CN102325760B - 用于质谱分析法的调整的合成树枝状聚合物校准物 - Google Patents

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Abstract

提供用于质谱分析法的单分散合成树枝状聚合物校准物。所述校准物具有以下特征：合成相对便利及快速、成本比较低、保存期限长、纯度高以及以混合物形式批量合成的可控制性。后一特征使得能够平行制备呈现不连续分子量的有用分布的较高分子量化合物，从而提供多点质谱分析校准标准物。还提供制造和使用所述校准物的方法。

Description

用于质谱分析法的调整的合成树枝状聚合物校准物
相关申请案
本项非临时专利申请要求2009年2月3日提交的美国临时专利申请第61/149,506号、2009年4月8日提交的美国临时专利申请第61/167,708号以及2009年6月10日提交的美国临时专利申请第61/185,665号的权益，各申请以引用方式全文并入。
发明背景
本发明涉及具有连续分支结构的树枝状分子，其中至少一个分支具有第二分支结构。本发明还包括制备所述树枝状分子的方法，其作为飞行时间基质辅助激光解吸/离子化(MALDI-TOF)质谱分析(MS)、电喷雾离子化(ESI-MS)、大气压力化学离子化(APCI-MS)、快速原子轰击(FAB-MS)及其它用于分析分子量大于1000道尔顿的化合物的MS技术的校准物的用途。
质谱分析法(MS)是用于测定样品(例如蛋白质、化合物等)的元素组成的分析技术。它还可用于测定所述样品的化学结构。一般来说，MS包括使样品离子化以产生带电分子(及其片段)及测量其质荷比。
飞行时间质谱法(TOF-MS)是一种离子被电场加速，以动能qV进入无场漂移区的方法，其中q是离子电荷，V是外加电压。因为每个离子的动能是1/2mv2，其中m是质量，v是速度，所以较轻离子具有比较重离子更快的速度。因此，较轻离子比较重离子更快到达漂移区末端的检测器。基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)是一种用于质谱分析的离子化技术，其便于分析生物分子(例如蛋白质、肽和糖)及有机大分子(例如聚合物及其它大分子)。
电喷雾离子化(ESI)是一种大气压力离子化技术，借此技术迫使溶于挥发性溶剂(例如乙腈、CH3OH、CH3Cl、水等)的分析物通过小型带电毛细管(通常为金属)。分析物在溶液中以离子形式存在，且当样品被从毛细管逐出时，其成烟雾状散开。这样增大了带同样电荷的分析物颗粒之间的距离。中性气体载体(例如氮气)常用于自液滴蒸发溶剂。随着溶剂的蒸发，带电分析物分子被聚拢得更近。但同时，分析物分子上的相同电荷迫使其分开。此收缩和扩张过程重复进行，直到样品不含溶剂，成为孤离子。孤离子随后转入质量分析器。
大气压力化学离子化(APCI)也是一种大气压力离子化技术，借此使经过加热管(例如大于400℃)的样品溶液挥发，并借助于氮喷雾作用使之经受电晕放电。APCI是ESI的变化形式，可在改进的ESI源中进行。由放电产生的离子被引入质谱仪。这项技术对于相对极性的半挥发性样品来说是最好的，并且可用作液相色谱-质谱分析法(LC/MS)的界面，这是由于其能适应极高的液体流速(例如1mL/min)。APCI-MS的波普通常含有准分子离子[M+H]+。
快速原子轰击(FAB)使用高能中性原子束，通常为氙或氩，其在真空下撞击固体样品(与基质混合的分析物)，从而引起解吸和离子化。常用基质包括甘油、硫代甘油、3-硝基苄醇(3-NBA)、18-冠-6醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺及三乙醇胺。FAB用于难以进入气相的大生物分子。通过将来自离子源的离子加速穿过电荷交换单元产生高能束。这些离子通过与中性原子碰撞而积累电子，从而形成高能原子束。因为FAB波普往往仅含有少量片段和伪分子离子(例如[M+H]+、[M+Na]+)的信号，所以其适用于测定分子量。但低m/z区通常充满来自基质的信号。
为了对一系列分析工作(包括蛋白质、肽、寡核苷酸及合成聚合物的表征及结构测定)校准质谱仪，需要多种分子量的已知校准物。通常来说，已使用的是蛋白质和肽，这是因为它们具有单分散性(纯样品中只有单一且精确的分子量)，并且它们具有有效的生物来源。实例包括：血管舒缓激肽、促肾上腺皮质激素、胰岛素B链、细胞色素C、脱辅基肌红蛋白、白蛋白、醛缩酶及血管紧张素II。然而，生产(且特别是纯化)这种标准物是费时的，并且在技术上很复杂，导致克数量的费用相当高。此外，这种标准物由于酶不稳定性和酸敏感性的原因而固有地具有较差的保存期限。
合成聚合物则提供了便宜得多的替代物，但其存在的分子量分布宽，这是因为它们的制备采用了在单个单体单元之间的相对未介导的反应(与生物合成相比)，这不可避免地导致分子量的统计分布。这种宽分子量分布在质谱中通常观察到的是高斯(Gaussian)系列峰，以单体质量的倍数均匀间隔。然而，有效树枝状聚合物合成的进展使合成材料的廉价可测量成本同传统上与生物合成材料相关的精确分子量相结合。
制备“真正”树枝状聚合物(具有高度结构规整性的高支化分子)的两种截然不同的合成路线是已知的。
第一种方法(发散法)首先涉及将支化单体偶合至核分子，产生中间体，然后“活化”中间体以产生表面官能团数量增加的新的更大的分子。重复这两个步骤导致尺寸成指数增长的树枝状分子向外逐层生长。第二种方法(收敛法)涉及经由一个单体单元束缚的周边基团，产生“楔形物”或“树状突”。这些树状突中的两个可与另外的单体分子偶合，产生更大的树状突，并向内继续逐层生长，直到偶合至核。
通常，发散技术在技术上较为简单：大量过剩的小分子与生长中的分子反应，然后(例如通过蒸馏)被移除，提供相对合算且可测量的合成。然而，采用发散技术，偶合反应的数量呈指数方式逐代增加。因此，些许结构杂质在树枝状聚合物中几乎是不可避免的，且不能轻易移除(例如当n为大数时，n个偶合反应的产物的物理性质与n-1个偶合反应的产物的物理性质几乎一致)。结果是，用于诸如MS校准之类的应用的材料确定性较差。
收敛技术具有的独特优点在于，每一偶合涉及数量少且数量恒定的反应(通常2或3个反应)。因此，采用收敛技术可促使反应完成，且可轻易检测到由副反应产生的任何杂质(由于n较小)并移除之。不过，虽然用收敛技术产生的材料确定性良好，但它们的合成要求很高。这就妨碍了它们在除了特殊应用以外的用途的经济性。
因此，本发明的基本技术问题是要通过提供保存期限改善、成本较低且分子量范围宽的单分散校准物克服这些现有技术的难点。此技术问题的解决方案由描述权利要求的实施方案提供。
发明概要
本发明涉及树枝状分子(树枝状聚合物)，其适用于校准质谱分析仪器，特别是适用于MALDI-TOF、ESI、APCI及FAB质谱分析技术以及用于对分子量高于1,000道尔顿的材料进行质量分析的任何其它技术。本发明还涉及合成所述树枝状聚合物的方法以及它们的使用方法。
在一方面中，本发明涉及合成校准物。本发明的合成校准物是经由羟基封端的核分子的“树枝化”及任选随后的“脱保护”步骤合成(“产生”)的树枝状分子(树枝状聚合物)。还任选地，树枝化和脱保护步骤可进行多次(其中每一脱保护步骤继树枝化步骤之后进行，且其中在第一次树枝化步骤之后的每一次树枝化步骤继脱保护步骤之后进行)，以产生具有已知且适用的尺寸的树枝状聚合物。每一轮树枝化/脱保护的树枝状聚合物产物属于同一“代”。例如，以核分子进行的第一次树枝化步骤产生第一代或“G-1”树枝状聚合物。同样，在所得G-1树枝状聚合物上进行的下一个脱保护步骤也产生第一代树枝状聚合物。然而，在G-1脱保护步骤之后的树枝化步骤产生第二代或“G-2”树枝状聚合物。因此，每一轮树枝化和脱保护产生同一“代”树枝状聚合物产物。在一优选实施方案中，本发明涉及不同分子量的树枝状聚合物的混合物，特别是涉及所述树枝状聚合物的特定比例的混合物(例如等摩尔混合物)。特别来说，本发明涉及平行合成的树枝状聚合物的混合物，其中将等摩尔量的具有不同醇官能团数目的核分子混合在一起，并使之经受至少一轮树枝化。任选地，可使所得混合物经受若干轮树枝化和脱保护，以得到在广谱分子量范围上具有已知且适用的尺寸的树枝状聚合物混合物。在这些混合物的每一者中，树枝状聚合物为同一代，且都适用于质谱分析法。另外，因为端基可经树枝化和脱保护而改性，所以本发明的树枝状聚合物在适用于MS的几乎全系列的溶剂、基质和分析物中具有高溶解度。因此，本发明的树枝状聚合物适合用作内部校准物(也就是，在样品制备期间它们可直接与分析物和基质混合)。
在一个实施方案中，提供一种树枝状聚合物组合物，其包含至少一种式(核x)(DrM)x的化合物，或其互变异构形式，或其盐或其溶剂合物，其中x是3到6的整数，且其中：
A)核x表示：
A.1)
当x＝3时；
A.2)
当x＝4时；
A.3)
当x＝5时；
A.4)
当x＝6时；及
A.5)它们的组合；
B)D表示
C)M表示R1 p或R2 p，其中：
C1)R1是：
及
C.2)R2是
及
D)R3是D或M；
E)r是p-1；
F)p是2n-1；
G)n是1到10的整数；及
H)X选自(CQ2)aCQ3和CH2-O-CH2-Ph，其中Q独立地表示H或卤素，Ph表示苯基，且a是0到16的整数。
在一个实施方案中，提供一种树枝状聚合物组合物，其包含至少一种式(核x)(DrM)x的化合物，或其互变异构形式，或其盐或其溶剂合物，其中x是3到6的整数，且其中：
A)核x表示：
A.1)
当x＝3时；
A.2)
当x＝4时；
A.3)
当x＝5时；
A.4)
当x＝6时；及
A.5)它们的组合；
B)D表示
C)M表示R1 p或R2 p，其中：
C.1)R1是：
及
C.2)R2是
及
D)R3是D或M；
E)r是p-1；
F)p是3n-1；及
G)n是1到10的整数。
在一个实施方案中，树枝状聚合物组合物的A.1、A.2、A.3及A.4以约等摩尔量存在。在另一实施方案中，A.1、A.2、A.3及A.4是同位素富集的。在另一实施方案中，A.1、A.2、A.3、A.4、B.1、B.2及R2是同位素富集的。在另一实施方案中，同位素富集是12C同位素富集。
在一个实施方案中，提供制造树枝状聚合物组合物的方法，包括以下步骤：a)提供至少一种选自1，1，1-三羟乙基甲烷、季戊四醇、木糖醇、二季戊四醇及其任意组合的核；b)使该至少一种核经受一轮树枝化；c)任选地，且随后使该至少一种核经受一轮脱保护；d)任选地，且随后重复步骤b)和c)；及任选地，且随后重复步骤d)，由此获得所需的树枝状聚合物组合物。在此实施方案的一方面中，该至少一种核是1，1，1-三羟乙基甲烷、季戊四醇、木糖醇及二季戊四醇的组合。在此实施方案的另一方面中，1，1，1-三羟乙基甲烷、季戊四醇、木糖醇及二季戊四醇的组合为约等摩尔的。在此实施方案的一方面中，树枝化步骤b)包括使用双(5-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷-5-羧)酸酐单体。在此实施方案的另一方面中，步骤b)包括使用式1的化合物(下文)。
在一个实施方案中，提供使用至少一种本发明的树枝状聚合物来校准质谱仪的方法，所述方法包括：提供至少一种本发明的树枝状聚合物，其中所述至少一种树枝状聚合物具有某些物理性质；使所述至少一种树枝状聚合物离子化，以提供所述至少一种树枝状聚合物的一种或多种离子；收集所述一种或多种离子的数据；及使所述数据与所述某些物理性质相关联。
在一个实施方案中，提供测定样品物理性质的方法，所述方法包括：提供至少一种本发明的树枝状聚合物，其中所述至少一种树枝状聚合物具有某些树枝状聚合物的物理性质；提供样品；将样品的至少一部分与至少一种树枝状聚合物的至少一部分合并；相继使样品和至少一种树枝状聚合物离子化，以提供所述至少一种树枝状聚合物的一种或多种离子和所述样品的一种或多种离子；收集所述至少一种树枝状聚合物的所述一种或多种离子和所述样品的一种或多种离子的数据；及使所述数据与所述至少一种树枝状聚合物的所述某些物理性质相关联，由此测定所述样品的物理性质。
在进一步的方面中，本发明涉及经由树枝化羟基封端的核分子及任选随后进行脱保护步骤来制造合成校准物(树枝状聚合物)的方法。在一优选的实施方案中，树枝化和脱保护步骤可进行多次(其中每一次脱保护步骤继树枝化步骤之后进行，且其中在第一次树枝化步骤之后的每一次树枝化步骤继脱保护步骤之后进行)，以产生具有已知且适用的尺寸的树枝状聚合物。第一次树枝化步骤之后的每一次树枝化和脱保护步骤是任选的。每一次树枝化步骤和每一次脱保护步骤产生新的且适用的本发明的树枝状聚合物。特别来说，本发明涉及平行制造合成校准物(树枝状聚合物)的混合物的方法，其中等摩尔量的带有不同数目的醇官能团的核分子被混合在一起并经受至少一轮树枝化。任选地，可使所得混合物经受若干轮树枝化和脱保护，以得到在广谱分子量范围上具有已知且适用的尺寸的树枝状聚合物混合物。在每一所得混合物中，树枝状聚合物为同一代且都适用于质谱分析法。
在又一方面中，本发明涉及使用至少一种本发明的树枝状聚合物校准质谱仪的方法，所述方法包括：1)提供至少一种本发明的树枝状聚合物，其中所述至少一种树枝状聚合物具有某些物理性质；2)使所述至少一种树枝状聚合物离子化，以提供所述树枝状聚合物的一种或多种离子；3)收集所述一种或多种离子的数据；及4)使所述数据与所述某些物理性质相关联。在一优选的实施方案中，本发明涉及测定样品的某些物理性质的方法，所述方法包括：1)提供至少一种本发明的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物具有某些树枝状聚合物的物理性质；2)提供样品，其中所述样品具有某些样品物理性质；3)将样品的至少一部分与树枝状聚合物的至少一部分合并；4)相继使样品和至少一种树枝状聚合物离子化，以提供所述树枝状聚合物的一种或多种离子和所述样品的一种或多种离子；5)收集所述树枝状聚合物的所述一种或多种离子和所述样品的一种或多种离子的数据；及6)使所述数据与至少一种树枝状聚合物的某些物理性质相关联。
附图说明
为了进一步理解本发明的性质、目标和优点，应结合下列图示参考以下的详细说明，其中同样的附注标号表示同样的要素。
图1是显示合成本发明的三官能“C-3”校准物的示意图。
图2是显示合成本发明的四官能“C-4”校准物的示意图。
图3是显示合成本发明的五官能“C-5”校准物的示意图。
图4是显示合成本发明的六官能“C-6”校准物的示意图。
图5是显示平行合成本发明的三、四、五及六官能校准物的示意图。
图6显示本发明的树枝状聚合物1、11、21及31的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图7显示本发明的树枝状聚合物3、13、23及33的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图8显示本发明的树枝状聚合物4、14、24及34的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图9显示本发明的树枝状聚合物5、15、25及35的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图10显示本发明的树枝状聚合物6、16、26及36的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图11显示本发明的树枝状聚合物7、17、27及37的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图12显示本发明的树枝状聚合物8、18、28及38的等摩尔混合物的MALDI-TOF分析结果。
图13显示分子式为C192H176O48的树枝穴状配体(Cav-([G1]-Ph)8的MALDI-TOF分析结果。MALDI-TOF谱示于图13A，树枝穴状配体的结构示于图13B。
图14显示分子式为C66H134O34的PEG 1970 33聚体的MALDI-TOF分析结果。
图15显示分子式为C86H174O44的PEG 1970 43聚体的MALDI-TOF分析结果。
图16显示分子式为C106H214O54的PEG 1970 53聚体的MALDI-TOF分析结果。
图17显示具有式C88H118N16O22S5 +的专有肽JF-1485的MALDI-TOF分析结果。
图18显示树枝状聚合物1(C3-([G-1]Ph)3)、11(C4-([G-1]Ph)4)、21(C5-([G-1]Ph)5)及31(C6-([G-1]Ph)6)的G1混合物的ESI-质谱。样品通过溶于乙腈中并直接注射来制备，不添加平衡离子。残余钠产生的质谱经观测具有单一的钠阳离子。
图19显示树枝状聚合物3(C3-([G-2]Ph2)3)、13(C4-([G-2]Ph2)4)、23(C5-([G-2]Ph2)5)及33(C6-([G-2]Ph2)6)的G1混合物的ESI-质谱。样品通过溶于乙腈中并直接注射来制备，不添加平衡离子。残余钠产生的质谱经观测，对于树枝状聚合物3，具有单一的钠阳离子，以及对于树枝状聚合物13、23及33，具有双电荷的络合物(两个钠阳离子)。
发明详述
在进一步描述主题发明之前，应理解的是，本发明不限于下面的公开内容所描述的具体实施方案，因为可以对具体的实施方案进行更改，但仍属于所附权利要求的范围之内。还应理解的是，所用术语的目的是为了描述具体的实施方案，并非旨在进行限制。反而，本发明的范围将由所附的权利要求来确定。
在本说明书和所附权利要求中，除上下文明确地另有规定外，单数形式的“一”、“一个”及“所述”包括复数个指代物。除另有定义外，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文所用的术语“[M+Ag]+”表示在样品离子化期间，每个分子附连一个银阳离子作为平衡离子。其它平衡离子可以包括例如但不限于本领域普通技术人员很容易意识到的“H”、“Na”和“K”。本文所用的术语“m/z”表示质荷比。本文所用的“MW”表示分子量。
最近开发的发散性脂族聚(酯)合成似乎拥有两种技术的优点，同时也最大限度地减少了两者的缺点。发散性树枝状合成是一种反复过程，其涉及到质量随着两个合成步骤的每一次重复而以确定性良好的方式(虽然呈指数方式)增加，这两个合成步骤是“偶合步骤”和“脱保护步骤”。例如在图1中，“偶合步骤”(例如图1中的步骤“i”)涉及核结构中的特定数目的醇官能团(-OH基团)与苯亚甲基保护的双MPA酸酐(IUPAC名称为双(5-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷-5-羧)酸酐单体)(图1中的“单体”)的反应。如此一来，精确数目的单体单元连接于核分子上，产生具有不连续分子量的新树枝状分子。在“脱保护步骤”(例如图1中的步骤“ii”)中，使用钯催化剂(负载在石墨上的氢氧化钯(II)，也称为Pearlman催化剂)通过氢解反应移除苯亚甲基保护基以产生新的核。应该指出，如此一来，在进行偶合与脱保护的每一次重复之后，醇官能团的数目加倍，因此使得所述过程得以重复，并且结构呈指数方式(但以良好受控的方式)增长，并因此产生单分散产物。因为偶合步骤涉及醇官能团与酸酐的完全的、高度活化的酯化反应，所以反应可以“定量”的产率(大于99.9％)进行，没有副产物。此外，许多脱保护步骤(例如，对于相应的苯亚甲基和缩醛保护的单体，钯(“Pd”)催化的氢解和酸催化的水解)可以同样完全和定量的方式进行，提供纯度足以充当质谱分析法的校准物的单分散化合物。同时，此发散方法可提供技术上简单且无需色谱纯化的快速路线，使得能够进行具有成本效益的可测量的生产。
与其它校准物相比，本发明的合成树枝状聚合物校准物具有许多独特的优点。肽和蛋白质已被用作校准的商业标准物，因为传统上讲，这些物质是仅有的可制备及纯化的具有足够高的分子量的单分散聚合物。虽然肽和蛋白质校准物可提供可行的标准，但其保存期限短(因为肽酶具有普遍存在性)且成本高(因为其合成和纯化通常以毫克规模进行)。表1中提供了这些校准物的代表性实例。
来源：西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)
合成校准物具有许多潜在的优点，包括保存期限延长，但直到最近，可以生产的具有价格竞争力的产品只有多分散聚合物(也就是说，它们表现出范围较宽的质量特性)。多物质的存在(以及包括MALDI-TOF、ESI、APCI和FAB在内的MS中不同平衡离子的普遍存在性)使这些物质无法成为替代肽和蛋白质的有吸引力的物质。单分散合成校准物(如P14R)的价格是次最便宜的肽校准物(胰岛素)价格的至少3倍，并且比最便宜的肽校准物(胰岛素B链)贵1,000倍。
相反，本发明的合成树枝状聚合物校准物的生产成本较低。由于此快速合成途径可生产合算但纯度高的树枝状化合物，因此本发明的树枝状聚合物校准物可提供有竞争力的质谱仪校准的解决方案，特别是当采用MALDI-TOF、ESI、APCI或FAB方法时。此外，它们可以混合物的形式合成，由此降低制备、纯化和包装的成本。虽然目前可用的肽和蛋白质校准物被广泛地使用和接受，但本发明的树枝状聚合物校准物的降低的成本及改善的保存期限和溶剂的相容性应该使得它们易于被接受。
对树枝状聚合物给予了标准的命名，以表示它们的构造。例如，在名称“CX-([G-n]Php)z”和“CX-([G-n]OHq)z”中，术语“CX”指的是核上的醇官能团数目(“核数目”)，其中“X”是整数。因此，“C3”指的是1，1，1-三羟乙基甲烷(三醇)作为核，“C4”指的是季戊四醇(四醇)作为核，“C5”指的是木糖醇(五醇)作为核，C6指的是二季戊四醇(六醇)作为核。术语“G-n”指的是代数，其表示已加入的支化点的层数，并且其还指已进行的偶合与脱保护重复的次数。例如，“[G-1]”表示“第一代”，并且表明已发生一轮偶合(参见，例如图1的树枝状聚合物1：“C3-([G-1]Ph)3”)或者已发生一轮偶合与脱保护(参见，例如图1的树枝状聚合物2：“C3-([G-1]OH2)3”)。换句话说，树枝状聚合物1和2是同一代：第一代或“G-1”。每一起始的醇带有楔形的树枝状部分，被称为“树状突”。端基(每个树状突)在苯亚甲基保护的结构(其中“p”值为2n-1)中由Php标记，或者在羟基化结构(其中“q”值为2n)中由OHq标记，且其中“p”和“q”表示每个树状突(每个楔形树枝状部分)的端基的数目。最后，每个核的树状突数目(相当于核数目)由“z”表示。
实施例1
一般合成程序
制备树枝状校准物的一般程序通常遵循由Grayson等人(Grayson，S.M.；Frechet，J.M.J.Macromolecules，2001；34：6542-6544)和由Ihre等人(Ihre，H.；Padilla de Jesus，O.L.；Frechet，J.M.J J.Am.Chem.Soc.2001；123：5908-5917)公开的内容，各文献均以引用的方式全文并入。如图1中所示，树枝状合成涉及重复两个关键步骤：i)树枝状生长或“树枝化”步骤，其中使“受保护的”单体附连到每个活性周边官能团上；及ii)活化或“脱保护”步骤，其中每一单体被改变，以使表面上暴露更多的活性官能团。连续重复这两个步骤使得周边官能团和分子量呈指数方式增加。
实施例2
制备苯亚甲基保护的双MPA酸酐单体
根据先前Ihre，H.；Padilla de Jesus，O.L.；Frechet，J.M.J J.Am.Chem.Soc.2001，123，5908-5917中报导的合成来制备苯亚甲基保护的双MPA酸酐单体，所述文献以引用方式全文并入。
实施例3
制备CX-([G-n]Php)z的一般树枝化程序
此实施例的程序以示意图形式作为步骤“i”示于图1中(例如由羟基-封端的核合成树枝状聚合物1；由树枝状聚合物2合成树枝状聚合物3；等)。向圆底烧瓶中加入：已知量的羟基封端的核(例如1，1，1-三(羟甲基)乙烷、季戊四醇、木糖醇或二季戊四醇)或树枝状聚合物(例如通式为CX-([G-(n-1)]OHr)z的聚合物，其中“r”值为2(n-1))，视情况而定；1.1当量(每一羟基封端的核或树枝状聚合物的OH)的苯亚甲基保护的双MPA酸酐单体(双(5-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷-5-羧)酸酐单体)；及0.1摩尔当量(每一羟基封端的核或树枝状聚合物的OH)的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。将反应混合物溶于最少量的吡啶中，于(相对于吡啶)两倍量的二氯甲烷中稀释，然后将反应混合物在标准温度和压力下强力搅拌4小时。通过MALDI-TOF MS定期地监视反应以测定偶合度。通过MALDI-TOF MS观察到完成酯化反应后，将烧瓶内容物转移到分液漏斗中，用二氯甲烷稀释，用1M NaHSO4水溶液(硫酸氢钠)萃取三次，并用1M NaHCO3水溶液(碳酸氢钠)萃取三次。在真空中使有机层体积缩减以浓缩样品，沉淀至己烷中并过滤，以得到呈白色粉状沉淀物形式的苯亚甲基保护的树枝状聚合物CX-([G-n]Php)z。然后可将所得沉淀物准备用于经标准方案进行光谱分析。
实施例4
制备CX-([G-n]OHq)z的一般脱保护程序
此实施例的程序以示意图形式作为步骤“ii”示于图1中(例如由树枝状聚合物1合成树枝状聚合物2；由树枝状聚合物3合成树枝状聚合物4；等)。向圆底烧瓶中加入测定量的CX-([G-n]Phr)z，其中“r”值为2(n-1)，并将其溶于足量的二氯甲烷∶甲醇的2∶1溶液中。将Pearlman催化剂(Pd(OH)2/C)加入到反应混合物中，并将烧瓶内容物置于8个大气压(atm)氢气下。在室温下强力地搅拌反应混合物24小时。通过原始MALDI MS数据检验完全脱保护，之后通过过滤移除Pd(OH)2/C。随后在真空中使滤液体积缩减，得到具有式CX-([G-n]OHq)z的透明玻璃状固体。然后可将所得滤液准备用于经标准方案进行光谱分析。
实施例5
合成三官能“C-3”校准物
此实施例5的三官能树枝状聚合物物质示于图1中。
合成C3-([G-1]Ph)3，也就是图1的树枝状聚合物1：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将市售的1，1，1-三(羟甲基)乙烷(IUPAC名称：2-(羟甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇)酯化，以得到C3-([G-1]Ph)3。分子式：C41H48O12。MALDI-TOF MS：MW的理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝839.220。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝839.20。
合成C3-([G-1]OH2)3，也就是图1的树枝状聚合物2：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物1脱保护，以得到C3-([G-1]OH2)3。分子式：C20H36O12。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝491.210。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝491.22。
合成C3-([G-2]Ph2)3，也就是图1的树枝状聚合物3：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物2酯化，以得到C3-([G-2]Ph2)3。分子式：C92H108O30。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝1799.598。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝1799.59。
合成C3-([G-2]OH4)3，也就是图1的树枝状聚合物4：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物3脱保护，以得到C3-([G-2]OH4)3。分子式：C50H84O30。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1187.495。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1187.46。
合成C3-([G-3]Ph4)3，也就是图1的树枝状聚合物5：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物4酯化，以得到C3-([G-3]Ph4)3。分子式：C194H228O66。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+m/z＝3720.354。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝3720.42。
合成C3-([G-3]OH8)3，也就是图1的树枝状聚合物6：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物5脱保护，以得到C3-([G-3]OH8)3。分子式：C110H180O66。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝2580.063。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝2580.10。
合成C3-([G-4]Ph8)3，也就是图1的树枝状聚合物7：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物6酯化，以得到C3-([G-4]Ph8)3。分子式：C398H468O138。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+m/z＝7561.865。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝7559.9。
合成C3-([G-4]OH16)3，也就是图1的树枝状聚合物8：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物7脱保护，以得到C3-([G-4]OH16)3。分子式：C230H372O138。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝5365.256。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝5366.6。
合成C3-([G-5]Ph16)3，也就是图1的树枝状聚合物9：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物8酯化，得到C3-([G-5]Ph16)3。分子式：C806H948O282。MALDI-TOF MS：MW的理论平均值：[M+Ag]+m/z＝15256.1。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝待测定。
合成C3-([G-5]OH32)3，也就是图1的树枝状聚合物10：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物9脱保护，得到C3-([G-5]OH32)3。分子式：C470H756O282。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝10942.0。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝待测定。
实施例6
合成四官能“C-4”校准物
此实施例6的四官能树枝状聚合物物质示于图2中。
合成C4-([G-1]Ph)4，也就是图2的树枝状聚合物11：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将市售的季戊四醇(IUPAC名称：2，2-双(羟甲基)丙烷-1，3-二醇)酯化，得到C4-([G-1]Ph)4。分子式：C53H60O16。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝1059.292。MW观测值：[M+Ag]+m/z＝1059.28。
合成C4-([G-1]OH2)4，也就是图2的树枝状聚合物12：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物11脱保护，得到C4-([G-1]OH2)4。分子式：C25H44O16。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝623.252。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝623.05。
合成C4-([G-2]Ph2)4，也就是图2的树枝状聚合物13：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物12酯化，得到C4-([G-2]Ph2)4。分子式：C121H140O40。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝2339.797。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝2339.85。
合成C4-([G-2]OH4)4，也就是图2的树枝状聚合物14：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物13脱保护，得到C4-([G-2]OH4)4。分子式：C65H108O40。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1551.631。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1551.62。
合成C4-([G-3]Ph4)4，也就是图2的树枝状聚合物15：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物14酯化，得到C4-([G-3]Ph4)4。分子式：C257H300O88。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝4900.805。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝4900.98。
合成C4-([G-3]OH8)4，也就是图2的树枝状聚合物16：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物15脱保护，得到C4-([G-3]OH8)4。分子式：C145H236O88。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝3408.389。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝3408.41。
合成C4-([G-4]Ph8)4，也就是图2的树枝状聚合物17：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物16酯化，得到C3-([G-4]Ph8)4。分子式：C529H620O184。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝10030.5。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝10018.1。
合成C4-([G-4]OH16)4，也就是图2的树枝状聚合物18：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物17脱保护，得到C4-([G-4]OH16)4。分子式：C305H492O184。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝7126.1。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝7123.5。
合成C4-([G-5]Ph16)4，也就是图2的树枝状聚合物19：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物18酯化，得到C4-([G-5]Ph16)4。分子式：C1073H1260O376。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝20281.4。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝待测定。
合成C4-([G-5]OH32)4，也就是图2的树枝状聚合物20：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物19脱保护，得到C4-([G-5]OH32)4。分子式：C625H1004O376。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝14557.6。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝待测定。
实施例7
合成五官能“C-5”校准物
此实施例7的五官能树枝状聚合物物质示于图3中。
合成C5-([G-1]Ph)5，也就是图3的树枝状聚合物21：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将市售的木糖醇(IUPAC名称：戊烷-1，2，3，4，5-五醇)酯化，得到C5-([G-1]Ph)5。分子式：C65H72O20。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝1279.366。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝1279.39。
合成C5-([G-1]OH2)5，也就是图3的树枝状聚合物22：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物21脱保护，得到C5-([G-1]OH2)5。分子式：C30H52O20。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝755.295。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝755.17。
合成C5-([G-2]Ph2)5，也就是图3的树枝状聚合物23：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物22酯化，得到C5-([G-2]Ph2)5。分子式：C150H172O50。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝2879.997。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝2880.01。
合成C5-([G-2]OH4)5，也就是图3的树枝状聚合物24：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物23脱保护，得到C5-([G-2]OH4)5。分子式：C80H132O50。分子式：C150H172O50。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+m/z＝1915.768。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1915.78。
合成C5-([G-3]Ph4)5，也就是图3的树枝状聚合物25：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物24酯化，得到C5-([G-3]Ph4)5。分子式：C320H372O110。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝6081.257。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝6081.51。
合成C5-([G-3]OH8)5，也就是图3的树枝状聚合物26：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物25脱保护，得到C5-([G-3]OH8)5。分子式：C180H292O110。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝4236.715。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝4236.80。
合成C5-([G-4]Ph8)5，也就是图3的树枝状聚合物27：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物26酯化，得到C5-([G-4]Ph8)5。分子式：C660H772O230。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝12493.1。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝12476.0。
合成C5-([G-4]OH16)5，也就是图3的树枝状聚合物28：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物27脱保护，得到C5-([G-4]OH16)5。分子式：C380H612O230。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝8883.9。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝8880.1。
合成C5-([G-5]Ph16)5，也就是图3的树枝状聚合物29：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物28酯化，得到C5-([G-5]Ph16)5。分子式：C1340H1572O470。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝25306.7。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝待测定。
合成C5-([G-5]OH32)5，也就是图3的树枝状聚合物30：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物29脱保护，得到C5-([G-5]OH32)5。分子式：C780H1252O470。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝18173.2。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝待测定。
实施例8
合成六官能“C-6”校准物
此实施例8的六官能树枝状聚合物物质示于图4中。
合成C6-([G-1]Ph)6，也就是图4的树枝状聚合物31：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将市售的二季戊四醇(IUPAC名称：2-[[3-羟基-2，2-双(羟甲基)丙氧基]甲基]-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇)酯化，得到C6-([G-1]Ph)6。分子式：C82H94O25。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+m/z＝1585.514。MW观测值：[M+Ag]+  m/z＝1585.53。
合成C6-([G-1]OH2)6，也就是图4的树枝状聚合物32：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物31脱保护，得到C6-([G-1]OH2)6。分子式：C40H70O25。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝973.410。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝973.34。
合成C6-([G-2]Ph2)6，也就是图4的树枝状聚合物33：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物32酯化，得到C6-([G-2]Ph2)6。分子式：C184H214O61。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝3506.269。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝3506.25。
合成C6-([G-2]OH4)6，也就是图4的树枝状聚合物34：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物33脱保护，得到C6-([G-2]OH4)6。分子式：C100H166O61。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+  m/z＝2365.979。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝2365.98。
合成C6-([G-3]Ph4)6，也就是图4的树枝状聚合物35：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物34酯化，得到C6-([G-3]Ph4)6。分子式：C388H454O133。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝7347.781。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝7347.0。
合成C6-([G-3]OH8)6，也就是图4的树枝状聚合物36：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物35脱保护，得到C6-([G-3]OH8)6。分子式：C220H358O133。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝5151.115。MW观测值：[M+Na]+  m/z＝5151.28。
合成C6-([G-4]Ph8)6，也就是图4的树枝状聚合物37：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物36酯化，得到C6-([G-4]Ph8)6。分子式：C796H934O277。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝14969.7。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝15020.1。
合成C6-([G-4]OH16)6，也就是图4的树枝状聚合物38：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物37脱保护，得到C6-([G-4]OH16)6。分子式：C460H742O277。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝10655.6。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝10722.6。
合成C6-([G-5]Ph16)6，也就是图4的树枝状聚合物39：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将羟基化树枝状聚合物38酯化，得到C6-([G-5]Ph16)6。分子式：C1612H1894O565。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝30346.1。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝待测定。
合成C6-([G-5]OH32)6，也就是图4的树枝状聚合物40：使用5％Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将苯亚甲基保护的树枝状聚合物39脱保护，得到C6-([G-5]OH32)6。分子式：C940H1510O565。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝21802.8。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝待测定。
实施例9
平行合成树枝状聚合物1、11、21及31
在先有技术中，通过混合适量的单独制备和纯化的个别肽，产生混合校准物(calibrant cocktail)，由此制得范围宽的校准物。然而，本文中所述并在图5中示意显示的合成方法提供了制备校准物组的独特方式，其以确定性良好的市售起始材料的混合物开始，并且平行地对它们进行树枝化。
通过连续重复实施例3和4中详述的步骤“i”和“ii”(并且例如图1中所示)，可制备分子量(大致)呈指数方式增加的树枝状聚合物。例如，仅以C-3羟基封端的核开始，连续重复步骤“i”和“ii”可产生分子量大约为730、1690、3610、7450、15100和30500的单分散树枝状聚合物校准物(例如图1的树枝状聚合物1、3、5、7、9等)。以带有不同数目醇官能团的不同核(例如C-4、C-5或C-6羟基封端的核)开始，可有效制备具有宽分布的范围广泛的校准物。
制备校准物混合物的特别有效的方式是使用单批的核混合物(例如，C-3、C-4、C-5和/或C-6核的等摩尔混合物)进行树枝化过程。例如，且如图5中所示，在单次树枝化步骤之后，四种核的混合物将产生一组分子量(银为平衡离子)为839、1059、1279及1585(如图6中所示)的“第一代”树枝状聚合物1、11、21及31。在进一步重复步骤“ii”和“i”之后(也示于图5中)，“第二代”校准物组(3、13、23、33)的分子量为1800、2340、2880及3506(如图7中所示)。按这种方式，连续重复步骤“i”和“ii”使得能快速获得一系列4点组(参见，例如图6-12)。
因为最可取的校准物是许多确定性良好的单分散化合物的混合物(例如，如图5的反应方案和图6-12的光谱所示)，所以本文描述的合成技术具有附加的优点，即，可在一批中同时制备不同的校准物(通过对选定的核混合物进行树枝化)，而不是单独制备每一种物质，并在分离每种产物之后将其混合。因为先前对于制备树枝状聚合物的尝试寻求的是确定性良好的单一产物，所以这种平行方法在降低制备校准物组的成本和功夫方面是无先例且有价值的。
合成CX-([G-1]Ph)z，也就是树枝状聚合物1、11、21及31的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将(三羟甲基)乙烷(C3-OH3)、季戊四醇(C4-OH4)、木糖醇(C5-OH5)及二季戊四醇(C6-OH6)的等摩尔混合物酯化，得到树枝状聚合物1、11、21及31的CX-([G-1]Ph)z混合物。如图6中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝839.220、1,059.293、1,279.367、1,585.514。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝839.20、1,059.28、1,279.39、1585.53。从图6中可了解，树枝状聚合物1、11、21及31的混合物可提供涵盖800-1,600质量范围的有效四点校准。
实施例10
平行合成树枝状聚合物2、12、22及32
合成CX-([G-1]OH2)z，也就是树枝状聚合物2、12、22及32的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用5％ Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将来自实施例9的苯亚甲基保护的树枝状聚合物1、11、21及31的混合物脱保护，得到树枝状聚合物2、12、22及32的CX-([G-1]OH2)z混合物。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝491.210、623.253、755.295、973.410。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝491.22、623.05、755.17及973.34(未显示)。
实施例11
平行合成树枝状聚合物3、13、23及33
合成CX-([G-2]Ph2)z，也就是树枝状聚合物3、13、23及33的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将来自实施例10的羟基官能化树枝状聚合物2、12、22及32的混合物酯化，得到树枝状聚合物3、13、23及33的CX-([G-2]Ph2)z混合物。如图7中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝1,799.598、2,339.797、2,879.997、3,506.269。MW观测值：[M+Ag]+m/z＝1,799.59、2,339.85、2,880.01、3,506.25。从图7可了解，树枝状聚合物3、13、23及33的混合物可提供涵盖1,800-3,600质量范围的有效四点校准。
实施例12
平行合成树枝状聚合物4、14、24及34
合成CX-([G-2]OH4)z，也就是树枝状聚合物4、14、24及34的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用5％ Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将来自实施例11的苯亚甲基保护的树枝状聚合物3、13、23及33的混合物脱保护，得到树枝状聚合物4、14、24及34的CX-([G-2]OH4)z混合物。如图8中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1,187.495、1,551.631、1,915.768、2,365.979。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1,187.46、1,551.62、1,915.78、2,365.98。从图7可了解，树枝状聚合物4、14、24及34的混合物可提供涵盖1,200-2,400质量范围的有效四点校准。
实施例13
平行合成树枝状聚合物5、15、25及35
合成CX-([G-3]Ph4)z，也就是树枝状聚合物5、15、25及35的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用实施例2的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将来自实施例12的羟基官能化树枝状聚合物4、14、24及34的混合物酯化，得到树枝状聚合物5、15、25及35的CX-([G-3]Ph4)z混合物。如图9中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Ag]+ m/z＝3,720.354、4,900.805、6,081.257、7,347.781。MW观测值：[M+Ag]+m/z＝3,720.42、4,900.98、6,081.51及7,348.00。从图9可了解，树枝状聚合物5、15、25及35的混合物可提供涵盖3,600-7,200质量范围的有效四点校准。
实施例14
平行合成树枝状聚合物6、16、26及36
合成CX-([G-3]OH8)z，也就是树枝状聚合物6、16、26、36的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用5％ Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将来自实施例13的苯亚甲基保护的树枝状聚合物5、15、25及35的混合物脱保护，得到树枝状聚合物6、16、26及36的CX-([G-3]OH8)z混合物。如图10中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+m/z＝2,580.063、3,408.389、4,236.715、5,151.115。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝2,580.10、3,408.41、4,236.80、5,151.28。从图10可了解，树枝状聚合物6、16、26及36的混合物可提供涵盖2,500-5,100质量范围的有效四点校准。
实施例15
平行合成树枝状聚合物7、17、27及37
合成CX-([G-4]Ph8)z，也就是树枝状聚合物7、17、27及37的等摩尔混合物(参见，例如图5的反应方案)：使用苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将来自实施例14的羟基官能化树枝状聚合物6、16、26及36的混合物酯化，得到树枝状聚合物7、17、27及37的CX-([G-4]Ph8)z混合物。MALDI-TOFMS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝7,561.9、10,022.8、12,483.8、15,030.8。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝7,562、10,023、12,484、15,031。从图11可了解，树枝状聚合物7、17、27及37的混合物可提供涵盖7,500-15,000质量范围的有效四点校准。
实施例16
平行合成树枝状聚合物8、18、28及38
合成CX-([G-4]OH16)z，也就是树枝状聚合物8、18、28及38的等摩尔混合物：使用5％ Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将来自实施例15的苯亚甲基保护的树枝状聚合物7、17、27及37的混合物脱保护，得到树枝状聚合物8、18、28及38的CX-([G-4]OH16)z混合物。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝5,365.2、7,121.9、8,878.6、10,721.4。MW观测值：[M+Na]+m/z＝5,366.619、7,123.504、8,880.111、10,722.572。从图12可了解，树枝状聚合物8、18、28及38的混合物可提供涵盖5,500-10,500质量范围的有效四点校准。
实施例17
平行合成树枝状聚合物9、19、29及39
合成CX-([G-5]Ph16)z，也就是树枝状聚合物9、19、29及39的等摩尔混合物：使用实施例3的苯亚甲基保护的双MPA酸酐和DMAP，按实施例3的一般树枝化程序将来自实施例16的羟基官能化树枝状聚合物8、18、28及38的混合物酯化，得到树枝状聚合物9、19、29及39的CX-([G-5]Ph16)z混合物。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Ag]+ m/z＝15,244.9、20,266.9、25,288.8、30,396.9。MW观测值：[M+Ag]+ m/z＝待测定。
实施例18
平行合成树枝状聚合物10、20、30及40
合成CX-([G-5]OH32)z，也就是树枝状聚合物10、20、30及40的等摩尔混合物：使用5％ Pd(OH)2/C和氢气，按实施例4的一般脱保护程序将来自实施例17的苯亚甲基保护的树枝状聚合物9、19、29及39的混合物脱保护，得到树枝状聚合物10、20、30及40的CX-([G-5]OH32)z混合物。MALDI-TOF MS：MW理论平均值：[M+Na]+ m/z＝10,935.5、14,548.9、18,162.4、21,861.9。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝待测定。
实施例19
校准物测试-树枝穴状配体
为了检验本发明的校准物获得具有高质量分辨率的精确MALDT-TOF数据的效用，检查树枝穴状配体(单分散合成分子)，结果示于图13A。树枝穴状配体(Cav-([G1]-Ph)8，如图13B中所示)的分子式为C192H176O48。MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+m/z＝3,272.122。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝3,272.06。质量精度：18.9ppm。
实施例20
校准物测试-聚(乙)二醇，PEG 1970
为了进一步检验本发明校准物获得具有高质量分辨率的精确MALDI-TOF数据的效用，检查合成的聚合物PEG 1970(三种不同低聚物的多分散聚合物：33聚体、43聚体和53聚体)。PEG 1970的数均分子量(Mn)是1970，其多分散指数(PDI)是1.05。光谱测定结果示于图14-16。
PEG 1970 33聚体的分子式为C66H134O34。如图14中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1493.865。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1493.96。质量精度：63.6ppm。
PEG 1970 43聚体的分子式为C86H174O44。如图15中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1934.127。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1934.20。质量精度：37.7ppm。
PEG 1970 53聚体的分子式为C106H214O54。如图16中所示，MALDI-TOF MS：MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝2374.389。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝2374.44。质量精度：21.5ppm。
实施例21
校准物测试-专有肽JF-1485
为了进一步检验本发明校准物获得具有高质量分辨率的精确MALDI-TOF数据的效用，检查具有式C88H118N16O22S5 +(且具有专有结构)的肽JF-1485。如图17中所示，MALDT-TOF MS：H+加合物的MW理论精确值：[M+H]+ m/z＝1911.728。MW观测值：[M+H]+m/z＝1911.68。Na+加合物的MW理论精确值：[M+Na]+ m/z＝1933.7102。MW观测值：[M+Na]+ m/z＝1933.69。K+加合物的MW理论精确值：[M+K]+ m/z＝1949.6842。MW观测值：[M+K]+ m/z＝1949.60。质量精度：25.1ppm。
替代的羟基封端的核
如本领域的普通技术人员所了解，经由实施例3的一般树枝化程序，接着(任选)执行实施例4的一般脱保护程序，由此可以合成具有不同于上文所述的各种官能团的树枝状聚合物。这可以(例如但不旨在限于)简单地通过选择不同于上文所公开的羟基封端的核(例如，除了1，1-三(羟甲基)乙烷、季戊四醇、木糖醇或二季戊四醇以外的核)用于实施例3的一般树枝化程序来完成。示例的替代性羟基封端的核包括(但不旨在限于)：三季戊四醇(八个末端羟基)和四季戊四醇(十个末端羟基)。本领域的普通技术人员还可以从以上的描述中理解到，经由实施例3的一般树枝化程序生成的每种树枝状聚合物也可用作替代的羟基封端的核。例如，由C3-([G-2]OH4)3表示的树枝状聚合物(图1的树枝状聚合物4)具有十二个末端OH，每个都可经历一轮树枝化(经由实施例3的一般树枝化程序)。然后所得树枝状聚合物可经历实施例4的一般脱保护程序，以得到另一树枝状聚合物，且可重复进行所述步骤以生成甚至更大的树枝状聚合物。因此，含有约1到数百个末端羟基(-OH)的醇可用于实施例3的一般树枝化程序(优选聚合醇，且包括线性多元醇，如聚(乙烯醇)；和超支化多元醇，如聚(甘油))，接着(任选)进行实施例4的一般脱保护程序，以产生适用于质谱分析法(特别是适用于MALDI-TOF、ESI、APCI及FAB技术)的校准物。此外，这种醇(且优选多元醇)的组合可用于平行合成中(例如，如实施例9-18中所述)，以生成一组在宽m/z比例范围上适用的校准物。
此外，在如实施例3中所述的“偶合”和“树枝化”步骤期间用于隐蔽醇(防止转化为相应酯)的偶合酰化化学方法同样适用于使用同样的试剂将胺转化成酰胺的酰化反应。因此，也可使用聚胺核分子(作为核分子)，包括市售的树枝状聚胺族类，如聚(酰胺-胺)(PAMAM)和聚(丙烯胺)(PPI)树枝状聚合物。
三单体
可通过用羟甲基取代侧甲基将上述苯亚甲基保护的双MPA单体改性，以产生被保护的三单体，如下式1所示：
式1
通过用羟甲基取代苯亚甲基保护的双MPA酸酐单体((双(5-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷-5-羧)酸酐单体)的侧甲基，每一树枝状聚合物层可含有三个分支，而非图1-5中所示的两个分支。换句话说，通过在实施例3的一般树枝化程序中和随后在实施例4的一般脱保护程序中使用式1单体，每一支化点可产生三个分支，而非图1-5中所示的两个分支。例如，通过以1，1，1-三(羟甲基)乙烷开始并使用式1的三单体，用于分别根据实施例3和4的一轮树枝化与脱保护，可产生根据式2(且类似于树枝状聚合物2)的C3校准物C3-([G-1]OH3)3：
式2
可使用亚甲基原酸酯保护式2的-OH基团以进行随后的树枝化和脱保护步骤。
调整树枝状聚合物
因为所述的树枝状聚合物几乎完全来自于双(羟甲基)丙酸单体，所以通过单体结构中的微小变化可容易地调整总体结构的组成。这种调整可包括侧甲基的改性和/或使用12C同位素富集的单体合成树枝状聚合物。
所有原子的确切原子质量接近但不正好是整数。因为较大分子量(MW)的化合物由多原子组成，所以它们具有相当的质量亏损，也就是与名义质量的偏差(每个原子质量的最丰同位素的最接近整数近似的值)。简单来说，质量亏损是整数近似“名义质量”与实测单同位素质量之间的差。质量亏损可用于识别化合物的种类，并可用于区分天然生物分子与非天然改性的生物分子。通过调整树枝状聚合物主链的元素组成，可以调节质量亏损，以确保它们不与天然化合物重叠，并且可以很容易地与天然化合物区别开。这种调整还可以通过简化分析物与校准物之间的差别而有助于自动化的数据分析。因为所公开的树枝状聚合物主要由相同单体的多层构成，所以调整所述单体的元素组成就能够调整所有公开的树枝状聚合物的质量亏损。例如，平均肽每1000道尔顿(Da)分子量可表现出+0.506Da的“平均氨酸”质量亏损。“平均氨酸”是有关元素组成而言的理论“平均”氨基酸(非整数分子式为：C4.9384H7.7583N1.3577O1.4773S0.0417)，并且可用于计算一系列分子量的肽和蛋白质的预期元素组成与质量亏损。羟基官能化的树状突(参见，例如树枝状聚合物2、4、6、8等)每1000Da分子量呈现+0.42±0.02Da的质量亏损，而苯亚甲基官能化的树状突(参见，例如树枝状聚合物1、3、5、7、9等)每1000Da分子量呈现0.39±0.02Da的质量亏损。为了进一步区别此质量亏损，可以对羟基官能化树状突的侧甲基进行改性，或者用多种较长的烷基链或用卤代烷基链进行官能化，而不会对合成程序产生任何显著的影响。这可以通过对苯亚甲基保护的双MPA酸酐单体(双(5-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷-5-羧)酸酐单体)的5-甲基位置进行改性来实现，如下式3所示：
式3
在式3中，X可为：烷基(例如CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或(CH2)nCH3，其中n是0到16的整数)；CH2-O-CH2-Ph，其中Ph表示苯基；CQ3，其中“Q”表示卤素，优选为氟(F)或氯(Cl)(例如CF3、CCl3等)；或(CQ2)nCQ3，其中“Q”表示卤素，优选为氟(F)或氯(Cl)，且其中n是1到16的整数。例如，用三氟甲基替换甲基可显示出相当显著的MW变化，导致每1000Da MW的质量亏损变化达+0.11±0.02Da。也可以通过用具有所需质量亏损的取代基对周边基团进行简单的官能化来修改分子质量亏损。尽管在“X”处进行了改性，但仍可以通过连续重复实施例3的一般树枝化程序和实施例4的一般脱保护程序来进行使用式3的苯亚甲基保护单体的树枝状聚合物合成。
随着含碳分子的分子量的增加，分子中的13C(天然丰度＝1.109％)的天然普遍存在性使其质谱中的分子同位素分布变宽。在约8,000Da以上，相对于多同位素物质而言，对应于单同位素物质(只有12C)的信号是如此之小，以至于很难进行精确的质量测定，原因在于单同位素物质的峰很难在多同位素物质的峰中被识别出来。因此，多同位素物质的存在大大降低了分子量计算的分辨率。以式4为例：
式4，
其可由式C5H12O4表示。因为超过1％的C是13C，所以任何含碳化合物的MS都显示有对应于这些13C同位素的较高分子量信号。随着化合物中碳数目的增加，13C存在于化合物中的可能性也增加。这可见于精确质量为136.07356的式4单体的同位素分布中，其在136.07356处显示出单同位素信号(m/z；100.0％相对信号强度)，在137.07691处为较高分子量的物质(m/z；5.4％相对信号强度)。随着碳含量的增加(例如但不旨在限于500个碳原子/分子)，不同多同位素物质的分子量的统计分布变得如此之宽，以致于难以分辨单个的单同位素峰。12C的天然丰度是98.89％，13C的是1.109％，1H的是99.99％，2H的是0.01％，16O的99.76％，18O的是0.20％，17O的是0.04％。在大部分有机化合物中，13C同位素是最常见的较重同位素。因此，窄化高分子量的同位素分布的最简单方式是以其中13C已减少的构建物质开始，例如，以所有碳均为12C的起始物质开始。因为所述的树枝状聚合物几乎完全来自于双(羟甲基)丙酸单体，所以如果以12C同位素富集的单体进行合成，那么质谱峰的宽化将大幅度减小，可以很容易实现10,000Da以上的高精度校准。虽然由18O所致的同位素宽化非常不明显(因为18O仅占所有O物质的0.201％)，但也可以进行16O同位素富集，以更进一步地提高精度。本文设想的这些同位素富集除了细微地改变反应物和树枝状聚合物产物的分子量之外，预期不会对合成参数产生任何影响。
如实施例3中所述的制备CX-([G-n]Php)z的一般树枝化程序中所示，单体的醇官能团必须“被保护”以控制产生精确单分散结构的重复性树枝状聚合物生长。可同时用苯亚甲基保护两个醇(如实施例3中所述，且如下式5中所示)，本领域的普通技术人员还将会意识到，它们可以用缩丙酮(式6)或其它缩醛或缩酮保护基(参见，例如式7和8，其中R3是H或CH3，R4是Ph、CH3、C6H4OCH3或C6H4NO2，R5是CH2Ph、Si(CH3)3、C6H5NO2、CH2OCH3、C5H9O(四氢吡喃基醚)或SiPh2t-Bu，其中Ph是苯基)进行保护。
式5式6式7式8
保护基的其它实例可见于P.G.M.Wuts和T.W.Greene的“Protective Groups in Organic Synthesis”(第4版，2007，John Wileyand Sons Inc.Hoboken，NJ)中，该文献以引用的方式全文并入本文。此外，也可以作为替代或另外使用许多不稳定的醚键，包括苄基醚、取代的苄基醚和甲硅烷基醚，以实现结构纯的树枝状聚合物的合成。对树枝化程序进行的这种修改属于本发明的范围之内。
本说明书中引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文，如同已明确并单独地指出将每一参考文献以引用的方式并入。任何参考文献的引用是对于其在提交日期之前的公开内容而言，不应看作是承认本发明由于在先发明的原因而不被认为是先于所述参考文献。
应理解的是，上述的每一要素或两个或更多要素合起来也可合适地应用于与上述类型不同的其它类型的方法中。无需进一步分析，上述内容充分地揭示了本发明的要点，以致于其他人通过应用现有的知识，在不省略特征的情况下可以很容易地对其进行改动以适应各种不同应用，所述特征是从现有技术的观点来看清楚地构成所附权利要求阐述的本发明的一般或特殊方面的基本特性的特征。仅以举例的方式给出前述的实施方案；本发明的范围仅由以下的权利要求限定。

Claims (14)

1.一种树枝状聚合物组合物，其包含不同分子量的式(核x)(DrM)x的树枝状聚合物的混合物，或其盐或其溶液，其中x是3到6的整数，且其中：
A)核x表示：
A.1)
当x＝3时；
A.2)
当x＝4时；
A.3)
当x＝5时；
A.4)
当x＝6时；以及
A.5)它们的组合；
B)D表示
C)M表示R1 p或R2 p，其中：
C.1)R1是：
及
C.2)R2是
及
D)R3是D或M；
E)r是p-1；
F)p是2n-1；
G)n是1到10的整数；及
H)X选自(CQ2)aCQ3和CH2-O-CH2-Ph，其中Q独立地表示H或卤素，Ph表示苯基，且a是0到16的整数。
2.一种树枝状聚合物组合物，其包含不同分子量的式(核x)(DrM)x的树枝状聚合物的混合物，或其盐或其溶液，其中x是3到6的整数，且其中：
A)核x表示：
A.1)
当x＝3时；
A.2)
当x＝4时；
A.3)
当x＝5时；
A.4)
当x＝6时，以及
A.5)它们的组合；
B)D表示
C)M表示R1 p或R2 p，其中：
C.1)R1是：
及
C.2)R2是
及
D)R3是D或M；
E)r是p-1；
F)p是3n-1；及
G)n是1到10的整数。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中A.1、A.2、A.3及A.4以约等摩尔量存在。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中A.1、A.2、A.3及A.4以约等摩尔量存在。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中A.1、A.2、A.3、A.4、B、C或其任意组合是同位素富集的。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中B和C是同位素富集的。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述同位素富集是12C同位素富集、16O同位素富集或12C和16C同位素富集。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述同位素富集是12C同位素富集、16O同位素富集或12C和16C同位素富集。
9.一种制造如权利要求1-8任一项中所述的树枝状聚合物组合物的方法，包括以下步骤：
A)提供选自1,1,1-三(羟甲基)乙烷、季戊四醇、木糖醇、二季戊四醇及其任意组合的混合物；
B)使所述核经受一轮树枝化；
C)任选且随后使所述核经受一轮脱保护；
D)任选且随后重复步骤B)和C)；及
E)根据需要，任选且随后重复步骤D)，由此获得所述树枝状聚合物组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核的混合物是1,1,1-三(羟甲基)乙烷、季戊四醇、木糖醇及二季戊四醇的组合。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤B)包括使用双(5-甲基-2-苯基-1,3-二噁烷-5-羧)酸酐单体。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤B)包括使用式1的化合物：
13.一种校准质谱仪的方法，所述方法包括：
A)提供如权利要求1-8任一项中所述的树枝状聚合物的混合物，其中所述树枝状聚合物具有某些物理性质；
B)使所述树枝状聚合物的混合物离子化，以提供所述树枝状聚合物的离子；
C)收集所述离子的数据；及
D)使所述数据与所述某些物理性质相关联。
14.一种测定样品的物理性质的方法，所述方法包括：
A)提供如权利要求1-8任一项中所述的树枝状聚合物的混合物，其中所述树枝状聚合物具有某些物理性质；
B)提供样品；
C)将所述样品的至少一部分与所述混合物的至少一部分合并；
D)相继使所述样品和所述树枝状聚合物的混合物离子化，以提供所述树枝状聚合物的离子和所述样品的一种或多种离子；
E)收集所述树枝状聚合物的混合物的所述离子和所述样品的一种或多种离子的数据；及
F)使所述数据与所述树枝状聚合物的混合物的所述某些物理性质相关联，由此测定所述样品的物理性质。
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