KR101729810B1 - 면역학적 측정용 청색 금 나노 입자, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 측정 방법 - Google Patents

Abstract

피페라진 고리를 갖는 유기 완충제와 제 1 금염의 용액을 반응시켜 핵 금 나노 입자를 형성시키는 핵 형성 공정과, 이어서 그 핵 금 나노 입자의 용액에 제 2 금염의 용액과 환원성을 갖는 유기산을 동시적으로 첨가 반응시켜, 핵 금 나노 입자를 성장시키는 성장 공정을 실시함으로써, 콜로이드 용액으로서 분산된 액이 육안으로 청색을 나타내고, 피페라진 고리를 갖는 유기 완충제, 금, 및 환원성을 갖는 유기산으로 이루어지는 금 나노 입자를 용이하게 제조할 수 있고, 제조한 금 나노 입자를 표지 입자로서 사용하여, 면역학적 측정 방법에 사용할 수 있다.

Description

면역학적 측정용 청색 금 나노 입자, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 측정 방법{BLUE-COLORED GOLD NANOPARTICLES FOR IMMUNOLOGICAL MEASUREMENT, PROCESS FOR PRODUCTION OF SAME, AND MEASUREMENT METHOD USING SAME}

본 발명은, 고도로 선명한 발색성을 갖고, 또한 안정적인 지속성을 가지며, 식별성이 우수한, 면역학적 측정용 표지제, 단백질 염색제로서 유용한 청색 금 나노 입자, 청색 금 나노 입자의 콜로이드액에 관한 것이다. 또, 본 발명의 청색 금 나노 입자의 제조 방법, 및 그것을 사용한 검사 키트 및 그 측정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 청색 금 나노 입자를, 면역 측정계에 있어서의 표지 물질로서 사용하는 면역학적 측정용 표지 물질에 관한 것이다.

최근, 면역 크로마토그래피용 스트립 형식의 이뮤노어세이는, 항체가 갖는 특이적 반응성을 이용하여, 시료액 중의 항원을 검출하는 간편한 체외 진단 키트 혹은 휴대용 진단 장치로서 중요성이 높아지고 있다. 특히, 최근에는, 인플루엔자 바이러스나 세균과 같은 병원체에 대한 감염의 유무를 검사하기 위한 면역 크로마토그래피법에 기초하는 간편한 다항목 검사구 (檢査具) 에 대해서도 연구 개발이 진행되고 있다.

면역학적 측정법에 사용되는 불용성 담체로는, 금속 콜로이드 입자나 라텍스 입자가 범용적으로 사용되지만, 라텍스 입자는 단백질 등의 피표지 물질을 강고하게 담지하기 위한 화학적 관능기의 수식을 행하는 등의 번잡한 제조 공정이 필요하다. 그 때문에, 피표지 물질의 담지가 용이하고, 저렴하게 간편한 제조가 가능한 금 콜로이드 입자가 바람직하게 사용되고 있다.

불용성 담체로 항체를 표지한 이뮤노크로마토그래피법 검사약은, 조작이 간편하고, 검사도 단시간에 끝나는 점에서 범용적으로 사용되고 있지만, 일반적으로 EIA 와 비교하여 감도가 낮고, 양성의 경우에 관찰되는 라인이 명료하지 않다는 등의 문제점이 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위해, 종래부터 실용화되어 있는 금 콜로이드 입자보다 한층 더 고감도이고, 면역학적 측정용 표지제, 단백질 염색제로서 바람직한 여러 가지 금속 콜로이드의 개발이 이루어지고 있다.

특허문헌 1 에서는, 이뮤노크로마토그래피법에서는 백금 콜로이드 입자의 평균 입경이 작기 때문에 발색이 불충분하여, 실용에 적합하지 않기 때문에, 금 콜로이드 입자 (평균 입경：30 ∼ 100 ㎚) 의 표면에 백금을 담지시켜 평균 입경이 50 ∼ 150 ㎚ 인 금속 콜로이드 입자를 제공하고 있다. 그 제조 방법으로는, 용매 중에서 염화금산을 환원하여 금 콜로이드 입자를 생성한 후, 그 금 콜로이드 입자의 존재 하에서 염화백금산을 환원시키고 있다 (특허문헌 1 참조).

또, 특허문헌 2 에서는, 이것을 더욱 개량하여 한층 더 고감도의 금속 콜로이드 입자를 제공하고 있다. 즉, 금 콜로이드 입자 (평균 입경：30 ∼ 100 ㎚) 의 표면에, 평균 입경이 5 ㎚ 인 백금을 담지시킨 금속 콜로이드 입자를 제공하고 있다. 그 제조 방법으로는, 매체 중에서 금 콜로이드 입자를 제조할 때의 환원제의 배합량, 및 백금을 금 콜로이드 입자에 환원 담지할 때의 환원제의 배합량을 특정 범위로 하고, 또 매체 중에 보호 콜로이드 형성제를 실질상 함유하지 않는 제조 방법에 의하고 있다. 이와 같은 보호 콜로이드 형성제로는, 예를 들어, PVA, PVP, 젤라틴 등의 수용성 고분자 물질, 계면 활성제, 고분자 킬레이트제 등이 예시되어 있다 (특허문헌 2 참조).

면역학적 및 면역 세포학적 진단 검사에 있어서 감도의 향상을 위한 다른 수법으로서, 금 졸 극미립자를 알칸티올 (유도체) 로 코팅함으로써, 금졸 표면에 특정 소수성-친수성 밸런스를 부여하여, 염에 의해 야기되는 응집에 내성을 나타내고, 또한 금졸 표면과 외래 단백질의 비특이적 상호 작용을 최소한으로 억제하는 방법이 제공되어 있다 (특허문헌 3 참조).

또 한편으로, 임신 진단용 체외 진단약에 있어서, 종래부터, 일반적으로 실용화되어 있는 적색의 구상 (球狀) 금 콜로이드 입자를, 보다 고감도인 것으로 하기 위한 개량도 이루어지고 있다. 금 콜로이드가 용도에 맞춘 입경이며, 입자 직경 분포가 샤프하고, 균일한 진구상일 것이 요구되어, 그 제조법이 개발되고 있다.

특허문헌 4 에서는, 제 1 금염 용액에 제 1 환원제 (시트르산염) 를 첨가하여, 핵 콜로이드 입자 (평균 입자 직경：12 ∼ 17 ㎚) 를 형성하는 핵 형성 단계, 상기 핵 콜로이드 입자의 용액에, 제 2 금염과 제 2 환원제 (아스코르브산염) 를 동시에 첨가하여 핵 콜로이드를 성장시키는 성장 단계를 포함하고, 상기 성장 단계는 1 회 이상 실시하고 있다. 금 콜로이드 입자의 평균 입자 직경은, 1 회째 성장 단계에서 17 ∼ 55 ㎚ 미만, 2 회째 성장 단계에서 55 ∼ 110 ㎚ 미만, 3 회째 성장 단계에서 110 ∼ 220 ㎚ 로 하고 있어, 그 입경의 표준 편차는 10 ％ 이내로 되어 있다 (특허문헌 4 참조).

임신 진단약과 같이 임신인지 여부와 같은 1 항목만을 검사하는 경우에는, 육안 판정에 해당하여, 1 종류의 표지제를 사용하면 될 것이지만, 최근에는 감기 형태의 감염증이나 호흡기 감염증에 있어서의 바이러스 검사와 같이, 원인 바이러스를 특정할 필요가 있는 경우에는, 다항목 검사를 실시하지 않으면 안 되기 때문에, 환자나 의료 종사자의 부담 경감을 의도하여 다양한 검사 양식이 개발되고 있다.

예를 들어, 래터럴 플로우 타입의 이뮤노어세이법에 의해, 복수의 바이러스 (로타바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스 등) 를, 하나의 검사구에 의해 검출할 수 있는 것이 알려져 있지만, 검출 라인이 복수가 되기 때문에, 육안 판정에 의한 오판정이 일어나기 쉬워진다는 문제점이 있다.

또, 호흡기 감염증에 있어서의 바이러스의 이뮤노크로마토그래피법에 의한 검사에 있어서는, 코, 가래, 및 인두를 면봉으로 닦은 액과 같은 검체를, 검체 처리액으로 전처리하여 복수의 호흡기 감염 검사에 적합한 검사 시료를 조제하고, 이 검사 시료의 각 일부를 사용하여, 제 1 시험구 (試驗具) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 감염증의 검사용), 제 2 시험구 (예를 들어, 아데노바이러스 감염증 또는 RS 바이러스 감염증의 검사용) 와 같은 복수의 시험구에 의해 검사하는 것과 같은 검사 방법도 개발되어 있다 (특허문헌 5 참조).

또한, 임의의 색을 가진 표지 항체 입자를 사용하여 높은 판정 능력을 갖고, 2 종류 이상의 표지 항체 입자를 사용하여 2 종류 이상의 측정 대상물을 동시에 측정할 수 있는, 이뮤노크로마토그래피법을 포함하는 측정 방법이 개발되어 있으며, 구체적으로는, TRITC (흡수 극대：약 550 ㎚, 적색) 와 FITC (흡수 극대：약 500 ㎚, 주황색) 와 같은 발광 색소의 조합을 사용하여, hCG 와 LH 의 동시 측정을 실시하고 있다 (특허문헌 6 참조).

그러나, 1 개의 시험구에 의해, 다항목의 검사를 육안 판정에 의해 동시에 실시하는 경우에는, 표지제나 단백질 염색제로서 동일색이나 동계색의 것인 경우에는, 오판정이나 오진단을 일으킬 우려가 발생하게 된다는 문제점이 있었다. 육안 판정에 의해 오판정이나 오진단이 발생하지 않기 위해서는, 표지제나 단백질 염색제로서 서로 식별성이 높은 색에 의해 육안 판정이 행해지는 것이 바람직하다.

2 색이 혼재하는 경우, 그 식별성은 색의 조합에 따라 상이하다. 적색과 청색은 육안에 의한 색의 식별성이 높은 점에서, 남녀를 식별하는 표시나, 더운 물 (적색) 과 찬물 (청색) 의 표시에 보이는 바와 같이 여러 가지의 상호 식별에 사용되고 있다. 종래부터 실용화되어 있는 금 콜로이드 입자는, 적색의 구상 입자이지만, 색이 다른, 즉 적색에 대해 식별성이 높은 청색의 금 콜로이드 입자가, 표지제나 단백질 염색제로서 사용되게 되면, 육안 판정에 의한 오판정이나 오진단이 현저히 저감될 것으로 생각되지만, 청색의 금 콜로이드 입자는, 아직 실용화되어 있지 않다.

특허문헌 7 ∼ 9 에 있어서는, 금속 나노 입자의 크기, 모양, 구조ㆍ형상 등을 변화시켜 여러 가지의 광 흡수 파장 특성을 갖는 금속 나노 입자에 대하여 기재되어 있다.

그 특허문헌 7 및 8 에는, 청색을 나타내는 금 나노 입자는, 금 나노셸, 나노로드, 나노튜브 또는 나노프리즘 입자의 구조ㆍ형상인 것, 또 금 나노 입자는, (1) 황색을 나타내는 은 나노 입자액 (폴리비닐피롤리돈 및 에틸렌글리콜과 같은 보호제를 함유) 에 환원제를 첨가한 후, 약 100 ℃ 에서 환류시키는 단계, (2) 상기 환류된 반응액에 금염 용액을 주입 반응시키는 단계, (3) 상기 반응물을 상온까지 냉각시킨 후, 0.2 ㎛ 의 마이크로필터를 사용하여 여과하는 단계에 의해 제조하고 있으며, 얻어진 금 나노 입자는, 표층만이 금으로 구성되는 형태 (금 나노셸) 이다. 금 나노로드, 금 나노튜브 또는 금 나노프리즘은, 금 나노 입자의 생성시에 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드 (브롬화물) (C₁₆TAB) 와 같은 계면 활성제를 사용하여 얻어진다는 기재가 있다. 입자의 크기에 대해서는 명확한 기재가 없으며, 그 용도로서는 화장료용 안료의 기재가 있지만, 면역학적 측정법에 있어서의 표지제나 단백질 염색제로서의 사용에 대해서는 기재가 없다 (특허문헌 7, 8 참조).

특허문헌 9 에는, C₁₆TAB (암모늄염의 계면 활성제) 가 존재하는 수용액 중에서 금 이온을 환원제 (아민류) 로 환원하여 로드상의 금 나노 입자를 얻고 있다. 그 금 나노 입자의 애스펙트비 (장축/단축) 는, 병용하는 아민류와 암모늄염의 혼합비를 조정함으로써 제어할 수 있으며, 애스펙트비：2 ∼ 11, 흡수 파장 피크역：658 ∼ 1200 ㎚ 의 금 나노로드가 얻어지고 있다. 검사약에 사용할 수 있다는 기재가 있다 (특허문헌 9 참조).

그러나, 계면 활성제로서 사용한 C₁₆TAB 가, 얻어진 금 나노로드 중에 함유되어 있기 때문에, 검출 항체 등의 단백질의 직접 담지 (수식) 에는 적합하지 않고, 계면 활성제의 제거ㆍ치환 등의 번잡한 조작이 필요하다는 점에서, 면역학적 측정법에 있어서의 검사약에 사용하는 단백질 등의 표지 물질로서는 바람직하다고는 할 수 없다. 또, C₁₆TAB 는 독성을 갖고 있어, 취급의 관점에서도 바람직하다고는 할 수 없다.

비특허문헌 1 에는, 청록색을 나타내는 가지상 금 나노 결정의 콜로이드가 기재되어 있고, 그 가지상 금 나노 결정은, 복잡한 3 차원 구조이고, 1 ∼ 8 개의 돌기를 가지며, 돌기를 포함한 결정 사이즈는 30 ∼ 50 ㎚ (약 15 ∼ 25 ㎚ 의 돌기 길이, 약 8 ㎚ 의 폭을 가진다) 이다. 그 3 차원 가지상 금 나노 결정은, 염화금산 수용액과 굿 버퍼 성분의 유기산 (HEPES, HEPPSO, PIPES 등) 을 실온에서 반응시킴으로써, 고수율 (92 ％) 로 얻어지고 있다 (비특허문헌 1 참조).

그러나, 비특허문헌 1 에서 얻어진 청록색을 나타내는 가지상 금 나노 결정의 콜로이드의 결정 사이즈는 30 ∼ 50 ㎚ 이기 때문에, 이뮤노크로마토그래피 진단약으로서 사용해도 발색이 불충분하여 육안 판정이 어려우며, 바람직한 사이즈가 아니다.

이상의 선행 기술에서 보는 바와 같이, 청록색의 금 나노 결정의 콜로이드가, 특히 이뮤노크로마토그래피 진단약의 표지용 담체에 적합하지 않은 이유는, 그 나노콜로이드의 입자 사이즈가 약 30 ∼ 50 ㎚ 로 비교적 작고, 또한 이른바 멀티포트형, 가지상형 혹은 별사탕상이라고 칭해지는 것은, 형상 안정제를 사용하는 경우가 많아, 이 형상 안정제에 의해, 단백질의 금 나노 입자에 대한 직접적인 수식 (修飾) 이 곤란해지는 문제가 발생하기 때문이다.

일본 공개특허공보 2003-262638호 일본 공개특허공보 2005-233744호 일본 공개특허공보 평6-116602호 일본 공개특허공보 2007-321232호 일본 공개특허공보 2008-164403호 일본 공개특허공보 평10-132817호 일본 공표특허공보 2008-545884호 일본 공표특허공보 2009-501786호 일본 공개특허공보 2006-118036호

chem. Mater. 2007, 19, 2823-2830 Langmuir 2005, 21, 2012-2016 J. Phys. Chem. B 2006, 110, 19291-19294 Nano Lett. 2006, 6, 683-688

본 발명은, 청색 금 나노 입자, 그 금 나노 입자가 매체 중에 분산되어 이루어지는 청색 금 나노 입자의 콜로이드액, 및 육안으로 청색의 고도의 선명한 색을 나타내고, 품질의 안정성, 보존 안정성 및 식별성이 우수한, 면역학적 측정용 표지제, 단백질 염색제로서 유용한, 종래의 적색과는 색이 다른 식별이 용이한 청색 금 나노 입자를 제공하는 것, 그 제조 방법, 그것을 사용함에 따른 측정의 정밀도를 높인 검사 키트 및 그 측정 방법에 관한 과제를 해결하고자 하는 것이다.

참고로 한 비특허문헌 1 ∼ 4 에 있어서의 청색 금 나노 입자는, 이뮤노크로마토그래피 진단약용 담체에 적합하지 않은 이하의 2 가지의 문제점이 존재한다.

1. 면역학적 측정에 적합한 입자 사이즈가 아니다. 이뮤노크로마토그래피 시약에 적합한 입자 사이즈는, 평균 입자 직경 40 ∼ 100 ㎚ 정도이다. 비특허문헌 1 에 의하면, 입자 사이즈는 30 ㎚ 정도이다.

2. 형상 안정제를 함유하고 있다. 비특허문헌 2 ∼ 4 에 있어서의 3 차원 가지상 금 나노 입자는, 그 형상을 제어하기 위해 형상 안정제를 함유하고 있다. 이 형상 안정제에 의해, 단백질의 금 나노 입자에 대한 직접적인 수식이 곤란해진다.

또, 다항목의 검사를 실시하는 경우에는, 종래의 적색 금 나노 입자와 착색 라텍스 입자를 다항목의 동시 측정에 사용한 경우에는, 금 나노 입자와 라텍스 입자는 입자 사이즈가 상이하기 때문에 (범용되는 라텍스 입자는, 금 나노 입자보다 입자 사이즈가 크다), 이뮤노크로마토그래피법에서 사용하는 경우에는, 양방의 입자에 적합한 다공질의 포어 사이즈를 갖는 이뮤노크로마토그래피 담체를 선택하는 것이 곤란하다. 그 때문에, 단백질 등의 피표지 물질의 담지가 용이하고 저렴한 2 종류의 색이 다른 금 콜로이드 입자를 표지 물질로서 사용하는 것이 필요해지고 있다.

본 발명자 등은, 상기 문제점을 해결하기 위해, 먼저, 면역학적 측정에 적합한 사이즈로 하기 위해, 입자의 사이즈를 크게 하고, 또 단백질의 금 나노 입자에 대한 수식이 직접 가능한 것 같은 형상 안정제를 선택함으로써, 이뮤노크로마토그래피 진단약용 담체에 적합한 청색 금 나노 입자, 더욱 상세하게는, 이뮤노크로마토그래피법에 의한 다항목 검출에 있어서, 다항목 검출 시약에 사용할 수 있는 청색 금 나노 입자의 제공을 달성한 것이다.

본 발명은, 면역학적 측정에 적합한, 단백질의 금 나노 입자에 대한 수식이 용이하고, 또한 다항목 검출 시약에 최적인 청색 금 나노 입자를 제공한다.

즉, 본 발명의 청색 금 나노 입자는, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산 (예를 들어, HEPES 등), Au (금), 및 환원성을 갖는 유기산 (예를 들어, 아스코르브산, 시트르산 등) 으로 이루어지고, 육안으로 청색을 나타내며, 별사탕 (confeito) 상의 형상을 하고 있다.

본 발명의 청색 금 나노 입자는, 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚, 색채의 선명성이나 지속 안정성, 게다가 콜로이드의 지속 안정성 면에서 생각하면, 바람직하게는 40 ∼ 180 ㎚, 검사의 식별 현저성 등의 실용적인 여러 사정의 견지에서는, 통상적으로 가장 바람직하게는 50 ∼ 120 ㎚, 가장 더 적정한 범위는 60 ∼ 100 ㎚ 로서, 청색 금 나노 입자가 콜로이드로서 분산된 액에 있어서, 육안으로 청색을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서의 평균 입자 직경이란, 청색 금 나노 입자의 후술하는 핵 돌기부를 포함하여 구해진 값이다. 본 발명의 청색 금 나노 입자에 있어서, 바람직하게는, 핵 돌기부의 길이는 5 ∼ 50 ㎚ 의 범위이고, 돌기수가 핵 1 개에 대하여 4 개 이상이다.

본 발명의 청색 금 나노 입자를 함유하는 콜로이드 수용액에 있어서, 금 콜로이드 입자의 평균 입자 직경은 20 ∼ 200 ㎚, 바람직하게는 40 ∼ 180 ㎚, 통상적으로 가장 바람직하게는 50 ∼ 120 ㎚, 가장 더 적정한 범위는 60 ∼ 100 ㎚ 이고, 평균 입자 핵 사이즈가 20 ∼ 60 ㎚ 의 범위이다. 본 발명의 청색 금 나노 입자를 함유하는 콜로이드 수용액은, 570 ∼ 750 ㎚ 의 범위에 자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 금 콜로이드 수용액에 함유되는 금 나노 입자를 이뮤노크로마토그래피법에 있어서의 표지 물질로서 사용하면, 적색과 식별성이 높은 청색에 의한 검출이 가능해져, 다항목의 동시 검출에 있어서 오진단을 저감시킨 이뮤노크로마토그래피 측정을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 청색 금 나노 입자의 콜로이드액이란, 나노 사이즈 (㎚) 의 미립자, 특히 금 나노 입자가 물과 같은 각종 매체 중에 분산되어 있는 상태의 것을 가리킨다. 즉, 본 발명은, 청색 금 나노 입자, 청색 금 나노 입자의 콜로이드액, 그 제법 및 면역학적 측정에 적합한, 단백질의 청색 금 나노 입자에 대한 수식이 용이하고, 또한 다항목 검출 시약에 최적인, 별사탕상의 청색 금 나노 입자를 제공할 수 있는 것이다.

본 발명에 의하면, 이하에 기재된 청색 금 나노 입자, 그 제조 방법 및 그 사용 방법이 제공된다. 본 발명의 금 나노 입자의 특징은, 이하와 같다.

(a) 본 발명의 제 1 특징은, 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚ 인 금 나노 입자로 구성되어 이루어지는 청색 금 나노 입자에 있다.

(b) 본 발명의 제 2 특징은, 자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장이 570 ∼ 800 ㎚ 의 범위인 것을 특징으로 하는 (a) 에 기재된 청색 금 나노 입자에 있다.

(c) 본 발명의 제 3 특징은, 입자의 형태가 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원 돌기부를 갖는 금 나노 입자인 것을 특징으로 하는 (a) 또는 (b) 에 기재된 청색 금 나노 입자에 있다.

(d) 본 발명의 제 4 특징은, 금 나노 입자로 이루어지는 핵의 외주를 성장시킴으로써 형성되어 이루어지는 (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 청색 금 나노 입자에 있다.

(e) 본 발명의 제 5 특징은, 평균 입자 핵 사이즈가 20 ∼ 60 ㎚, 평균 입자 직경이 50 ∼ 120 ㎚ 의 범위에 포함되고, 돌기부의 수가 핵 1 개에 대하여 4 개 이상 존재하며, 이 돌기부의 길이는 5 ∼ 50 ㎚ 인 것을 특징으로 하는 (a) ∼ (d) 중 어느 하나에 기재된 청색 금 나노 입자에 있다.

본 발명의 금 나노 입자가, 물과 같은 매체 중에 분산되어 이루어지는 콜로이드의 특징은, 이하와 같다.

(f) 본 발명의 제 6 특징은, (a) 에 기재된 청색 금 나노 입자, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산, 및 환원성을 갖는 유기산으로 이루어지고, 콜로이드액으로서 분산되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 콜로이드액에 있다.

본 발명의 특히 금 나노 입자의 제조 방법의 특징으로는, 이하와 같다.

(g) 본 발명의 제 7 특징은, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산과 제 1 금염의 용액을 반응시켜 핵 금 나노 입자를 형성시키는 핵 형성 공정과, 이어서 그 핵 금 나노 입자의 용액에 제 2 금염의 용액과 환원성을 갖는 유기산을 동시적으로 첨가 반응시켜, 핵 금 나노 입자를 성장시키는 성장 공정의 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

(h) 본 발명의 제 8 특징은, 성장 공정의 반응 온도를 10 ℃ 이상 40 ℃ 미만에서 실시하는 것을 특징으로 하는 (g) 에 기재된 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

(i) 본 발명의 제 9 특징은, 성장 공정에 있어서의 유기산의 농도가 0.075 ∼ 0.15 mM 인 것을 특징으로 하는 (g) 또는 (h) 에 기재된 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

(j) 본 발명의 제 10 특징은, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산이, 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판-3-술폰산), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 및 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판술폰산) 으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 (i) 에 기재된 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

(k) 본 발명의 제 11 특징은, 환원성을 갖는 유기산이, 타르타르산, 타르타르산염, 타닌산, 타닌산염, 아스코르브산, 아스코르브산염, 시트르산 및 시트르산염으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 (g) 에 기재된 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

(l) 본 발명의 제 12 특징은, 성장 공정에 있어서, 환원성을 갖는 유기산과 함께 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 (g) 에 기재된 청색 금 나노 입자의 제조 방법에 있다.

다음으로, 본 발명의 특히 면역학적 측정용 표지 물질로서의 특징은, 이하와 같다.

(m) 본 발명의 제 13 특징은, (a) ∼ (e) 중 어느 하나에 기재된 청색 금 나노 입자를 함유하는 면역학적 측정용 표지 물질에 있다.

(n) 본 발명의 제 14 특징은, 형상이 상이한 적어도 2 종류의 금 나노 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 (m) 에 기재된 면역학적 측정용 표지 물질에 있다.

(o) 본 발명의 제 15 특징은, 구상의 금 나노 입자와 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자의 적어도 2 종류로 구성되는 (n) 에 기재된 면역학적 측정용 표지 물질에 있다.

(p) 본 발명의 제 16 특징은, (a) ∼ (e) 중 어느 하나에 기재된 청색 금 나노 입자를 표지 물질로서 사용하는 면역학적 측정 방법에 있다.

이상의 발명의 구성을 취함으로써, 본 발명의 과제를 해결할 수 있었다.

본 발명의 청색 금 나노 입자는, 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚, 바람직하게는 40 ∼ 180 ㎚, 통상적으로 가장 바람직하게는 50 ∼ 120 ㎚, 가장 더 적정한 범위는 60 ∼ 100 ㎚ 의 범위이기 때문에, 이뮤노크로마토그래피 진단약에 최적인 입자 사이즈를 제공할 수 있다.

또, 구상의 적색 금 나노 입자 등과 병용함으로써, 복수 색의 판정 라인을 갖는 이뮤노크로마토그래피 진단약을 제조할 수 있으므로, 다항목 검사에 있어서 육안 판정이 용이하고 정확하게 할 수 있기 때문에, 오진단ㆍ오판정을 하는 경우가 없다.

또한, 본 발명의 청색 금 나노 입자에 있어서는, 단백질의 수식이 용이하기 때문에, 감도의 저하가 없고, 정확하게 결과의 판정이 가능하여, 이뮤노크로마토그래피 진단약으로서의 성능이 우수하다.

게다가 또한, 본 발명의 청색 금 나노 입자는, 이뮤노크로마토그래피 진단약화했을 때의 비용이, 다른 제법에 의해 얻어진 입자에 비해 저렴하다.

도 1a 는 본 발명의 청색 금 나노 입자의 일례의 형태 및 치수 개요를 나타내는 투과 전자 현미경 사진 이미지이다.
도 1b 는 본 발명의 청색 금 나노 입자의 다른 일례의 형태 및 치수 개요를 나타내는 투과 전자 현미경 사진 이미지이다.
도 2a 는 본 발명의 청색 금 나노 입자의 일례의 성장 전의 투과 전자 현미경 사진 이미지이다.
도 2b 는 본 발명의 청색 금 나노 입자의 일례의 성장 후의 투과 전자 현미경 사진 이미지이다.
도 3a 는 본 발명의 청색 금 나노 입자의 다른 일례의 성장 전의 투과 전자 현미경 사진 이미지이다. 20 배 (도면 내 스케일 바의 길이가 50 ㎜) 이다.
도 3b 는 도 3a 의 청색 금 나노 입자의 성장 후의 투과 전자 현미경 사진 이미지이다. 50 배 (도면 내 스케일 바의 길이가 20 ㎜) 이다.
도 4a 는 본 발명의 청색 금 나노 입자 합성에 있어서의, 자외 가시 흡수 스펙트럼의 파장 (㎚) 과 흡광도의 관계를 나타내는 도면이다.
도 4b 는 도 4a 의 본 발명의 청색 금 나노 입자 합성에 있어서의, 각종 반응 온도 (℃) 와 극대 흡수 파장의 관계를 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 청색 금 나노 입자 합성에 있어서의, 자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장 (㎚) 과 아스코르브산 농도의 관계를 나타내는 도면이다.
도 6 은 본 발명의 청색 금 나노 입자의 이뮤노크로마토그래피 시약에 사용한 경우의 검출 감도의 비교를 나타내는 도면이다.

본 발명의 청색 금 나노 입자는, 한꺼번에 평균 입자 직경이 큰 것을 제조하는 것이 이상적이지만, 일단 소정 크기의 입자를 생성시킨 후에, 성장 공정을 거쳐 큰 입자 직경의 것을 입수하는 것이 합리적이다. 본 발명의 청색 금 나노 입자는, 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚ 인 금 나노 입자로 구성되어 있는 것이다. 또, 본 발명의 금 나노 입자가 매체 중에 분산되어 이루어지는 콜로이드액의, 금 콜로이드 입자의 평균 입자 직경은 20 ∼ 200 ㎚ 이지만, 바람직하게는 40 ∼ 180 ㎚, 통상적으로 가장 바람직하게는 50 ∼ 120 ㎚, 가장 더 적정한 범위는 60 ∼ 100 ㎚ 의 범위이다. 검사의 식별 현저성 등의 실용적인 여러 사정의 견지에서, 입자 직경 분포가 샤프하고, 균일한 별사탕 (confeito) 상의 형태인 것이 보다 바람직하다. 이 평균 입자 직경은, 통상적으로, 중력적 광산란법 (콜로이드 입자를 졸상체인 채로, 14000 ∼ 5530000×g 으로 회전시키는 초원심 분리기에 걸어, 그 침강 속도로부터 구한다) 에 의해 구할 수 있지만, 본 발명에서는, 투과형 전자 현미경 (TEM：닛폰 전자 (주) 제조, JEM-2010) 에 의해, 촬영한 투영 사진을 사용하여 무작위로 100 개의 입자를 입자의 투영 면적 원 상당 직경을 계측하고, 그 평균값으로부터 평균 입경 (평균 입자 직경) 을 산출한다.

그 금 나노 입자의 입도 분포를 작성하기 위해, X 축 (예를 들어, 금 나노 입자 사이즈) 과 Y 축 (예를 들어, 수 분율) 을 결정하여, 평균 입자의 분포 곡선을 플롯하면, 본 발명의 금 나노 입자는, 그 분포 곡선의 정점이, 통상은 40 ∼ 120 ㎚, 바람직하게는 50 ∼ 110 ㎚, 보다 바람직하게는 60 ∼ 100 ㎚ 의 범위의 입자 사이즈에 실질적으로 속하고 있어, 분포 곡선이 비교적 좁다는 것이 분명해진다. 이것은, 입자 사이즈가 근사한, 균일한 입자 사이즈의 것이 많이 존재한다는 것으로, 나노 입자의 거동이 안정되고, 신뢰값이 높아, 이물질의 혼재에 의한 오차 범위의 발생을 억제하는 성질을 갖는 것이 예측된다.

정량적으로는, 통상은 20 ∼ 200 ㎚ 의 범위에 속하는 금 나노 입자의 총중량은 40 ％ 이상, 바람직하게는 60 ％ 이상, 보다 바람직하게는 80 중량％ 이상 존재하는 것이 바람직하다. 나머지는 성장하지 않는 것, 진구상인 것, 미반응 잔사 등으로 구성된다.

본 발명의 금 나노 입자는, 핵과 3 차원상 돌기를 갖는 이른바 별사탕 (confeito) 상의 형태를 갖고 있으며, 제법의 조작을 바꾸면, 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚ 인 임의의 것이 얻어진다. 표지 입자로서 사용하는 경우에는, 평균 입자 직경으로서 50 ∼ 120 ㎚ 의 범위의 것, 바람직하게는 55 ∼ 100 ㎚ 정도의 것이, 특정 표지 입자의 색에 의한 육안 판정의 정밀도를 높이는 데에 우수하다.

이 별사탕상의 입자에 있어서, 3 차원상 돌기가 복수 형성되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 평균 입자 직경이란, 핵 돌기부를 포함하여 구해진 값이다. 본 발명의 금 나노 입자에 있어서, 돌기의 수는, 핵 1 개에 대하여 약 1 ∼ 20 개이고, 바람직하게는 약 4 ∼ 10 개이다. 돌기의 길이는, 통상적으로 5 ∼ 50 ㎚ 정도이다. 이 돌기의 수, 길이 등은, 핵의 성장에 관계하기 때문에, 미리 특정 수나 길이를 결정하는 것은 매우 곤란하다.

핵에 3 차원상 돌기를 갖는 이 금 나노 입자, 금 나노콜로이드 입자를, 본 발명에서는, 그래프트형, 멀티포트형 또는 별사탕형의 금 나노 입자, 또는 금 나노콜로이드 입자라고 총칭하고 있다. 이른바 금 나노 입자, 금 나노콜로이드 입자의 형태로서, 나노튜브, 나노로드, 나노포트, 별형, 혹은 핵에 돌기가 가지상으로 3 차원으로 성장한 그래프트형과 같은, 도 1a 및 도 1b 에 보이는 바와 같은 형태를 한, 그래프트형 금 나노 입자라고도 호칭하는 각종 공지된 호칭 형상의 3 차원상 돌기를 갖는 구조의 것의 존재를 상정할 수 있다. 또한, 본 발명의 선명한 청색을 나타내는 금 나노콜로이드 입자의 형태는, 그 형상, 구조는, 방파제에 사용되는 테트라포트와 유사하기 때문에, 그 용어를 원용하면, 가지 1 개가 그래프트 성장한 것을 모노포트, 가지가 증가함에 따라 디포트, 트리포트, 테트라포트, 펜타포트 등의 각종 형태의 것을 취할 수 있지만, 본 발명에서는 핵에 돌기수가 4 ∼ 10 정도로 비교적 많은 것이 추장 (推奬) 되기 때문에, 멀티포트라고 총칭할 수 있다.

본 발명의 멀티포트형 금 나노콜로이드 입자, 또는 별사탕형 금 나노콜로이드 입자는, 종래형의 적색을 나타내는 진구상 금 콜로이드 입자와 비교하여 퍼짐에 상응하는 색을 나타낸다. 이것이 청색 등의, 금 나노콜로이드액의 색채의 다양화를 가능하게 한다.

상세하게는, 본 발명의 청색 금 나노 입자의 전형적인 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원상 돌기를 갖는 금 나노 입자의 범주에 속하는 것으로는, 도 1a 및 도 1b 의 금 나노 입자의 형태가 일례로서 나타난다. 이 금 나노 입자의 중심 부분은, 이른바 핵이 존재하여, 그 핵 상에 돌기 또는 가지가 그래프트 성장한 것으로, 그 성장의 그래프트 기점이 밀접하기 때문에, 핵과 돌기가 일체가 된 멀티포트형 금 나노 입자 또는 별사탕형 금 나노 입자와 같이 보인다.

도 1a 및 도 1b 의 금 나노 입자의 예의 상세는, 50 ㎚ 정도의 청색 금 나노 입자의 예를 나타내는 것이며, 도 1a 및 도 1b 의 예시의 것은, 구체적으로는, 평균 입자 직경 (DLS) 66.5 ㎚, 극대 흡수 파장 610 ㎚ 정도의 특성을 갖는다. 더욱 보충하면, TEM 관찰에 의한 계측을 하면, 금 나노 입자의 평균 외경 62.2 ㎚, 평균 핵 직경 35.7 ㎚, 평균 돌기 13.2 ㎚, 돌기각 50 도 정도의 형태를 갖는 것이며, AR (애스펙트비) 은 1 이상이다. 물론, 본 발명의 금 나노 입자의 평균 외경, 평균 핵 직경, 평균 돌기 및 돌기각 등은, 소정의 색이 다른 생성물을 고려하여 임의로 바꿀 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 실시예를 포함하여 파장은, 이하와 같이 측정되었다. 즉, 자외 가시 흡수 스펙트럼 측정기 (장치명：UV-2550, (주) 시마즈 제작소사 제조) 를 사용하여 파장을 측정하였다. 측정은 석영 셀 10 ㎜, 파장 800 ∼ 200 ㎚, 밴드 폭 0.5 ㎚ 의 조건에서 실시하였다.

본 발명의 청색 금 나노 입자, 청색 금 나노콜로이드는, 다항목 진단 시약의 개발에 유효하고, 판정 라인이 복수 존재하는 경우에, 육안 판정할 때의 오진단의 가능성을 없앨 수 있다. 이와 같은 다항목 진단 시약에 있어서의 면역학적 측정용 표지 물질로서 사용하는 금 나노 입자로는, 형상이 상이한 적어도 2 종류의 금 나노 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정용 표지 물질이다. 구체적으로는, 구상의 적색 금 나노 입자와 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원상 돌기를 갖는 청색 금 나노 입자의 적어도 2 종류로 구성되는 것이 적합하다.

다항목 진단 시약에 있어서의 면역학적 측정용 표지 물질로서 사용하는 본 발명의 금 나노 입자는, 예를 들어, 1 개가 구상인 금 나노 입자, 타방이 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자와 같은, 형상이 상이한 적어도 2 종류, 또는 3 종류의 금 나노 입자가 혼재하고 있는 것과 같은 형태의 것 (이하, 「혼재형 금 나노 입자 표지 물질」이라고도 한다) 을 포함한다. 이 경우에는, 만약 형태별로 입도 분포를 취하면, 구상의 금 나노 입자가 형성하는 입도 분포 곡선과, 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자가 형성하는 입도 분포 곡선으로 이루어지는 정점이 2 개 존재하는 분포 곡선을 형성하는 것도 있을 수 있다. 물론 3 종류의 형태를 갖는 금 나노 입자가 혼재하면, 정점을 3 개 갖는 입도 분포 곡선을 그릴 수 있다. 본 발명에 있어서, 형태의 차이를 고려하지 않고, 적어도 2 종류의 금속 나노 입자의 입도 분포를 취하면, 평균 입자 직경이 비교적 작은 금 나노 입자와 평균 입자 직경이 비교적 큰 금 나노 입자가 혼재하게 되기 때문에, 평균 입자 직경이 20 ∼ 220 ㎚ 의 비교적 광범위의 것이 되지 않을 수 없다. 어쨌든 각 입도 분포 곡선이 샤프한 산형을 형성하는 편이 소정의 금 나노 입자가 많은 것이 되기 때문에, 측정의 정밀도를 높일 수 있다. 이 혼재형 금 나노 입자 표지 물질의 상세한 예를 하기에 설명한다.

본 발명의 「혼재형 금 나노 입자 표지 물질」의 상태를 상세하게 설명하면, 혼재형 금 나노 입자를 2 종류로 인식할 수 있는 경우, 예를 들어, 1 개가 구상의 금 나노 입자, 타방이 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자의 경우를 설명하면, 양자의 혼재 비율은 표지의 검출 감도를 고려하여, 질량％ 로, 10：90 ∼ 90：10 의 범위에서 혼재시킨 것을 생각할 수 있다. 구상의 금 나노 입자가 40 질량％ 인 경우에는, 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자 60 질량％ 로 구성된다는 것이다. 물론 미반응물, 비성장물, 불순물과 같은 소정 이외의 것을 제외하고 산출한 것이다.

이 혼재형 금 나노 입자 표지 물질을 구성하는, 예를 들어, 구상의 금 나노 입자의 치수는, 평균 입자 직경이 20 ∼ 220 ㎚, 바람직하게는 30 ∼ 200 ㎚, 보다 바람직하게는 40 ∼ 150 ㎚ 정도로 비교적 큰 입자이다. 한편, 3 차원상 돌기를 갖는 금 나노 입자의 평균 입자 직경에 대해서는, 20 ∼ 200 ㎚ 정도의 것이 혼재할 수 있지만, 색채의 선명성, 색채에 장시간의 안정성, 콜로이드의 안정성, 표지의 정밀도의 향상, 신뢰성을 높이기 위해서는, 바람직하게는 40 ∼ 180 ㎚, 통상적으로 가장 바람직하게는 50 ∼ 120 ㎚, 가장 더 적정한 범위는 60 ∼ 100 ㎚ 의 범위이다.

혼재형 금 나노 입자 표지 물질의 입수법은, 단순하게 미리 제조된 소정의 평균 입자 직경을 갖는 구상의 금 나노 입자 표지 물질과 3 차원상 돌기를 갖는 금 나노 입자 표지 물질을 소정 비율로 혼합하는 수법을 들 수 있다.

본 발명의 혼재형 금 나노 입자 표지 물질인 형상이 상이한 적어도 2 종류의 금 나노 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정용 표지 물질로는, 면역 측정계에 있어서 피검출물과 결합능을 갖는 검출 물질을 수식하고, 피검출물과의 결합에 의해 표지하기 위한 표지 시약을 구성하는 표지 물질로서 사용하는 금 나노 입자를 적어도 2 종류 함유하고,

1) 2 종류의 금 나노 입자 양방의 평균 입자 직경이 20 ∼ 220 ㎚ 인 것,

2) 2 종류의 금 나노 입자의 일방이 구상이고, 타방이 3 차원상 돌기를 4 개 이상 갖는 것을 특징으로 하는 금 나노 입자의 양태를 들 수 있다.

이와 같은 혼재형 금 나노 입자 표지 물질은, 한 번에 다양한 항원을 적색, 청색과 같은 색 차이로 선명하게 식별할 수 있기 때문에, 의료 현장의 검사 부담을 경감시키고, 간편화할 수 있어서, 그 유용성을 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명의 금 콜로이드 입자는, 육안으로 청색을 나타낸다. 육안으로 청색을 나타낸다는 것은, 물 등의 용매 중에 금 콜로이드 입자를 분산시킨 금 콜로이드 용액이, 육안으로 청색, 혹은 청록색이나 청자색 등 청색과 유사한 색을 나타내는 것이다. 구체적으로는, 먼셀 표색계에서의 측색값이 색상 3P ∼ 1P, 10PB ∼ 1PB, 10B ∼ 1B, 10BG ∼ 1BG, 10G ∼ 8G 이다. 적색과의 식별력을 고려하면, 색상 10PB ∼ 1PB, 10B ∼ 1B, 10BG ∼ 1BG 가 바람직하다. 측색에 대하여 예시하면, 분광 광도 측정에 사용하는 석영 셀 (광로 길이 10 ㎜ 정도) 등에 콜로이드 용액을 충전하고, 화이트 백 (자화 (自畵) 용지 등) 으로 육안으로 색조를 확인하여, 시판되는 먼셀 색견본에 의해 색상을 평가할 수 있다.

본 발명의 금 나노 입자의 제조 방법은, 수용액 중에서 제 1 금염을 제 1 환원제로 환원하여 별사탕상의 핵 금 나노 입자를 형성하는 핵 형성 단계, 이어서, 그 핵 금 나노 입자의 용액에, 제 2 금염과 제 2 환원제를 동시에 적하하여 핵 금 나노 입자를 성장시켜 보다 사이즈가 큰 별사탕상의 금 나노 입자를 형성시키는 성장 단계를 포함하고, 성장 단계는 1 회 이상 실시할 수 있다.

성장 단계에 있어서, 보다 긴 돌기를 갖는 별사탕상의 금 나노 입자를 형성시키고자 하는 경우에는, 제 2 환원제와 함께 제 1 환원제, 즉, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산과의 혼합물을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 한다.

제 2 환원제와 병용하는 제 1 환원제의 사용량은, 성장 단계에서 사용하는 제 2 환원제의 사용 농도의 사양에 따라 그것과 동일량 정도로 사용할 수 있다. 즉, 사용하는 제 1 환원제의 농도는, 성장 단계에서 핵 금 나노 입자를 성장시키는 수용액 중, 0.01 ∼ 100 mM 의 범위 내에서 달성할 수 있다.

청색 금 나노 입자의 화학종의 거동을 해석하기 위해, 일 실시양태로서, 성장 반응 전의 핵 입자에 상당하는 것을 입자 1 이라고 칭하고, 「입자 1」0.43 mM AuCl₄, 39.0 mM HEPES 의 액을, 성장 반응 후의 성장한 입자에 상당하는 것을 입자 2 라고 칭하고, 「입자 2」0.05 mM AuCl₄, 0.82 mM HEPES, 0.10 mM 아스코르브산의 사양액을 조합 (調合) 하여 그 거동을 해석한다.

피크 파장을 바꾸지 않고 본 발명의 입자 사이즈를 크게 한 예를 나타내면, 도 2a 및 도 2b 에 기초하여 상세하게 설명을 하면, 도 2a 의 「입자 1」의 입자의 흡수 스펙트럼에 있어서, 본 발명은 자외 가시 흡수 스펙트럼의 피크 파장을 바꾸지 않고, 입자 사이즈를 도 2b 의 「입자 2」의 상태로 성장시킬 수 있다는 것을 본 발명자 등이 달성할 수 있었던 것이다. 도 2a 및 도 2b 에 있어서의 피크 파장이란, 약 570 ∼ 630 ㎚ 의 범위를 가리키는 것이다.

본 발명의 핵 형성 단계에서 사용하는 제 1 금염으로는, 염화금산, 삼브롬화 금, 삼불화금, 삼요오드화금, 삼시안화금, 일염화금, 일요오드화금, 일불화금, 일시안화금, 하이드록시금옥사이드, 트리스질산금, 질산금 등, 이들의 염류, 이들의 수화물이나 금의 왕수 용액을 사용할 수 있다. 상기한 이외의 것이라 하더라도, 수용액 중에서 제 1 금염을 생성하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 핵 형성 단계에서 사용하는 제 1 환원제로는, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산을 사용할 수 있다. 예를 들어, 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (이하, 「HEPES」라고 약기한다), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산 (이하, 「HEPPS」라고 약기한다), 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판-3-술폰산) (이하, 「HEPPSO」라고 약기한다), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산 (이하, 「PIPES」라고 약기한다), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 (이하, 「EPPS」라고 약기한다), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판술폰산) (이하, 「POPSO」라고 약기한다) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 환원제로는, HEPES, HEPPSO, PIPES 이고, 보다 바람직한 환원제로는 HEPES 이다. 이들의 혼합물이라 하더라도 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 금염으로는, 핵 형성 단계에서 사용하는 제 1 금염으로서 예시된 금염을 사용할 수 있으며, 동일해도 상관없고 상이해도 상관없다. 바람직하게는 제 1 금염 및 제 2 금염으로서 염화금산을 사용할 수 있다.

본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 환원제로는, 환원성을 갖는 유기산, 예를 들어, 아스코르브산 및 그 유도체, 또는 시트르산 및 그 유도체, D(L)-말산, D(L)-타르타르산, 타르트론산, 점액산 (mucic acid) 등의 α-하이드록시카르복실산, 락트산, 타닌산, 환원당 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아스코르브산 및 그 유도체, 또는 시트르산 및 그 유도체이다. 가장 바람직하게는 아스코르브산 및 그 유도체이다. 이들의 혼합물이라 하더라도 사용할 수 있다.

아스코르브산 및 그 유도체로는, 아스코르브산(염), 그 이성체, 유사물 및 그 유도체 등이며, 환원성을 갖는 것이면 사용할 수 있다. 예를 들어, L (또는 D)-아스코르브산, 이소아스코르브산, 에리소르브산, 스코르밤산 (scorbamic acid), 디하이드로이소아스코르브산, 데옥시아스코르브산, 클로로데옥시아스코르브산 등의 할로겐화데옥시아스코르브산, 에틸아스코르브산 등의 아스코르브산알킬에스테르, 아스코르브산나트륨 등의 아스코르브산알칼리 금속염, 아스코르브산칼슘 등의 아스코르브산알칼리 토금속염 등을 들 수 있다. 특히, L (또는 D)-아스코르브산(염), 이소아스코르브산이 바람직하게 사용된다. 이들의 혼합물이라 하더라도 적절히 사용할 수 있다.

시트르산 및 그 유도체로는, 시트르산(염), 그 이성체, 유사물 및 그 유도체등이며, 환원성을 갖는 것이면 사용할 수 있다. 예를 들어, 시트르산, 이소시트르산, 시트르산 무수물, 이소시트르산 무수물, 시트르산나트륨, 시트르산칼륨 등의 알칼리 금속염, 시트르산암모늄 등의 암모늄염, 시트르산칼슘 등의 알칼리 토금속염, 메틸시트르산, 에틸시트르산 등의 시트르산알킬에스테트 등을 들 수 있다. 특히, 시트르산, 시트르산나트륨이 바람직하게 사용된다. 이들의 혼합물이라 하더라도 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 핵 형성 단계에 있어서의 반응 온도는 0 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃ (실온), 보다 바람직하게는 15 ∼ 25 ℃ 이고, 30 분 ∼ 5 시간 반응을 실시한다. 40 ℃ 를 초과하면 구상 입자가 늘어나, 수율이 저하된다. 0 ℃ 미만으로 해도 수율의 증가는 없어, 기술적으로 무의미해지고, 경제적이지 않아 쓸모없게 된다.

핵 형성 단계에서 사용하는 제 1 환원제의 농도는, 핵 형성 단계에서 핵 금 나노 입자가 형성되는 수용액 중에서 1 ∼ 150 mM, 바람직하게는 30 ∼ 100 mM 을 사용할 수 있다. 150 mM 을 초과하면 필요 이상의 농도가 되어, 기술적으로 무의미해지고, 경제적이지 않아 쓸모없게 된다. 1 mM 미만에서는 환원제의 기능이 지나치게 약해 핵 형성 반응이 충분하지 않게 된다.

핵 형성 단계에서 사용하는 제 1 금염의 농도는, 핵 형성 단계에서 핵 금 나노 입자가 형성되는 수용액 중에서 0.1 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 5 ∼ 25 mM 을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 mM 이란, mmol/ℓ 를 의미한다.

핵 형성 단계에서 상기 농도 범위의 제 1 환원제와 상기 농도 범위의 제 1 금염을 반응시켜 얻어지는 금 콜로이드 용액의 금의 농도가, 최종적으로 0.1 ∼ 100 mM 이 될 것 같은 범위에서 반응시킨다.

본 발명의 성장 단계에 있어서의 반응 온도는 0 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃ (실온), 보다 바람직하게는 15 ∼ 25 ℃ 이고, 1 ∼ 10 시간 반응을 실시한다. 40 ℃ 를 초과하면 구상 입자로 이행되는 경향이 보여 수율이 저하됨과 함께, 자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장이 570 ㎚ 미만이 되어, 저단파장 측으로 이행된다. 0 ℃ 미만으로 해도 효과로 이어지는 것은 없어, 쓸모없게 된다.

본 발명의 금 나노 입자의 합리적인 합성 방법을 예의 검토한 단계에서, 특히 미(未)환원 염화금산의 양을 줄일 수 없을까라는 점에서 고찰한 결과를 도 4a 및 도 4b 에 기초하여 상세하게 설명을 한다. 반응 온도, 반응 속도를 바꿈으로써, 미환원 염화금산의 양의 관계를 조사하면, 반응 온도를 낮게 설정하면, 보다 청색미를 늘릴 수 있다는 것에 관계하는 거동을 나타내는 것을 지견 (知見) 하였다. 도 4a 및 도 4b 에 의하면, 반응 온도는 약 10 ∼ 35 ℃ 정도로 하는 것이 최적이라는 것을 알 수 있다.

마찬가지로, 도 4a, 도 4b 에 기초하여 설명을 하면, 도 4a 는, 각종 반응 온도 10 ℃, 20 ℃, 30 ℃ 및 40 ℃ 에 있어서의 파장 (㎚) 의 관계를 조사한 것이다. 40 ℃ 이상으로 하면, 청색에서 적색으로 이행되는 경향을 나타낸다. 이른바 반응 온도를 높게 하면, 금 나노콜로이드 입자가 적색미를 더하는 경향을 나타낸다. 한편, 반응 온도를 낮게 하면, 금 나노콜로이드 입자는 청색미를 더하는 경향이 있다. 상세하게는, 도 4b 에 보는 바와 같이, 예를 들어, 극대 흡수 파장 600 ㎚ 정도의 금 나노콜로이드 입자를 수득하는 경우에는, 약 10 ∼ 30 ℃, 최적 온도로서 15 ∼ 25 ℃ 의 반응 온도를 설정하면 용이하게 달성할 수 있다.

본 발명의 성장 단계에서 사용하는 아스코르브산 및 그 유도체와 같은 제 2 환원제의 농도는, 성장 단계에서 핵 금 나노 입자를 성장시키는 수용액 중에서 0.01 ∼ 100 mM, 바람직하게는 1 ∼ 50 mM, 보다 바람직하게는 5 ∼ 25 mM 을 사용할 수 있다.

도 5 는, 실시예 4 에 기재된 성장 단계에 있어서의 아스코르브산의 사용량을 변화시켜, 얻어진 금 콜로이드 입자 현탁액의 자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장의 변화를 측정한 결과이다. 도 5 중의 가로축은, 성장 단계에서 첨가하는 아스코르브산 수용액의 중량 농도이다. 성장 단계에 있어서의 아스코르브산 및 그 유도체의 최적량을 음미하면, 도 5 에 보는 바와 같이, 청색의 금 콜로이드를 발색시키기 위해서는, 첨가하는 아스코르브산 수용액의 농도는 0.02 ∼ 0.07 (질량％) 로 일단 광범위하게 사용할 수 있지만, 청색 파장과의 관계에서 보면, 성장 단계에서 핵 금 나노 입자를 성장시키는 전체 수용액 중의 아스코르브산 농도는 0.075 ∼ 0.15 mM 이 최적 조건인 것을 알 수 있으며, 이 범위는 기술적으로 임계성이 있는 값이라는 것은 본 발명자 등의 지견에 기초하는 것이다.

본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 금염의 농도는, 성장 단계에서 핵 금 나노 입자를 성장시키는 수용액 중에서 0.1 ∼ 100 mM, 바람직하게는, 0.2 mM ∼ 20 mM 을 사용할 수 있다.

본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 환원제의 몰 농도는, 첨가한 그 핵 금 나노 입자의 몰 농도에 대해 5 ∼ 500 배의 범위, 보다 바람직하게는 25 ∼ 250 배의 범위를 사용할 수 있다. 본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 금염의 몰 농도는, 첨가한 그 핵 금 나노 입자의 몰 농도에 대해 0.1 ∼ 10 배의 범위, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 5 배의 범위이다.

제 2 금염과 제 2 환원제는, 핵 형성 단계에서 합성한 금 콜로이드 용액 중에 각각 0.1 ∼ 3.0 ㎖/분, 바람직하게는 0.3 ∼ 1.5 ㎖/분, 특히 바람직하게는 0.5 ∼ 1.0 ㎖/분의 속도로 동시적으로 적하한다.

본 발명에 있어서의 면역학적 측정 방법이란, 생체 분자가 갖는 친화력에서 유래하는 면역학적으로 특이적인 결합 반응에 기초하는 측정 방법으로, 예를 들어, 면역 염색법, 응집법, ELISA 법, 이뮤노크로마토그래피법 등이 알려져 있다. 이와 같은 친화력에 기초하는 결합으로는, 항원과 항체의 결합이 대표적인 것이며, 면역학적 측정법에서 널리 이용되지만, 이와 같은 결합뿐만 아니라, 본 발명에서는, 당과 렉틴의 결합, 호르몬과 수용체의 결합, 효소와 저해제의 결합, 핵산과 상보적인 핵산, 핵산과 핵산과의 결합능을 갖는 단백질의 결합 등도 이용할 수 있다. 면역 반응 면역학적 반응의 형태로는, 예를 들어, 「고상 항체-항원-표지 항체 (표지 시약)」와 같은 샌드위치 형식으로 복합물을 만들게 하여 항원을 포착하여 검출하는 샌드위치법이나, 고상화 항원과 검체 중의 유리 (遊離) 항원이 반응계 내에 첨가된 일정량의 표지 항체 (표지 시약) 에 대해 경합적으로 반응하는 것을 원리로 하는 경합법 등이 사용된다. 그 중에서도, 항원과 항체에 의한 샌드위치 반응을 이용하는 에세이법으로서, 가장 간편한 수법은, 크로마토그래피를 사용한 이뮤노크로마토그래피법이다. 이뮤노크로마토그래피법은, 조작이 간단하고 검출 시간도 짧으며, 육안 판정이 가능하기 때문에 범용되고 있다.

본 발명의 청색 금 나노 입자는, 각종 이뮤노크로마토그래피 시약에 사용한 경우의 검출 감도에 있어서 우수하다는 것을 도 6 에 기초하여 설명을 한다. 도 6 의 결과는, 실시예 8 에 기재된 인플루엔자 B 형 바이러스의 이뮤노크로마토그래피 검출과 동일한 시험으로, 이뮤노크로마토그래피 리더에 의해 발색 강도를 측정한 결과이다. 「입자 1」은 실시예 1 의 핵 형성 단계만으로부터 형성되는 청색 금 콜로이드 입자 현탁액을 표지 물질로서 사용한 계이고, 「입자 2」는 실시예 1 의 핵 형성 단계 및 성장 단계를 거쳐 형성되는 청색 금 콜로이드 입자 현탁액을 표지 물질로서 사용한 계이다. 항원은, 60 ㎍/㎖ 로 항원을 함유하는 수용액을, 「입자 1」에서는 1400 배로 희석시키고, 「입자 2」에서는 2400 배로 희석시켜 각각 사용하였다. 「입자 1」(항원 희석 배율 1400 배) 과, 「입자 2」(항원 희석 배율 2400 배) 를 비교하면, 입자 2 가 색이 선명하다는 것을 알 수 있다. 이 이유는, 입자 2 의 피표면적이 넓기 때문인 것으로 예측되지만, 원인은 다방면에 걸쳐 있어 정확하게 특정할 수는 없지만, 본 발명의 것은, 검출 감도가 탁월하여, 이뮤노크로마토그래피 시약에 의한 육안 판정의 정밀도를 현저히 향상시키는 효과를 갖는다.

본 발명의 면역학적 측정 방법에 있어서, 검출 대상물을 포함하는 시료 (검체) 로는, 예를 들어, 주로 생체 시료, 즉, 혈액, 혈청, 혈장, 오줌, 타액, 골수액, 땀, 눈물, 양수, 유두 분비액, 콧물, 가래, 비강 또는 인두를 면봉으로 닦은 액, 피부로부터의 침출액, 조직이나 세포 및 대변으로부터의 추출물 등등을 들 수 있다.

본 발명의 검출 대상물로는, 그것과 특이적으로 결합하는, 예를 들어, 항원-항체 반응이나 핵산과 상보적인 핵산과 같이 특이적으로 결합하는 물질이 존재하는 것 혹은 제조할 수 있는 것이면 되어, 특별히 한정되지 않는다. 검출 대상물이 완전 항원과 같은 그 자체가 항원성을 갖는 것이라 하더라도, 혹은 합텐 (불완전 항원) 과 같은 그 자체가 항원성을 갖지 않아도 화학적 변성물로 함으로써 항원성을 갖는 데에 이르는 것이어도 된다. 이들 검출 대상물과 특이적으로 결합하는 물질이 존재하거나 혹은 제조할 수 있는 것이면 되며, 모노클로날 항체 혹은 폴리클로날 항체로 할 수 있다.

본 발명의 검출 대상물을 예시하면, 펩티드 호르몬 (성장 호르몬 (GH), 부신 피질 자극 호르몬 (ACTH), 멜라민 세포 자극 호르몬 (MSH), 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 하수체 호르몬, 칼슘 대사 조절 호르몬, 췌장 호르몬, 소화관 호르몬, 혈관 작용 호르몬, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (hCG) 등의 태반 호르몬, 전립선성 산성 포스파타아제 (PAP), 전립선 특이 항원 (PSA), 알칼리성 포스파타아제, 트랜스아미나아제, 트립신, 펩시노겐, α-페토프로테인 (AFP), 암 태아성 항원 (CEA) 등의 암 특이 물질, 면역 글로블린 G (IgG) 등의 혈청 단백 성분, 류머티즘 인자, 세로토닌, 우로키나아제, 페리틴, 서브스턴스 P, 에스트론 등의 난포 흐르몬, 변 잠혈, 매독 항체, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, RS 바이러스, 로타바이러스, HBs 항원, HBs 항체, 클라미디아 항원, A 군 β 용련균 (溶連菌) 항원 등의 세균 항원, 프로게스트론 등의 천연 또는 합성 황체 호르몬, 테스토스테론 등의 남성 호르몬, 코르티솔 등의 부신 피질 호르몬, 콜레스테롤, 담즙산, 강심성 스테로이드, 사포게닌 등의 그 밖의 스테로이드류, 에피네프린, 도파민, 생리 활성 알카로이드류, 아미노기 함유 향정신약류, TRH 등의 저분자 펩티드류, 다이요드타이로닌 등의 갑상선 호르몬류, 프로스타글란딘류, 비타민류, 페니실린 등의 항생 물질류, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 그들의 증폭물, 기타 생체내 성분, 생체내 투여 약물 및 그 대사 산물 등 외에, 돼지고기, 쇠고기, 닭고기, 알 등등의 식품이나 그것들을 포함하는 식품 등의 추출액 등등을 들 수 있다. 바람직한 검출 대상물로는, 바이러스에 대해 사용되고, 특히, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, RS 바이러스에 대해 보다 바람직하게 사용된다.

본 발명의 최적인 검체는, 콧물, 비강을 면봉으로 닦은 액, 인두를 면봉으로 닦은 액 또는 가래이다. 이들 검체를 전개액을 사용하여 미리 희석 처리함으로써, 호흡기 질환 환자로부터 채취되는 항원 (바이러스：주로 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, RS 바이러스) 을 피검출 물질로서 적확하게 검출할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 이뮤노크로마토그래피용 전개액으로는, 통상적으로, 용매로서 물을 사용하고, 이것에 완충제, 염, 블로킹제 및 비이온 계면 활성제를 첨가한다. 첨가하는 순서는 특별히 특정되지 않아, 동시에 첨가해도 지장이 없다. 전개액으로서 사용하는 경우에는, 검출하는 시료 (검체 시료) 와 전개액을 미리 혼합한 것을, 샘플 패드 (시료 첨가 부분) 상에 공급ㆍ적하하여 전개시킬 수도 있고, 시료에 따라서는 먼저 시료를 샘플 패드 (시료 첨가 부분) 상에 공급ㆍ적하한 후, 전개액을 샘플 패드 (시료 첨가 부분) 상에 공급ㆍ적하하여 전개시켜도 된다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피용 전개액에 사용하는 완충제로는, 시료의 첨가나 시료의 증발이나 희석에 의한 농도의 변화, 외부로부터의 다소의 이물질의 혼입에 의해서도 치명적인 영향을 일으키지 않는 작용 (완충 작용) 을 갖는 것이면 특별히 제한은 없다.

본 발명에 있어서, 완충제로는, 아세트산 완충액 (아세트산＋아세트산나트륨), 인산 완충액 (인산＋인산나트륨), 시트르산 완충액 (시트르산+시트르산나트륨), 붕산 완충액, 트리스염산 완충액 (트리스(하이드록실메틸)아미노메탄＋염산), TE 완충액 (트리스＋에틸렌디아민사아세트산), TAE 완충액 (트리스＋아세트산＋에틸렌디아민사아세트산), TBE 완충액 (트리스＋붕산＋에틸렌디아민사아세트산) 또는 HEPES 완충액 (2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산) 등의 굿 버퍼 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아세트산 완충액, 인산 완충액, 트리스염산 완충액 등이고, 보다 바람직하게는 트리스염산 완충액이다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피용 전개액에 사용하는 염으로는, 산과 염기의 반응에 의해 얻어진 염이면 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 등을 들 수 있다. 바람직하게는 염화나트륨이다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피용 전개액에 사용하는 비이온성 계면 활성제로는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 (상품명 「Tween」시리즈, 시그마-알드리치사), 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페닐에테르 (상품명 「Triton」시리즈, 시그마-알드리치사), 폴리옥시에틸렌-p-t-노닐페닐에테르 (상품명 「Triton N」시리즈, 시그마-알드리치사), 알킬폴리글루코사이드, 지방산 디에탄올아미드, 알킬모노글리세릴에테르 등을 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제는, 단독으로도 2 종 이상을 혼합해서도 사용할 수 있다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피용 전개액에는, 생물학적 친화성에 기초하는 부반응을 억제하거나, 비특이적 반응을 억제하는 것이 공지된 첨가제, 예를 들어, 항원 항체 반응의 촉진 혹은 비특이적 반응을 억제하기 위한 블로킹제로서 단백질 (예를 들어, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 카세인 등), 고분자 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 덱스트린 등), 이온성 계면 활성제 또는 폴리아니온 (예를 들어, 덱스트린황산, 헤파린, 폴리스티렌술폰산, 콘드로이틴황산 등), 혹은 항균제 등등의 1 종 혹은 2 종 이상을 첨가하여 사용하는 것도 가능하고 또한 유효하여 무방하다. 또, 이들 항원 항체 반응의 촉진 혹은 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질, 고분자 화합물, 이온성 계면 활성제 또는 폴리아니온, 혹은 항균제 등등의 1 종 혹은 2 종 이상을, 고정상 (固定相) 을 구성하는 크로마토그래피 매체 상의, 이동상 (移動相) 의 이동 경로 상에 유지시켜 두는 것도 가능한 동시에 유효하여 무방하다.

검체 중의 피검출 물질을 검출하기 위한 이뮤노크로마토그래피 장치는, 그 구조 및 그 동작ㆍ검출 수법은 공지되어 있다. 통상은, 시료 첨가 부위 (1), 표지 물질 유지 부위 (2), 크로마토그래피 매체 (3), 검출 부위 (4) (「판정부」라고도 한다), 흡수 부위 (5) 및 백킹 시트 (6) 로 구성되어 있다.

종래의 이뮤노크로마토그래피 장치의 샘플 패드 중으로, 전개액을 사용하여 미리 검체를 희석 처리하여 얻어진 검체 시료를 적하하여, 이뮤노크로마토그래피 매체 상을 흡수 부위의 방향으로 전개시켜, 항원 항체 반응에 의해 검체 중의 피검출 물질의 동정ㆍ정량 등의 검사를 할 수 있다.

이뮤노크로마토그래피 장치에 대하여, 이하에 설명을 한다.

시료 첨가 부위 (1) 는, 시료가 신속하게 흡수되지만, 유지력은 약하고, 신속하게 반응부로 시료가 이동해 갈 것 같은 성질의, 유리 여과지 등의 다공질 시트로 구성되어 있다.

표지 물질 유지 부위 (2) 에는, 표지 성분에 의해 시약 성분을 표지한 표지 시약을 유지시켜 이루어진다. 표지 성분으로는, 금속 콜로이드 입자, 라텍스 입자, 효소, 형광 화합물 등등이 있고, 그 중에서도 금속 콜로이드 입자가 최적이다. 본 발명의 청색 금 나노 입자의 콜로이드 입자는, 이 표지 성분으로서 사용된다. 시약 성분으로는, 분석물을 인식하는 능력을 갖는 입자 또는 분자이고, 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 혹은 그 프래그먼트이다 (제 2 시약).

크로마토그래피 매체 (3) 는, 막 담체 상에 검출 부위 (4) 를 작성한 것이다. 막 담체로는, 모세관 현상에 의해 시료 검체를 흡수하여 이동시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 이들의 혼합 섬유로 이루어지는 인공 폴리머로 이루어지는 군에서 선택된다.

검출 부위 (4) 에는, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 혹은 그 프래그먼트 (제 1 시약) 가, 니트로셀룰로오스의 시트 상에 담지 고정되어 있다.

흡수 부위 (5) 는, 과잉된 시료를 신속히 흡수하는 능력을 갖는 재료, 유리 여과지 등이 사용된다.

백킹 시트 (6) 는, 기재이다. 편면에 점착제를 도포하거나, 점착 테이프를 첩부 (貼付) 함으로써, 편면이 점착성을 갖고, 그 점착면 상에 시료 첨가 부위 (1), 표지 물질 유지 부위 (2), 크로마토그래피 매체 (3), 검출 부위 (4), 및 흡수 부위 (5) 의 일부 또는 전부가 밀착되어 형성되어 있다. 패킹 시트 (6) 는, 점착제에 의해 시료액에 대해 불투과성, 비투습성이 될 것 같은 것이라면, 기재로서는 특별히 한정되지 않는다.

검출 부위 (4) 에 사용하는 시약 성분 (제 1 시약) 및 표지 시약에 사용하는 시약 성분 (제 2 시약) 은, 그 일방 또는 양방이 모노클로날 항체여도 되고, 폴리클로날 항체여도 되지만, 표지 시약에 사용하는 시약 성분 (제 2 시약) 은, 측정 감도 등의 점에서 특이성이 높은 모노클로날 항체가 바람직하다. 검출 부위 (4) 에 사용하는 시약 성분 (제 1 시약) 으로는, 모노클로날 항체여도 되고 폴리클로날 항체여도 된다.

모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 혹은 그 프래그먼트는 공지되어 있어 입수 가능하고, 공지된 방법에 의해 조정할 수 있다. 항체 산생 동물종으로는, 인간, 마우스, 쥐, 토끼, 염소 등등이다. 면역 글로블린으로는, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 것이어도 된다.

모노클로날 항체는, 통상적인 방법에 따라, 항원 (예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스) 으로 면역한 마우스의 비장 세포와 골수종 세포를 하이브리드시켜, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 이 하이브리도마로부터 산생되어 오는 모노클로날 항체를 수득한다. 예를 들어, 쾰러와 밀스테인의 기법 (Nature 256 (1975) 495-497) 을 참조.

폴리클로날 항체는, 상투적인 수법에 의해, 항원 (예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스) 을 산생 동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 말 등) 에 면역시켜 얻은 항혈청 중으로부터 목적으로 하는 항체를 분리함으로써 얻어진다.

본 발명의 실시예에 있어서는, 표지 시약에 사용하는 시약 성분 (제 2 시약) 으로는, 마우스 유래 항인플루엔자 A 모노클로날 항체를 사용하고, 검출 부위 (4) 에 사용하는 시약 성분 (제 1 시약) 으로는, 마우스 유래 항인플루엔자 A 모노클로날 항체를 사용한 경우를 기재하고 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 마우스 유래 항인플루엔자 A 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있다.

판정의 원리를 개설하면,

1. 검체 시료 (검체를 전개액으로 희석 처리한 것) 를, 샘플 패드 (1) 상에, 소정량 (통상적으로, 0.1 ∼ 2 ㎖) 적하한다. 검체 시료가 적하되면, 검체 시료는 샘플 패드 (1) 에 신속하게 흡수되지만, 신속하게 시료와 함께 이동을 시작한다. 샘플 패드 (1) 중에 이뮤노크로마토그래피용 시약 조성물이 함침되어 있었던 경우에는, 함침되어 있었던 이뮤노크로마토그래피용 시약 조성물은, 검체 시료의 수분에 용해되어, 검체 시료와 함께 이동을 시작한다.

2. 검체 시료는, 먼저 표지 물질 유지 부위 (2) 로 이동한다. 여기를 검체 시료가 통과할 때, 표지 물질 유지 부위 (2) 에 유지되어 있던 표지 시약 (제 2 시약) 이 시료의 수분에 용해되어, 시료와 함께 이동한다.

3. 이어서, 검체 시료의 수분에 용해된 표지 시약은, 크로마토그래피 매체 (3) 상의 검출 부위 (4) 를 통과한다. 여기서는, 검체 시료 중에 용해되어 있는 이뮤노크로마토그래피용 시약 조성물에 의해 비특이적 결합 반응은 억제되어, 항원ㆍ항체의 특이적 결합 반응에 의해, 검체 시료 중에 피검출 물질 (예를 들어, 항원) 이 존재하는 경우에는, 검출 부위 (4) 에 담지 고정되어 있는 항체와 표지 시약에 의해 샌드위치상으로 사이에 위치하도록 하여 특이적으로 반응 결합하여, 검출 부위 (4) 가 착색된다. 검체 시료 중에 피검출 물질 (예를 들어, 항원) 이 존재하지 않는 경우에는, 시료의 수분에 용해된 표지 시약은, 크로마토그래피 매체 (3) 상의 검출 부위 (4) 를 통과해도 특이적 결합 반응이 일어나지 않기 때문에, 검출 부위 (4) 가 착색되지 않는다.

4. 마지막으로, 시료의 수분은, 흡수 부위 (5) 로 이동한다.

이와 같이, 검체 시료 중의 피검출 물질 (예를 들어, 항원) 의 유무를 정확하게 판정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(i) 평균 입자 직경의 측정

중력적 광산란법 (콜로이드 입자를, 졸상체인 채로 14000 ∼ 5530000×g 으로 회전시키는 초원심 분리기에 걸어, 그 침강 속도로부터 구한다) 에 의해 구할 수 있지만, 본 발명에서는, 동적 광산란 (DLS) 측정기 Zetasizer Nano ZS (제품명, 말번사 제조) 에 의해 평균 입자 직경을 산출한다. 또, 투과형 전자 현미경 (TEM：닛폰 전자 (주) 제조, JEM-2010) 에 의해, 촬영한 투영 사진을 사용하여 무작위로 100 개의 입자를 입자의 투영 면적 원 상당 직경을 계측하고, 그 평균값으로부터 평균 입경 (평균 입자 직경) 을 산출할 수도 있다. 또한, 평균 핵 직경도 마찬가지로 TEM 투영 사진을 사용하여 무작위로 100 개의 입자를 입자의 투영 면적 원 상당 직경에 의한 평균값으로부터 산출되고, 평균 돌기 길이 (그래프트의 평균 길이) 는, 상기 평균 입자 직경과 평균 핵 직경의 차분을 2 로 나눔으로써 산출된다.

[실시예 1]

이 실시예에서는, 핵 형성 단계에 있어서, 제 1 금염인 염화금산을 제 1 환원제인 HEPES 로 환원하여, 별사탕상의 핵 콜로이드를 형성하였다. 그 후, 성장 단계에서는, 제 2 금염인 염화금산과, 제 2 환원제인 L-아스코르브산을 동시에 적하하여 보다 사이즈가 큰 별사탕상의 금 콜로이드를 형성시켰다.

[핵 형성 단계]

10 ㎖ 의 뚜껑이 달린 유리 용기에, 4×10^-2 ㏖/ℓ HEPES pH 7.8 을 10 ㎖ 첨가하고, 액온 25 ℃ 가 될 때까지 항온조 내에서 유지하였다. 한편, 염화금산 4 수화물 0.7 g (1.6×10^-2 ㏖) 을 초순수 100 ㎖ 에 용해시키고, 액온 4 ℃ 가 될 때까지 얼음 상에서 유지하였다. HEPES 수용액, 염화금산 수용액 모두 액온이 안정되면, 염화금산 수용액 0.3 ㎖ 를 HEPES 수용액에 적하하고, 25 ℃ 항온조에 1 시간 정치 (靜置) 하였다. 이로써, 돌기를 포함한 평균 입자 직경이 43 ㎚ 정도의 거의 별사탕형, 그래프형 또는 멀티포트형 (돌기수 1 ∼ 8) 정도의 금 나노콜로이드 입자가 제조되었다. 콜로이드 용액의 단위 체적 (0.1 ㎖) 당 수율은 91 ％ 정도의 것이 되었다. 나머지는 진구상인 것, 미반응물 등인 것으로 추정할 수 있다.

[성장 단계]

상기 방법에 의해 형성한 금 농도 4.0×10^-4 ㏖/ℓ 의 핵 콜로이드 5 ㎖ 를, 500 ㎖ 의 3 구 플라스크에 넣고, 액온이 20 ℃ 가 될 때까지 항온조 내에서 교반하였다. 액온이 안정되면, 염화금산 4 수화물 1.5×10^-2 그램 (4.0×10^-5 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 염화금산 수용액과, L-아스코르브산 4.2×10^-2 g (2.4×10^-4 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 L-아스코르브산 수용액 116 ㎖ 를, 1.0 ㎖/min 의 속도로 동시에 적하하고, 2 시간 교반하면서 반응시켜, 성장 단계를 실시하였다. 적하 종료 후, 3 구 플라스크를 항온조로부터 꺼내, 냉장고에서 하룻밤 정치하였다. 얻어진 금 나노 입자는, 평균 입자 직경 (DLS) 약 66.5 ㎚ 정도, TEM 관찰에 의한 계측에서는, 평균 핵 직경이 약 35.7 ㎚ 정도이고, 평균 돌기는 13.2 ㎚, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 50 도 정도, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 청색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 5B 부근), 극대 흡수 파장은 610 ㎚ 였다.

[실시예 2]

이 실시예에서는, 보다 긴 돌기를 갖는 별사탕상의 금 콜로이드의 합성을 목적으로 하여 실시하였다.

실시예 1 의 핵 형성 단계에서 형성한 4.0×10^-4 ㏖/ℓ 의 핵 콜로이드 5 ㎖ 를, 500 ㎖ 의 3 구 플라스크에 넣고, 액온이 20 ℃ 가 될 때까지 항온조 내에서 교반하였다. 액온이 안정되면, 염화금산 4 수화물 1.5×10^-2 그램 (4.0×10^-5 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 염화금산 수용액과, L-아스코르브산 4.2×10^-2 그램 (2.4×10^-4 ㏖) 과 HEPES 0.11 g (4.0×10^-3 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 L-아스코르브산 HEPES 수용액 116 ㎖ 를, 1.0 ㎖/min 의 속도로 동시에 적하하고, 2 시간 교반하면서 반응시켜, 성장 단계를 실시하였다. 적하 종료 후, 3 구 플라스크를 항온조로부터 꺼내, 냉장고에서 하룻밤 정치하였다.

얻어진 금 나노 입자는, 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS) 약 98 ㎚ 정도, TEM 관찰에 의한 계측에서는, 보다 긴 돌기를 갖는 별사탕상의 금 콜로이드가 보다 많이 생성되어 있는 것으로 추정된다. 평균 핵 직경이 약 65.7 ㎚ 정도이고, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이는 약 16.7 ㎚ 정도, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 50 도 정도, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 청록색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 8BG 부근), 극대 흡수 파장은 641 ㎚ 였다.

[실시예 3]

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 액온을 10 ℃ 로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 금 콜로이드를 합성하였다. 얻어진 금 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장을 표 1 에 나타낸다.

실시예 1 의 핵 형성 단계에서 형성한 4.3×10^-4 ㏖/ℓ 의 핵 콜로이드 5 ㎖ 를, 500 ㎖ 의 3 구 플라스크에 넣고, 액온인 성장 온도를 10 ℃ 가 될 때까지 항온조 내에서 교반하였다. 액온이 안정되면, 염화금산 4 수화물 1.7×10^-2 그램 (4.2×10^-5 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 염화금산 수용액과, L-아스코르브산 4.2×10^-2 그램 (2.4×10^-4 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 L-아스코르브산 수용액 116 ㎖ 를, 1.0 ㎖/min 의 속도로 동시에 적하하고, 2 시간 교반하면서 반응시켜, 성장 단계를 실시하였다. 적하 종료 후, 3 구 플라스크를 항온조로부터 꺼내, 냉장고에서 하룻밤 정치하였다.

얻어진 금 나노 입자는, 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS) 이 약 67 ㎚ 정도, TEM 관찰에 의한 계측에서는, 평균 핵 직경이 51.0 ㎚ 이고, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이는 8.0 ㎚ 정도, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 50 도 정도, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 청색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 5PB 부근), 극대 흡수 파장은 587 ㎚ 였다.

[실시예 4]

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 액온을 30 ℃ 로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 거의 별사탕형, 그래프형 또는 멀티포트형 (돌기수 2 ∼ 4) 정도의 3 차원상 돌기를 갖는 금 콜로이드 나노 입자를 합성하였다.

얻어진 금 나노 입자는, 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS) 60.5 ㎚ 정도, TEM 관찰에 의한 계측에서는, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이는 7.5 ㎚ 정도, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 50 도 정도, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장은 586.5 ㎚ 였다.

결과를 표 1 에 나타낸다.

[비교예 1]

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 액온을 40 ℃ 로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 금 콜로이드를 합성하였다. 얻어진 금 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장을 표 1 에 나타낸다.

성장 단계의 온도를 40 ℃ 로 한 것이고, 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS) 약 53 ㎚ 정도, TEM 관찰에 의한 계측에서는, 평균 핵 직경이 45 ㎚ 이고, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이는 4 ㎚ 정도, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 10 도 정도인 것이 생성되었다. 멀티포트형 (돌기수 2 ∼ 4) 의 3 차원상 돌기가 약간 둥그스러운 금 콜로이드 입자가 제조되었다. 나머지는 진구상인 것, 미반응물 등인 것으로 추정할 수 있다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 적색미를 띠고 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 10RP 부근), 극대 흡수 파장이 530 ㎚ 였다.

[비교예 2]

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 아스코르브산의 양을 2.1×10^-2 그램 (1.2×10^-4 ㏖) 으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 금 콜로이드를 합성하였다. 얻어진 금 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장을 표 1 에 나타낸다.

실시예 1 의 핵 형성 단계에서 형성한 4.3×10^-4 ㏖/ℓ 의 핵 콜로이드 5 ㎖ 를, 500 ㎖ 의 3 구 플라스크에 넣고, 액온인 성장 온도가 30 ℃ 가 될 때까지 항온조 내에서 교반하였다. 액온이 안정되면, 염화금산 4 수화물 1.7×10^-2 g (4.2×10^-5 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 염화금산 수용액과, L-아스코르브산 2.1×10^-2 그램 (1.2×10^-4 ㏖) 을 초순수 116 ㎖ 에 용해시킨 L-아스코르브산 수용액 116 ㎖ 를, 1.0 ㎖/min 의 속도로 동시에 적하하고, 2 시간 교반하면서 반응시켜, 성장 단계를 실시하였다. 적하 종료 후, 3 구 플라스크를 항온조로부터 꺼내, 냉장고에서 하룻밤 정치하였다.

얻어진 금 나노 입자는, 돌기를 포함한 평균 입자 직경이 약 48 ㎚ 정도인 것이 생성되었다.

얻어진 금 콜로이드의 용액은, 극대 흡수 파장은 536.3 ㎚ 으로 적색미를 띤 것이었다.

[비교예 3]

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 아스코르브산의 양을 8.4×10^-2 그램 (4.8×10^-4 ㏖) 으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 금 콜로이드를 합성하였다. 얻어진 금 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장을 표 1 에 나타낸다.

성장 단계 온도 30 ℃ 로 한 것이고, 핵 평균 직경이 60.2 ㎚, 평균 입자 직경이 70.2 ㎚ 였다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 극대 흡수 파장이 550.0 ㎚ 로 주황색미를 띤 것이었다.

[실시예 5]

실시예 2 의 HEPES 대신에 HEPPSO 를 사용한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여, 평균 입자 직경이 약 72 ㎚ 인 금 콜로이드 입자를 제작하였다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 청색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 1B 부근) 을 나타내고, 극대 흡수 파장은 632 ㎚ 였다.

[실시예 6]

실시예 2 의 HEPES 대신에 PIPES 를 사용한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여, 평균 입자 직경이 약 81 ㎚ 인 금 콜로이드 입자를 제작하였다. 얻어진 금 콜로이드의 용액은, 청색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 3B 부근) 을 나타내고, 극대 흡수 파장은 626 ㎚ 였다.

[실시예 7]

실시예 2 에 있어서, 성장 단계에서 사용되는 아스코르브산 대신에 L-아스코르브산 Na 를 4.7×10^-2 그램 (2.4×10^-4 ㏖) 사용하고, HEPES 의 양을 0.22 g (8.0×10^-3 ㏖) 사용한 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 하여, 금 콜로이드 용액을 합성하였다.

얻어진 금 콜로이드 입자의 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS) 은 약 82 ㎚ 정도, 평균 핵 직경이 약 48 ㎚ 정도이고, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이는 약 20 ㎚ 정도, 돌기수 평균 4 개 이상, 돌기각 50 도 정도, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드 용액은, 감색 (육안에 의한 먼셀 표색계 측색값：색상 5PB 부근), 극대 흡수 파장은 752 ㎚ 라는 약간 높은 파장의 것이 된다.

이상의 실시예 1 ∼ 7 및 비교예 1 ∼ 3 의 측정 결과를 표 1 에 정리하여 표시한다.

도면 중의 LAANa 는, L-아스코르브산을 나타낸다.

실시예 1 에 있어서, 성장 단계의 아스코르브산 대신에 시트르산을 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 금 콜로이드 용액을 합성하였다.

얻어진 금 콜로이드 입자의 돌기를 포함한 평균 입자 직경 (DLS), 평균 핵 직경은 동등 정도이고, 성장한 돌기 (그래프트) 의 평균 길이, 평균 돌기수, 돌기 각도는 동등 정도이며, AR 은 1 이상인 것이 생성되었다. 얻어진 금 콜로이드 용액은 각 실시예의 것과 동등 정도의 것이 얻어졌다. 이로써, 본 발명의 성장 단계에서 사용하는 제 2 환원제로서는, 환원성을 갖는 유기산, 예를 들어, 아스코르브산 및 그 유도체, 또는 시트르산 및 그 유도체, 이것 이외의 유기산에 대해서도 사용하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 예를 들어, D(L)-말산, D(L)-타르타르산, 락트산, 타닌산, 환원당 등을 사용하여 실시하면, 생성되는 금 콜로이드 용액에는 약간의 차이가 있지만, 일단 본 발명의 목적으로 하는 소정의 범위 내의 특성을 갖는 것을 제조할 수 있을 것으로 추찰되고, 그들 각 산의 무기 또는 유기염을 사용하여, 상기 실시예 7 등의 방법에 따라 실시하면, 소정의 금 콜로이드 용액을 수득할 수 있다.

이하, 본 발명의 유효성을 실험예를 들어 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

＜이뮤노크로마토그래프에 의한 바이러스 검출의 실험예＞

[실시예 8]

1. 크로마토그래프 매체 상으로의 반응 부위의 제작

니트로셀룰로오스막 (밀리포어사 제조：HF120) 에, 항체 도포기 (BioDot 사 제조) 를 사용하여, 5 중량％ 의 이소프로필알코올을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 으로 1.0 ㎎/㎖ 의 농도가 되도록 희석시킨 항인플루엔자 바이러스 A 모노클로날 항체를 전개 방향 상류측 (표 2：라인 1) 에, 항인플루엔자 바이러스 B 모노클로날 항체를 상기 항인플루엔자 A 모노클로날 항체의 하류측 (표 2：라인 2) 에 도포하고, 50 ℃ 에서 30 분간 건조시켰다. 건조 후, 실온에서 하룻밤 건조시켜, 크로마토그래프 매체 상에 반응 부위를 제작하였다.

2. 표지 물질 용액 1 의 제작

상기 실시예 1 에서 제작된 청색 금 콜로이드 현탁액 0.5 ㎖ 에, 인산 완충액 (pH 7.4) 으로 0.1 ㎎/㎖ 의 농도가 되도록 희석시킨 항인플루엔자 바이러스 B 모노클로날 항체를 0.1 ㎖ 첨가하고, 실온에서 10 분간 정치하였다. 이어서, 10 중량％ 의 소 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 을 0.1 ㎖ 첨가하고, 충분히 교반한 후, 8000×g 으로 15 분간 원심 분리를 실시하였다. 상청을 제거한 후, 1 중량％ 의 소 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 0.1 ㎖ 를 첨가하여, 표지 물질 용액 1 로 하였다.

3. 표지 물질 용액 2 의 제작

금 콜로이드 현탁액 LC-40 (다나카 귀금속 공업사 제조：평균 입자 직경 40 ㎚) 0.5 ㎖ 에, 인산 완충액 (pH 7.4) 으로 0.1 ㎎/㎖ 의 농도가 되도록 희석시킨 항인플루엔자 바이러스 A 모노클로날 항체를 0.1 ㎖ 첨가하고, 실온에서 10 분간 정치하였다. 이어서, 10 중량％ 의 소 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 을 0.1 ㎖ 첨가하고, 충분히 교반한 후, 8000×g 으로 15 분간 원심 분리를 실시하였다. 상청을 제거한 후, 1 중량％ 의 소 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 0.1 ㎖ 를 첨가하여, 표지 물질 용액 2 로 하였다.

4. 크로마토그래프 매체의 제작

상기 제작한 표지 물질 용액 1 및 2 를 글라스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시켜, 검출 시약 유지 부재로 하였다. 이어서, 패킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기 조제한 크로마토그래프 매체, 검출 시약 유지 부재, 시료를 첨가하는 부분에 사용하는 샘플 패드, 및 전개한 시료, 불용성 담체를 흡수하기 위한 흡수 패드를 첩합 (貼合) 시켰다. 마지막으로, 재단기로 폭이 5 ㎜ 가 되도록 재단하여, 크로마토그래프 매체를 제작하였다.

5. 측정

상기 제작한 크로마토그래프 매체를 사용하여, 이하의 방법으로 시료 중의 인플루엔자 바이러스 A (표 2：항원 A) 및 인플루엔자 바이러스 B (표 2：항원 B) 의 유무를 측정하였다. 즉, 0.5 ％ Tween 20, 0.6 ％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP) K-90 (분자량 36만), 1.0 ％ 소 혈청 알부민과 150 mM 염화나트륨을 함유하는 트리스 완충 용액 (pH 8.0) 으로 이루어지는 전개액을 음성 검체 시료로 하고, 여기에 불활화 처리한 단백 농도가 각각 25 ng/㎖ 인 인플루엔자 바이러스 A 및/또는 인플루엔자 바이러스 B 를 첨가한 것을 양성 검체 시료로 하고, 각각 150 ㎕ 를 크로마토그래프 매체의 샘플 패드 상에 올려 전개시켜, 15 분 후에 육안 판정을 하였다. 반응 부위에 있어서의 테스트 라인 (라인 1 및 2) 의 발색 시그널을 명확하게 확인할 수 있는 것을 「＋」, 발색 시그널은 확인할 수 있지만, 매우 색이 옅은 것을 「±」, 발색 시그널을 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다. 실시예 5 의 결과를 표 2 에 나타낸다.

본 발명의 별사탕상의 금 콜로이드 입자를, 종래부터 범용되고 있는 금속 콜로이드 입자, 예를 들어, 구상의 금 콜로이드 입자와 조합하여 면역학적 측정, 특히 이뮤노크로마토그래피 측정용 표지제로서 사용함으로써, 생체 시료 중에 포함되는 다른 피검출 물질을 각각의 반응 부위에 있어서의 테스트 라인 (라인 1 및 2) 의 다른 발색 시그널로서, 명확하고 또한 고감도로, 오인하지 않고 검출할 수 있었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 금 콜로이드 입자는, 청색으로서, 보호 콜로이드 형성제나 암모늄염 등을 함유하지 않기 때문에 독성이 없고, 금이 건강에 좋기 때문에, 안료나, 화장품, 면역학적 측정용 표지제, 세포 화학적 마커, 단백질 염색제로서 이용이 가능하다. 특히, 면역학적 측정용 표지제로서, 2 개 이상의 발색 라인을 갖는 이뮤노크로마토그래피 시험에 있어서,

1) 상기 금 콜로이드 입자의 구상의 핵에 4 ∼ 20 개의 돌기가 형성되어 있는 것

2) 상기 금 콜로이드 입자의 평균 입자 직경이 20 ∼ 200 ㎚ 인 것

을 특징으로 하는 육안의 청색에 의해 검출 대상물을 표지하여 식별하기 위한 금 콜로이드 입자를 이용하는 것이 가능하다.

본 발명을 상세하게 또한 특정 실시양태를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 정신과 범위를 일탈하지 않고 여러 가지 변경이나 수정을 가할 수 있다는 것은 당업자에게 있어 분명하다.

본 출원은 2010년 11월 5일에 출원된 일본 특허출원 (일본 특허출원 2010-248463호) 에 기초하는 것으로서, 그 내용은 여기에 참조로서 도입된다. 모든 인용되는 참조는 내용으로서 도입된다.

Claims (15)

1. 평균 입자 핵 사이즈가 20 ∼ 60 ㎚, 평균 입자 직경이 50 ∼ 120 ㎚ 의 범위에 포함되고, 돌기수가 핵 1 개에 대하여 4 개 이상 존재하며, 이 돌기부의 길이는 5 ∼ 50 ㎚ 인 금 나노 입자로 구성되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자.
2. 제 1 항에 있어서,
   자외 가시 흡수 스펙트럼의 극대 흡수 파장이 570 ∼ 800 ㎚ 의 범위인 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자.
3. 제 1 항에 있어서,
   입자의 형태가 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원 돌기부를 갖는 금 나노 입자인 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자.
4. 제 1 항에 있어서,
   금 나노 입자로 이루어지는 핵의 외주를 성장시킴으로써 형성되어 이루어지는 청색 금 나노 입자.
5. 제 1 항에 기재된 청색 금 나노 입자, 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산, 및 환원성을 갖는 유기산으로 이루어지고, 콜로이드 용액으로서 분산되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 콜로이드 용액.
6. 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산과 제 1 금염의 용액을 반응시켜 핵 금 나노 입자를 형성시키는 핵 형성 공정과, 이어서 그 핵 금 나노 입자의 용액에 제 2 금염의 용액과 환원성을 갖는 유기산을 동시적으로 첨가 반응시켜, 핵 금 나노 입자를 성장시키는 성장 공정의 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   성장 공정의 반응 온도를 10 ℃ 이상 40 ℃ 미만에서 실시하는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
   성장 공정에 있어서의 유기산의 농도가 0.075 ∼ 0.15 mM 인 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산이, 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판-3-술폰산), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 및 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판술폰산) 으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
10. 제 6 항에 있어서,
    환원성을 갖는 유기산이, 타르타르산, 타르타르산염, 타닌산, 타닌산염, 아스코르브산, 아스코르브산염, 시트르산 및 시트르산염으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
11. 제 6 항에 있어서,
    성장 공정에 있어서, 환원성을 갖는 유기산과 함께 굿 버퍼 성분의 피페라진 고리를 갖는 유기산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 청색 금 나노 입자의 제조 방법.
12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 청색 금 나노 입자를 포함하는, 면역학적 측정용 표지 물질.
13. 제 12 항에 있어서,
    형상이 상이한 적어도 2 종류의 금 나노 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정용 표지 물질.
14. 제 13 항에 있어서,
    구상의 금 나노 입자와 그래프트형, 멀티포트형, 또는 별사탕형의 3 차원 돌기를 갖는 금 나노 입자의 적어도 2 종류로 구성되는, 면역학적 측정용 표지 물질.
15. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 청색 금 나노 입자를 표지 물질로서 사용하는, 면역학적 측정 방법.

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