联凝胶0.1%~30%和麻醉剂0.1%~5%，余量为缓冲液。
22.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述纳米纤维支架颗粒在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为0.1%~80%。
23.根据权利要求22所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述纳米纤维支架颗粒在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为1%~40%。
24.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述流动相在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为20%~99.9%。
25.根据权利要求24所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，所述流动相在所述用于医学美容的组织填充剂中的质量分数为60%~99%。
26.根据权利要求1所述的用于医学美容的组织填充剂，其特征在于，以质量分数计，所述用于医学美容的组织填充剂包括纳米纤维支架颗粒0.1%~80%和流动相20%~99.9%。
27.一种如权利要求1~26任一项所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
制备纳米纤维支架颗粒，配制流动相，再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
28.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝过程所用的溶剂包括六氟异丙醇、丙酮、氯仿或二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合。
29.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5~1.5 mL/h。
30.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的喷丝电压为5~30 kV。
31.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的纺丝距离为10~30 cm。
32.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝在温度为10~30℃、湿度为不高于45%的条件下进行。
33.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述微粒的粒径大小为5~150 μm。
34.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述3D打印过程所用的溶剂包括水、六氟异丙醇、丙酮、氯仿或二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合。
35.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述3D打印的平台成型温度为-20℃~300℃。
36.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述3D打印的收集装置与打印针头距离的调控范围为2~10 mm。
37.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述3D打印的平台移动速度为5~200 mm/s。
38.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述3D打印的重复次数为10~50次。
39.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述制成纳米纤维膜后还包括对所得纳米纤维膜进行表面修饰、交联固定或等离子体处理中的任意一种或多种的步骤。
40.根据权利要求39所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述表面修饰所用的材料包括生物大分子。
41.根据权利要求39所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述表面修饰的方法包括层层自组装。
42.根据权利要求39所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述交联固定所用的材料包括交联剂。
43.根据权利要求27所述的用于医学美容的组织填充剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（1）制备纳米纤维支架颗粒：
通过静电纺丝和/或3D打印制备纳米纤维支架颗粒；
所述静电纺丝的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于溶剂中，在温度为10~30℃、湿度为不高于45%的条件下进行静电纺丝，所述静电纺丝的溶液推进速度为0.5~1.5 mL/h，喷丝电压为5~30 kV，纺丝距离为10~30 cm，制成纳米纤维膜；使用生物大分子对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，或使用交联剂对所得纳米纤维膜进行交联固定，或等离子体进行处理，再粉碎成粒径大小为0.5~800 μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
所述3D打印的步骤包括：
将高分子材料和生物大分子溶解于溶剂中，进行3D打印，所述3D打印的平台成型温度为-20℃~300℃，收集装置与打印针头距离的调控范围为2~10 mm，平台移动速度为5~200mm/s，重复次数为10~50次，制成纳米纤维膜；使用生物大分子对所得纳米纤维膜采用层层自组装的方式进行表面修饰，或使用交联剂对所得纳米纤维膜进行交联固定，或等离子体进行处理，再粉碎成粒径大小为0.5~800 μm的微粒，得到所述纳米纤维支架颗粒；
（2）配制流动相：
将生物大分子和/或生物大分子交联凝胶溶解于缓冲液中，并加入麻醉剂，得到所述流动相；
（3）再将所述纳米纤维支架颗粒分散在所述流动相中，得到所述用于医学美容的组织填充剂。
44.如权利要求1~26任一项所述的用于医学美容的组织填充剂在制备医学美容材料和/或医学美容药物缓释控释载体材料方面的应用。
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