通过超声处理的胶原蛋白和高分子材料制备的人工皮肤
技术领域
本发明属于组织工程的生物材料技术领域,具体涉及一种通过超声处理的胶原蛋白和高分子材料制备的人工皮肤。
背景技术
皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损和异常。对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤移植的方法,这不仅造成供皮区新的创伤缺陷,而且经常受到供皮来源的限制。
为了修复、替代缺损的皮肤组织,各国科学家都致力于人工皮肤的研究,仅美国等少数国家掌握该项技术并实现产业化。国外已经产业化了一些人工皮肤产品,包括Integra、AlloDerm、Biobrane、DermagraftTM等,亦有一些产品处于研发阶段,如ICX-SKN。但是这些产品很多是异体或异种皮经过加工处理得到的,存在着加工成本高,免疫排斥等问题。
现有技术中也有用不同的材料制成的人工合成膜作为人工皮肤。明胶海绵是最早使用的止血吸收敷料,但其引导细胞生长性能不如胶原。多糖类如甲壳糖,糖胺多糖,透明质酸等类材料有促进细胞生长的功能,例如甲壳糖有消炎杀菌、促角质细胞生长作用,为良好的细胞生长基质材料,但随着用量增加,有抑制成纤维细胞生长的作用,同时材料的弹性低,质脆。聚氨酯,涤纶,尼龙,硅橡胶等为生物惰性材料,不降解,不能进行生理代谢,只能用做外层敷料。乙丙交酯等生物降解材料,可降解,可代谢,但如果其分子量小则强度不够,分子量大难溶于水,溶解时出现降解,影响材料的机械强度,并且其降解之后的产物使其周围组织酸度提高,出现无菌性炎症。胶原蛋白为人工皮肤的重要组分,是细胞分化、生长的营养基质,有增加结缔组织修复和再生的作用,但其存在的缺点是无弹性、强度低。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足,提供一种产品材料来源广,生产周期短、保存时间长、价格低廉,适合于临床广泛应用的人工皮肤。
发明人在之前的专利申请中(ZL201310166694.1)曾经使用超声对淀粉进行处理,进一步打散了淀粉分子的结构,大幅提高了其吸水性能。发明人惊奇的发现,在使用胶原蛋白和高分子材料来人工皮肤的制备过程中,如果也使用超声步骤对混合后的材料进行处理,可以使得制备得到的人工皮肤各项性能更接近于真实的皮肤,发明人进一步对超声的各项参数进行了优化,发现超声的功率和强度应当低于之前专利申请中(ZL201310166694.1)所设置的值,其原因可能是过强的超声处理会过度的破坏胶原蛋白和高分子材料的空间连接。
本发明的一个技术方案是:
一种人工皮肤的制备方法,包括将动物中富含胶原蛋白的腱、真皮、软骨或骨组织经工程学或细胞生物学的处理方法制成海绵状胶原膜。
优选的,其包括如下步骤:将腱或真皮组织进行清洗、裁剪、消毒处理、脱脂处理、组织捣碎处理、酸性酶解、盐析和透析处理、消泡处理、交联处理、改性剂处理、超声处理、冷冻干燥和真空干燥;所述动物腱或真皮组织优选为人的异体或哺乳动物中富含胶原的肌腱或软骨组织;进一步优选为牛肌腱、软骨、猪跟腱、鱼皮、异种真皮组织;优选其中所述的牛肌腱组织为胶原蛋白细胞外基质材料。
优选的,所述的消毒处理为在常温下采用广谱消毒液对牛肌腱材料进行浸泡处理;所述消毒液的处理方式优选为:用0.05-5%的过氧乙酸和1-15%的乙醇的混合水溶液浸泡10-60分钟,或者0.1-5%氢氧化钠溶液浸泡4-12小时,5-20%的硫酸新霉素溶液浸泡15-60分钟。
优选的,所述脱脂处理为采用有机溶剂或盐常温下对牛肌腱材料经1-5次浸泡处理,每次浸泡3-12小时;优选所述有机溶剂或盐溶液为选自无水乙醇、甲醇、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、碳酸钠中的一种或多种混合的溶液,优选材料与有机溶剂或盐溶液的质量体积比为1:20-50(g/ml)。
优选的,所述酸性酶解处理为采用酶溶液、酸溶液或盐溶液中的一种或两种以上混合溶液进行浸泡处理;优选所述酶溶液处理为0.2-5%的胃蛋白酶溶液浸泡12-48小时;所述酸溶液处理为0.2-5mol/L醋酸溶液。所述盐溶液处理为0.01-0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸泡1-6小时。优选材料与溶液的质量体积比为1:20-50(g/ml)。
优选的,所述交联处理为采用物理方法将胶原蛋白纤维重组,通过胶原的成核、胶原纤维生长、胶原溶液体系平衡等过程增加材料的纯度和机械强度;具体过程采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0-6.5,胶原溶液终浓度为0.2-1%,置于超声振荡器中,调整温度为20-25℃,频率为20-60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0-7.6之间,置于水浴锅中静置2-6小时,最后经过高速离心处理。
优选的,所述的改性剂处理是采用高分子材料与胶原蛋白材料以一定的物质比例进行物理搅拌方式的混合,优选所述的高分子材料为淀粉、聚乳酸、聚碳酸酯中一种或两种以上混合,优选所述的物质混合比例为10-50:1体积比。
优选的,所述的胶原蛋白溶液消泡处理方法采用抽真空的物理或消泡剂浸泡中的一种或两种方式结合,优选所述的消泡剂处理采用聚醚、有机硅氧烷、磷酸三丁酯溶剂浸泡。
本发明的另一个技术方案是:
一种人工皮肤,为三层或多层夹心支架结构,外表层为高分子薄膜,主要起到物理屏障作用,相当于人体皮肤的表皮层;夹心支架层为上述制备方法制备而成的人工皮肤,供给诱导细胞生长的营养成分,同时作为细胞生长的支架;内层为淀粉薄膜,此种材料具有超强吸水性,且生物相容性较好,在人工皮肤用于创伤术区时,可以吸收创伤组织的炎性渗液,同时增强产品的粘附力,与创面粘附紧密、且具有保湿功能,避免由于患者的无意识活动导致产品脱落。
本发明具有如下优点:本发明的制备工艺简单,本发明的人工皮肤既可以作为人体暂时性的创面覆盖物保护创面,又可以永久性的保留真皮支架生长修复创面,解决了已有人工皮肤产品的价格昂贵、来源受限、制作时间长、保存时间短、二次植皮为机体带来的损伤等缺点。本发明制备的产品材料来源广,生产周期短、保存时间长、价格低廉,适合于临床广泛应用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1
制备人工皮肤,其步骤包括:
取牛肌腱材料,清洗干净,并裁剪成小块,用0.05%的过氧乙酸和1%的乙醇的混合水溶液浸泡10分钟,采用无水乙醇常温下对牛肌腱材料经1次浸泡处理,每次浸泡3小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用0.2%的胃蛋白酶溶液浸泡12小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入30%浓盐水进行盐析。离心4000g,30min。将沉淀融入0.1%醋酸内,置于透析袋内与1mol/L的HCL中透析5h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0,胶原溶液终浓度为0.2%,置于超声振荡器中,调整温度为20℃,频率为20Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0之间,置于水浴锅中静置2小时,最后经过高速离心处理。将其放入真空消泡箱中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例2
制备人工皮肤,其步骤包括:
取牛肌腱材料,清洗干净,并裁剪成小块,用5%的过氧乙酸和15%的乙醇的混合水溶液浸泡60分钟,采用碳酸钠溶液常温下对牛肌腱材料经5次浸泡处理,每次浸泡3小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用5%的胃蛋白酶溶液浸泡48小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:50(g/ml);加入50%浓盐水进行盐析。离心5000g,50min。将沉淀融入0.2%醋酸内,置于透析袋内与2mol/L的HCL中透析15h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在6.5,胶原溶液终浓度为1%,置于超声振荡器中,调整温度为25℃,频率为60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.6之间,置于水浴锅中静置6小时,最后经过高速离心处理。将其浸入有机硅氧烷溶液中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以50:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用4min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例3
制备人工皮肤,其步骤包括:
取软骨,清洗干净,并裁剪成小块,用0.1%氢氧化钠溶液浸泡4小时,采用甲醇常温下对软骨经1次浸泡处理,每次浸泡3小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用0.2%的胃蛋白酶溶液浸泡12小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入30%浓盐水进行盐析。离心4000g,30min。将沉淀融入0.1%醋酸内,置于透析袋内与1mol/L的HCL中透析5h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0,胶原溶液终浓度为0.2%,置于超声振荡器中,调整温度为20℃,频率为20Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0之间,置于水浴锅中静置2小时,最后经过高速离心处理。将其浸入聚醚中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用3min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例4
制备人工皮肤,其步骤包括:
取软骨,清洗干净,并裁剪成小块,用5%氢氧化钠溶液浸泡12小时,采用正丁醇常温下对软骨经5次浸泡处理,每次浸泡12小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用5%的胃蛋白酶溶液浸泡48小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:50(g/ml);加入50%浓盐水进行盐析。离心5000g,50min。将沉淀融入0.2%醋酸内,置于透析袋内与2mol/L的HCL中透析15h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在6.5,胶原溶液终浓度为1%,置于超声振荡器中,调整温度为25℃,频率为60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.6之间,置于水浴锅中静置6小时,最后经过高速离心处理。将其浸入磷酸三丁酯溶液中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以50:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用350w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例5
制备人工皮肤,其步骤包括:
取猪跟腱,清洗干净,并裁剪成小块,用5%的硫酸新霉素溶液浸泡60分钟,采用二氯甲烷常温下对猪跟腱经1次浸泡处理,每次浸泡3小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用0.2mol/L醋酸溶液浸泡12小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入30%浓盐水进行盐析。离心4000g,30min。将沉淀融入0.1%醋酸内,置于透析袋内与1mol/L的HCL中透析5h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0,胶原溶液终浓度为0.2%,置于超声振荡器中,调整温度为20℃,频率为20Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0之间,置于水浴锅中静置2小时,最后经过高速离心处理。将其浸入有机硅氧烷溶液中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用350w功率作用4min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例6
制备人工皮肤,其步骤包括:
取猪跟腱,清洗干净,并裁剪成小块,用5%氢氧化钠溶液浸泡12小时,采用三氯甲烷常温下对猪跟腱经5次浸泡处理,每次浸泡12小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用0.01M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸泡6小时,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入50%浓盐水进行盐析。离心5000g,50min。将沉淀融入0.2%醋酸内,置于透析袋内与2mol/L的HCL中透析15h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在6.5,胶原溶液终浓度为1%,置于超声振荡器中,调整温度为25℃,频率为60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.6之间,置于水浴锅中静置6小时,最后经过高速离心处理。将其放入真空消泡箱中进行消泡处理,将聚乳酸与胶原蛋白材料以50:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用350w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例7
制备人工皮肤,其步骤包括:
取鱼皮材料,清洗干净,并裁剪成小块,用20%的硫酸新霉素溶液浸泡15分钟,采用碳酸钠溶液常温下对鱼皮材料经5次浸泡处理,每次浸泡3小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸泡1小时,材料与溶液的质量体积比为1:50(g/ml);加入30%浓盐水进行盐析。离心4000g,30min。将沉淀融入0.1%醋酸内,置于透析袋内与1mol/L的HCL中透析5h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0,胶原溶液终浓度为0.2%,置于超声振荡器中,调整温度为20℃,频率为20Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0之间,置于水浴锅中静置2小时,最后经过高速离心处理。将其浸入聚醚中进行消泡处理,将聚碳酸酯与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例8
制备人工皮肤,其步骤包括:
取鱼皮材料,清洗干净,并裁剪成小块,用5%的过氧乙酸和15%的乙醇的混合水溶液浸泡60分钟,采用无水乙醇常温下对鱼皮材料经5次浸泡处理,每次浸泡12小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用5%的胃蛋白酶溶液浸泡48小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入50%浓盐水进行盐析。离心5000g,50min。将沉淀融入0.2%醋酸内,置于透析袋内与2mol/L的HCL中透析15h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在6.5,胶原溶液终浓度为1%,置于超声振荡器中,调整温度为25℃,频率为60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.6之间,置于水浴锅中静置6小时,最后经过高速离心处理。将其浸入有机硅氧烷溶液中进行消泡处理,将聚碳酸酯与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用4min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例9
制备人工皮肤,其步骤包括:
取异种真皮基质组织,清洗干净,并裁剪成小块,用20%的硫酸新霉素溶液浸泡60分钟,采用正丁醇常温下对异种真皮基质组织经1次浸泡处理,每次浸泡12小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用5mol/L醋酸溶液浸泡12小时,材料与溶液的质量体积比为1:20(g/ml);加入30%浓盐水进行盐析。离心4000g,30min。将沉淀融入0.1%醋酸内,置于透析袋内与1mol/L的HCL中透析5h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在5.0,胶原溶液终浓度为0.2%,置于超声振荡器中,调整温度为20℃,频率为20Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.0之间,置于水浴锅中静置2小时,最后经过高速离心处理。将其浸入有机硅氧烷溶液中进行消泡处理,将淀粉与胶原蛋白材料以10:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例10
制备人工皮肤,其步骤包括:
取异种真皮基质组织,清洗干净,并裁剪成小块,用5%的过氧乙酸和15%的乙醇的混合水溶液浸泡60分钟,采用二氯甲烷常温下对异种真皮基质组织经5次浸泡处理,每次浸泡12小时;将浸泡后的材料充分捣碎,采用5%的胃蛋白酶溶液浸泡48小时进行浸泡处理,材料与溶液的质量体积比为1:50(g/ml);加入50%浓盐水进行盐析。离心5000g,50min。将沉淀融入0.2%醋酸内,置于透析袋内与2mol/L的HCL中透析15h。采用磷酸盐缓冲液调节胶原溶液体系的PH值在6.5,胶原溶液终浓度为1%,置于超声振荡器中,调整温度为25℃,频率为60Hz。再采用氢氧化钠溶液调节酸碱度得PH值7.6之间,置于水浴锅中静置6小时,最后经过高速离心处理。将其浸入磷酸三丁酯溶液中进行消泡处理,将聚碳酸酯与胶原蛋白材料以50:1的比例进行物理搅拌方式的混合,将混合物置于超声波细胞粉碎机中,用300w功率作用2min(作用2s间歇2s)。将产物经过冷冻干燥和真空干燥后制得海绵状胶原膜,即为所需的人工皮肤。
实施例11:本发明的人工皮肤基本性能指标试验
以上述本发明实施例1-10的产品为实验样品进行各项性能指标测定,其中人工皮肤的抗拉强度、破裂抗力、杨氏模量和泊松比测试方法为:采用电子万能拉力试验机,将样品裁剪成合适规格尺寸例如10×1(cm),以100mm/min的拉伸速率进行力学性能测试;人工皮肤的密度测定方法为:将材料裁剪成正方形,用游标卡尺精确测定样品的长、宽、厚度后并精密称量样品的质量并依据样品的体积和质量计算最终成品的密度;人工皮肤的平均孔径根据扫描电镜图谱经图像分析软件测定;人工皮肤的热变性温度采用差示量热扫描仪测定(测定前样品在PBS缓冲液中溶胀48小时)。本实验测试结果与人体皮肤的相应指标对比,结果如下表所示:
人工皮肤力学性能指标测试结果